Введение к работе
Актуальность проблемы. Цитокинины, подобно другим фитогормонам, регулируют многие физиологические процессы в растениях, включая деление клеток, рост и старение листьев, биогенез хлоропластов, дифференцировку побегов и многое другое (Skoog and Miller, 1957, Кулаева 1973, 1982, 1995). Однако наука находится лишь у истоков изучения молекулярного механизма действия цитокининов.
По современным представлениям важным этапом на пути реализации гормональных сигналов в клетке является взаимодействие гормонов со специфическими белками-рецепторами (Кулаева 1982, 1995; Venis, 1985; Романов 1989; Napier and Venis, 1990). Поэтому выделение и изучение гормон-связывающих белков растений привлекает большое внимание исследователей.
К настоящему времени цитокинин-связывающие белки (ЦСБ) выделены из ряда растительных объектов, включая зародыши пшеницы (Polya and Davis, 1978; Moore III, 1979; Erion and Fox, 1981; Brinegar and Fox, 1985). каллусные ткани (Chen et al., 1980; Hamaguchi et a!.. 1985) и листья табака (Takegami and Yoshida, 1975,1977; Momotani and Tsuji, 1992; Mitsui and Sugiura, 1993), проростки огурца (Jayabaskaran, 1990), листья ячменя (Романов и др., 1986; Каравайко и др., 1990), этиолированные проростки кукурузы (Romanov et al., 1990; Taran et al., 1992) и т. д. Однако, их рецепторная роль в ответе клеток на природный цитокинин транс-зеатин не была доказана.
Вместе с тем сведения о присутствии в листьях ячменя белка (или белков), опосредующего (опосредующих) активацию цитокинином синтеза РНК, были получены в лаборатории проф. О. Н. Кулаевой (Романко и др., 1980: Селиванкина и др., 1982; Харченко и др., 1983). Белок, участвующий в активации цитокинином синтеза РНК in vitro в системе, содержащей хроматин и связанную с ним РНК-полимеразу I из листьев ячменя, позднее был выделен в этой лаборатории на основании, сродства к синтетическому цитокинину 6-бензиламинопурину (БАП) (Kulaeva et al., 1990; Каравайко и др., 1990). Однако хорошо известно, что БАП по многим параметрам существенно отличается от природного цитокинина — трамс-зеатина, и что белок, обладающий высоким сродством к БАП, может иметь низкое сродство к природному цитокинину растений (Erion and Fox, 1981). Это указывало на необходимость поиска рецептора цитокинина в растительных клетках на основании его аффинности к тринс-зеатину.
Цель и задачи исследования. Целью нашей работы было выделение
из листьев ячменя трамс-зеатин-связывающего белка (ЗСБ) и исследование его физико-химических и функциональных свойств. Перед нами стояли следующие задачи:
-
получить антиидиотипические антитела (АТа_н) к зеатину,с помощью которых можно идентифицировать зеатин-связывающий белок и исследовать его свойства;
-
с применением аффинной хроматографии с иммобилизованным транс-зеатином разработать процедуру возможно полной очистки ЗСБ из цитозоля листьев ячменя;
-
с помощью [3Я]-трамс-зеатина изучить способность белка обратимо и специфично связывать цитокинин;
-
исследовать лигандную специфичность взаимодействия ЗСБ с природными и синтетическими цитокининами;
-
в совместных исследованиях с к.б.н. С. Ю. Селиванкиной изучить функциональную активность цитокинин-белкового комплекса.
Научная новизна. Из цитозоля листьев ячменя выделен и очищен зеатин-связывающий белок, отвечающий всем критериям рецептора цитоки-нина. Белок обратимо связывает [:,Я]-трамг-зеатин и проявляет высокую лигандную специфичность в связывании цитокининов. Белок не связывает другие фитогормоны. Цитокинин-белковый комплекс индуцирует активацию транскрипции цитокинином синтеза РНК in в системе, содержащей хроматин и связанную с ним РНК-полимеразу I из листьев ячменя. Таким образом, цитокинин-белковый комплекс моделирует in vitro типичное действие цитокининов in vivo - активацию синтеза РНК в листьях ячменя.
Впервые получены АТа_и к зеатину и использованы для тестирования ЗСБ и исследования лигандной специфичности связывания выделенного белка с цитокининами.
Практическая значимость. Выделение белка со свойствами рецептора цитокинина открывает возможности изучения молекулярных механизмов действия цитокининов в растениях. Возникает перспектива выделения гена рецептора цитокининов и получения трансгенных растений с заданными параметрами чувствительности к цитокинину.
Апробация диссертационного материала. Материалы, представленные к защите, докладывались на II Российском симпозиуме «Новые методы биотехнологии растений» (Пушино, 1993); III съезде ВОФР (Санкт-Петербург, 1993); Международном симпозиуме «Рецепция и передача гормональных сигна-
лов» (Москва, 1994); XV Международной конференции по регуляторам роста растений (Minneapolis, 1995); II симпозиуме ВОФР (Пенза, 1996); на рабочем совещании по изучению восприятия и передачи цитокининового сигнала в высших растениях в рамках программы INTAS (Москва, 1996); на IV рабочем совещании в рамках программы русско-немецкого сотрудничества по биотехнологии (Санкт-Петербург, 1996).
Публикации. Материал диссертации опубликован в 10 печатных работах.
Объем и структура работы.Диссертация изложена на -1ІО страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка цитированной литературы, который включает/^^наименований.
