Введение к работе
1.1. Актуальность темы.
Природные и синтетические фиторегуляторы являются мощнейшим средством управления онтогенезом растений, они находят широкое применение в биотехнологии сельскохозяйственных растений и практическом растениеводстве. Фиторегуляторы - важное средство регулирования темпов роста и развития растений, их продуктивности и качества урожая (Чайлахян 1982). В современном растениеводстве фиторегуляторы применяются также для повышения устойчивости агроценозов к неблагоприятным факторам внешней среды и позволяют существенно облегчить ряд технологических операций (Муромцев и др. 1987, Кораблева 1990).
К настоящему времени известно (Кефели 1987, Кулаевэ 1994, Деева 1995, Якушкина 1995, Jackson 1993), что экзогенные фиторегуляторы воздействуют на растения путем изменения в них уровня и соотношения эндогенных фитогормонов. В этой связи, для их эффективного применения требуется детальное знание исходного соотношения фитогормонов и методов управления этим гормональным равновесием (балансом). На этой основе создается возможность применять регуляторы' роста и развития растений в целях значительного и с минимальными потерями повышения продуктивности сельскохозяйственных растений и качества сельскохозяйственной продукции.
Гормональная система растений является одной из главных составляющих регуляторных механизмов, обеспечивающих согласованное функционирование клеток, тканей, органов и растений в целом. Фитогормоны выполняют также регуляторную функцию в процессах покоя, старения, поглощения и транспорта веществ, а также адаптации растений к внешним воздействиям.
Понятие гормонального баланса включает в себя динамику изменения состава и соотношения фитогормонов в онтогенезе. Соотношение эндогенных гормонов в растении постоянно менязтся, при этом фитогормоны находятся в динамическом равновесии, поддерживаемым как за счет их транспорта (Trewavas 1983, Canny 1985), так и за счет взаимопревращения свободных и связанных форм (Кудоярова 1996, Bandurski 1979, 1991). Характерной особенностью этого равновесия является его чрезвычайная подвижность и чувствительность к внешним воздействиям. Анализ литературных данных показал, что на содержание фитогормонов могут в частности влиять такие внешние факторы как температура окружающей среды (Полевой В.В. и Полевой А.В. 1992), влажность воздуха (Lopez-Carbonell е.а. 1993) и почвы (Якушкина и Бахтенко 1991, El-Jaafari, о.а. 1993), освещенность (Potter & Rood 1993), промышленные загрязнения (Srivastava 1985), химические препараты (фиторегуляторов, гербициды), электромагнитное излучение (Ковалев 1995), механическиэ повреждения растений (Grochowska о.а. 1984), повреждения растений вредителями и болезнями
(Кислин 1991,1993). Таким образом, практически любое внешнее воздействие приводит к изменению соотношения эндогенных фитогормонов в растении. Увеличивая или сокращая биосинтез отдельных фитогормонов растение адаптируется к внешнему воздействию. При этом соотношение фитогормонов может изменяться очень быстро, и эти изменения удается зафиксировать уже через час после воздействия на растение (Kende е.а. 1992)., а иногда и раньше (Kudoyarova е.а. 1990). Существенным недостатком этих' работ является то, что в них изучалось, как правило, изменение концентрации одного, реже двух гормонов и определенную трудность представляет сопоставление разрозненных данных полученных разными авторами. В то же время, рядом авторов показано, что внешние воздействия могут изменять концентрации отдельных фитогормонов. Хорошо известны обширные литературные данные о взаимовлиянии гормонов в растениях, однако, об участии гормона в регуляторных процессах большинство авторов судят на основании изменений под влиянием экзогенных внесений и в меньшей степени по его эндогенному содержанию.
В литературе имеется обширный материал по.качественному и количественному анализу эндогенных фитогормонов (Мазин 1977, Кефели и Кислин, 1982, Crozier & Durley 1989, Hedden 1993). Однако, в подавляющем большинстве работ авторы анализируют лишь одну, реже две группы фитогормонов. Работы, в которых количественно изучали три группы фитогормонов, очень редки (Кудоярова, 1996), и ни в одной работе не описано одновременное определение гиббереллиновых (ГК), абсцизовой (АБК), ин-долилуксусной (ИУК) кислот, цитокининов и этилена.
Поэтому исследование полного гормонального баланса растения в одном эксперименте особенно актуально, для чего необходимо создать комплексную методику, позволяющую анализировать полный гормональный баланс в каждой пробе растительного материала. Детальный анализ соотношения фитогормонов создает предпосылки для разработки методов управления с помощью фиторегуляторов гормональным балансом для целей практического растениеводства и создания эффективных технологий хранения сельскохозяйственной продукции.
1.2. Цель и задачи исследований.
Основная цель работы состоит в разработке методов изучения . (контроля) и регулирования (управления) гормонального баланса растений для повышения их продуктивности и устойчивости к неблагоприятным факторам внешней среды, а также снижения потерь при хранении сельскохозяйственной продукции.
В процессе достижения поставленной цели решались следующие задачи:
а) разработка комплексной высокопроизводительной методики анализа фитогормонов в одной навеске растительного материала;
.1
б) апробация разработанной Методики определения фитогормонов на
различных растениях (ячмень, картофель, пшеница, мята, наперстянка,
дайкон, стахис, кормовая свекла, виноград, яблоня);
в) изучение характера взаимосвязи и взаимовлияния фитогормонов в
растениях;
г) исследование изменения фитогормонального баланса при введе
нии предшественников фитогормонов в биосинтезе;
д) изучение динамики фитогормонов в онтогенезе ярового ячменя и
кормовой свеклы;
е) изучение суточной динамики фитогормонального баланса растений
ячменя;
ж) сопоставление фитогормонального баланса и процессов формиро
вания вторичных метаболитов в лекарственных растениях;
з) разработка принципов регулирования гормонального баланса
растений для повышения урожайности и качества сельскохозяйственной
продукции и снижения потерь при хранении;
и) обоснование возможности применения гормональных тестов при селекционном отборе высокопродуктивных и устойчивых форм и сортов растений уже на ранних этапах онтогенеза.
1.3. Защищаемые положения
-
Теоретическое обоснование роли гормонального баланса растений и основы его формирования.
-
Принципы применения экзогенной регуляции гормонального баланса растений как для решения конкретных задач повышения продуктивности, устойчивости растений к неблагоприятным факторам внешней среды и снижения потерь при хранении, так и для целей селекции.
3. Комплексный метод анализа гормонов растений, позволяющий
определить качественный и количественный состав пяти групп фитогормо
нов (гиббереллины, абсцизовая и индолилуксусная кислоты, цитокинины,
этилен) в одной, сравнительно небольшой (до 50 г сырой массы) пробе.
1.4. Научная новизна.
Разработана комплексная высокопроизводительная и универсальная методика анализа фитогормонов. Проведенные с ее использованием многолетние исследования позволили выявить основные принципы формирования и сформулировать критерии экзогенного управления гормональным балансом растений. Эти критерии были апробированы для решения конкретных практических задач, таких как подавление "цветушности" дайкона, стимуляции продуктивности бессемянных сортов винограда, активации вторичного метаболизма у лекарственных растений, повышение продуктивности сельскохозяйственных растений и их устойчивости к неблагоприятным факторам внешней среды, а также получению более качественной сельскохозяйственной продукции и снижению потерь при ее хранении.
Впервые быЛа детально изучена, суточная динамика фитогормоно-нального баланса ячменя и онтогенетическая динамика фитогормонов ячменя и свеклы.
Путем введения в растение мевалоновой кислоты впервые изучено влияние этого предшественника в биосинтезе фитогормонов на гормональный баланс растений.
На примере лекарственных растений (мята, наперстянка) впервые продемонстрирована тесная взаимосвязь гормонального баланса растений и формированием пула вторичных метаболитов.
Выявлены различия в сортовой отзывчивости ячменя связанные с гормональным балансом.
7.5. Использование результатов исследований.
Метод гормонального баланса был использован при создании технологии выращивания дайкона (ВНИИССОК, 1993-1995 гг.), хранения клубней стахиса, применении регуляторов роста для стимуляции биосинтеза биологически-активных веществ в лекарственных растениях (наперстянка, мята), увеличении выхода эргоалкалоидов из спорыньи (ВИЛАР, 1993-1995 гг.).
Результаты исследований использованы НПО "Прогноз" (г. Тула)"и ГОСНИИАС при разработке образцов генератора электромагнитных излучений для применения в индивидуальных и фермерских хозяйстеах.
Материалы по влиянию регуляторов роста на гормональный статус растений и их продуктивность используются в лекциях для студентов и включены в учебное пособие "Сельскохозяйственная биотехнология"..
1.6. Апробация результатов исследований.
Основные результаты исследований по теме диссертации докладывались и обсуждались на международных конференциях Plant metabolism regulation (Варна 1990), 8-th Congress of plant physiology (Антверптен 1992.), Регуляторы роста растений (Москва 1991,1993, 1995), Новые и нетрадиционные растений (Пущино 1995), Физиология и биохимия этилена (Пущино 1995), Эффективность регуляторов роста (Краснодар 1990), Методы комплексной оценки продуктивности растений (Лесной городок 1994), симпозиумах по брассиностероидам (Минск 1991, 1993, 1995), втором съезде физиологов растений Белоруссии (Минск 1995), ежегодных научных конференциях ТСХА (Москва 1993, 1994, 1995), втором ежегодном симпозиуме "Физико-химические основы физиологии растений (Пенза 1996), совещании по применению физиологических методов в селекции и растениеводстве (Немчиновка 1994), втором совещании по пестицидам (Черноголовка 1990), конференциях по совершенствованию преподавания физиологии растений (Смоленск 1993, Орел 1994), конференции по регуляторам роста (Киев 1992), второй межвузовской конференции по влиянию физических и химических факторов на рост и развитие сельскохозяйственных культур (Орехово-Зуево 1996).
1.7. Публикации результатов исследований.
Автором опубликовано 138 печатных работ, в том числе по теме диссертации 54 работы, включая брошюру "Регуляторы роста растений" (коллектив авторов) и монографию "Физиологические основы селекции" (коллектив авторов), получено два патента.
Автор благодарит сотрудников Лаборатории регуляторов роста и развитая сельскохозяйственных растений ТСХА к.б.н. И.В.Скоробогатову, к.б.н. Н.П.Карсункину, Г.Л.Соркину, А.Г.Сиушеву, Е.И.Сальникову, Т.А.Козик, к.с/х.н. С.И.Слепичева, Б.Е.Бумажного, Л.И.Бойценюка, д.б.н. В.М.Ковалева за помощь в проведении экспериментальных исследований.
Особую признательность автор выражает д.б.н., академику РАСХН В.С.Шевелухе за постоянное внимание и поддержку работы.
Автору хочется помянуть добрым словом покойного И.К.Блиновского, бывшего руководителя Лаборатории регуляторов роста и развития сельскохозяйственных растений некоторые идеи которого реализованы в настоящей работе.
2.7. Объекты исследований
-
Яровой ячмень (Hordeum vulgare L): сорта Зазерский 85, Носовский 9, Московский 3, Донецкий 8, Волгарь, Ноктюрн, Омский 86, Целинный 213.
-
Озимая пшеница (Triticum durum Desf.): сорт Мироновская 808.
-
Картофель (Solanum tuberosum 1.): сорт Невский.
-
Мята перечная (Mentha arvensis L): сорта Москвичка, Лекарственная 4, Медичка, Прилукская 6.
-
Наперстянка шерстистая (Digitalis lanata Ehrh.) и наперстянка пурпуровая (Digitalis purpurea L).
-
Дайкон (Raphanus sativus L. var. longipinnatus Bailey): сорта Клык слона, Дракон, Spring Teller.
-
Стахис (Stachys sieboldii Miq.): сорта Ракушка.
-
Яблоня (Malus domestica Borkh.): сорта Антоновка обыкновенная, Уэлси.
-
Виноград (Vitis vinifera L): сорта Хусайне и Кишмиш черный.
10. Кормовая свекла (Beta vulgaris L): сорта Эккендорфская желтая.
2.2. Методы исследований
Лабораторные и полевые и опыты проводили в 1988 - 1995 гг. Полевые опыты с картофелем, яровым ячменем и озимой пшеницей выполнены в учхозе "Михайловское", со стахпсом и дайконом - во ВНИИССОКе, с кормовой свеклой и яблоней в ТСХА, с лекарственными растениями в ВИЛА-Ре. Почвы полей - дерновоподзолистые, среднесуглинистые, уровень естественного плодородия средний. Повторность опытов 4-х кратная, размещение делянок рендомизированное, площадь опытных делянок 25 м . Опыты
на винограде проводили в НПО "Дагагровинпром" на плодоносящих виноградниках. Культура винограда привитая, орошаемая, неукрывная. Схема посадки 4x2 м, система ведения кустов трехпроволочная вертикальная шпалера, форма кустов - двуплечий кордон на высоком штамбе. В течение вегетации проводились агротехнические мероприятия согласно общепринятой технологии выращивания этих культур. Учеты проводили весовым методом отбора проб, непосредственно перед уборкой в сроки соответствующие данным культурам. Обработку растений фиторегуляторами проводили путем опрыскивания. Контрольные растения опрыскивались водой. Вегетационные опыты проводились на базе Лаборатории регуляторов роста и развития сельскохозяйственных растений Отдела сельскохозяйственной биотехнологии ТСХА, (Москва). Вегетационные опыты проводили в сосудах Митчерлиха объемом 6 л. Субстратом служила дерново-подзолистая почва, перемешанную с равным количеством торфа. Комплексное удобрение вносили в количестве 6 г на сосуд (N 20%, Р205 37%, К20 12%). В течение всего вегетационного периода влажность почвы поддерживалась весовым методом на уровне (60-70% от ПВ). В каждом сосуде выращивали 10 растений злаков и по одному растению картофеля или наперстянки. Образцы для определения фитогормонов отбирали во всех опытах в одно и тоже время (10 часов утра). Определение качественного и количественного содержания фитогормонов проводилось в одной навеске растительного материала.
Исследования по хранению клубней стахиса проводили в хранилище ВНИИССОКа. Клубни хранили 8 месяцев при температуре 2-4 С и при относительной влажности воздуха 85-90 % (Коненков и др., 1992 г.).
Анализ фитогормоиов (гиббереллины, абсцизовая кислота, индоли-луксусная кислота, цитокинины, этилен) выполнен по оригинальной методике, позволяющей анализировать большое количество проб. Химические анализы проводили в 3-4 повторностях для не менее, чем трех биологических проб. Ошибка методов определения фитогормонов во всех случаях не превышала 20 %. Фиксацию и хранение образцов для определения фитогормонов осуществляли охлажденным 80% метанолом.
Для проведения препаративной жидкостной хроматографии гиббе-реллинов сухой остаток растворяли в 3 мл начальной подвижной фазы и по 1 мл этого раствора вводили в инжектор жидкостного хроматографа фирмы "Biotronic" (ФРГ). В качестве неподвижной фазы использовали Lichrosorb ODC-18. той же фирмы. Хроматографирование проводили на препаративной колонке 12,5x0.8 см в градиентном режиме, используя в качестве начальной подвижной фазы смесь воды, ацетонитрила и уксусной кислоты (160:40:1) с постепенным добавлением смеси ацетонитрила. и уксусной кислоты (200:1). Скорость подачи подвижной фазы 2 мл/мин. Фракции, содержащие гиббереллины, упаривали, обрабатывали диазометаном и сили-лирующим агентом (раствор BSTFA в ацетонитриле) и анализировались методом ГЖХ-МС.
ГЖХ-МС исследование гиббереллинов (ГК) и абсцизовой кислоты (АБК) проводили на приборе Kratos MS-25-RFA. Режим работы масс-спектрометра стандартный: ионизирующее напряжение 50 эВ, ток эмиссии катода 400 мкА, ускоряющее напряжение 4 кВ, температура источника 250 С. Хроматографирование проводили на капиллярной колонке CP-SIL 8 СВ -25 ,м, внутренний диаметр 0,32 мм. Программа температур 120 С -> 10 град/мин -> 210 С (1 мин.) -+ 5 град/мин -* 250 С (5 мин.) -+ 45 град/мин -» 270 С. Температура инжектора 220 С. Газ-носитель - Не.
ВЭЖХ цитокининов проводили на приборах НРР-5001 (Чехия) и Beckman (Австрия). Условия хроматографирования: колонка фирмы Waters длиной 15 и диаметром 0,4 см, размер частиц 5 мм, заполненная "Ultrasphere С-18". Элюэнт - 50%-ный водный метанол, детектирование проводили при Х=254 нм, давление 1,0-1,3 кРа. Времена удерживания и площади пиков соединений, выходящих из колонки определялись автоматически с помощью интегратора CR-6A (Shimadzu). Для ВЭЖХ АБК использовали жидкостной хроматограф фирмы "Biotronic". Хроматографирование проводили на колонке размером 8x50 мм, заполненной поливинилпиролли-доном (0,47 г, Polyclar AT), с УФ-детектором (Хв„,лит=254нм). В качестве элюэнта применяли смесь вода-этилацетат-метанол-уксусная кислота (250:15:12:4), скорость элюции 1 мл/мин.
Для определения интенсивности выделения этилена свежие растительные образцы массой 40-50 г помещали в герметичные стеклянные емкости с пробками из самоуплотняющейся резины и выдерживали в темном месте 4 часа при комнатной температуре, затем шприцем отбирали пробы газовой среды для определение этипена методом ГЖХ. Усповия хроматографирования следующие: хроматограф "Carlo Erba 5300", колонка - 1200x3 мм, сорбент - "Хромосорб 107" (80-100-меш), газ-носитель азот с давлением на входе колонки 1 атм., детектор пламенно-ионизационный, расход водорода - 40 мл/мин., температура испарителя и колонки - 60 С, температура детектора -100 С, время удерживания этилена - 2 мин.
Состав эфирных масел мяты изучали методом ГЖХ и ГЖХ-МС по методике разработанной доц. Л.Б.Дмитриевым (ТСХА). Содержание сердечных гликозидов анализировали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ), используя ппастинки фирмы Merck и денситометр Shimadzu DR-2 (Япония). Окрашивающий реагент - раствор ксантгидрола.
Иммуноферментный анализ (ИФА) АБК, индолилуксусной кислоты (ИУК) и зеатина/зеатинрибозида проводили в лунках полистирольного планшета. На первом этапе конъюгат гормона сорбировали на твердой фазе в течение 1,5 часов при температуре 37С. После трехкратной промывки физиологическим раствором, содержащим 0,05 % твина-20, в лунки вносили антисыворотку к гормону, разведенную физиологическим раствором, содержащим 0,5 % бычьего сывороточного альбумина и 0,05 % твина-20, вместе с раствором стандарта гормона или растительным экстрактом. После инкубации- (1 час 37С) количество антител, специфически связан-
ных на планшете, определяли с помощью бараньих антител против иммуноглобулинов кролика, меченых пероксидазой. Для оценки активности пе-роксидазы использовали смесь следующего состава: 0.4 мг/мл орто-фенилендиамина в 0,06 М фосфатно-цитратном буфере рН 5,3, содержащем 0,006 % перекиси водорода. Оптическую плотность раствора после фиксации серной кислотой измеряли на автоматическом сканере Behring EL 311 (ФРГ). Для работы использовали наборы фирмы Idetek (США) и Института биологии Уфимского научного центра РАН.
При проведении аналитических работ использовали следующие вещества стандарты; зеатин (Z), зеатин-рибозид (ZR), дигидрозеатин (DHZ), дигидрозеатинрибозид (DHZR), изопентениладенин (IPA), гибберелловую (A3), абсцизовую и индолилуксусную кислоты и глюкозу производства фирмы Serva.
При разработке методики и изучении транспорта фитогормонов применялись изотопномеченные по углероду препараты A3, АБК, ИУК производства фирмы Amersham (Великобритания). Активность измеряли на счетчике Mark-2 или Rack Beta Spectral 1219 (фирма "LKB Wallac", Швеция) и выражали в распадах за минуту, используя стандартные кривые гашения.
Экспериментальные данные статистически обработывались с использованием программ Statgraf и Excel.
2.3. Условия проведения опытов.
1988 г. отличался низкими температурами в мае - начале июня и избыточным наличием осадков в начале вегетации, хотя в дальнейшем погодные условия были достаточно благоприятными для роста и развития растений. В 1989 году в течение всего вегетационного периода температура и влажность были нестабильными. Влажность почвы и воздуха в начале вегетации была низкой, во второй половине вегетации высокая температура днем (30 С) сменялась резкими похолоданиями в ночное время (до 18 С), выпадали обильные грозовые осадки. Подобные резкие колебания температуры и значительные осадки отмечались до конца вегетации. Метеоусловия вегетационного периода 1990 года характеризовались пониженной температурой и дефицитом влаги в первой половине вегетации и большим ее избытком во второй половине вегетационного периода. 1991 год отличался обилием осадков и их неравномерным распределением по месяцам и декадам. Для полевых исследований достаточно благоприятными были 1992, 1994 и 1995 годы. Для вегетационного периода 1993 года были характерны обилие осадков и пониженные по сравнению со среднемноголет-ними данными температуры в течение всего вегетационного периода.
