Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1 Молекулярные механизмы действия гормонов 8
1.2 Физиологические эффекты цитокинина 10
1.3 Элементы трансдукции цитокининового сигнала 10
1.3.1 Цитокипин-сеязывающие белки 10
1.3.2 Участие двухкомпонентнои системы в восприятии и передаче цитокининового сигнала 14
1.3.3 Другие возможные пути трансдукции цитокининового сигнала 21
1.4 Действие цитокинина на транскрипцию хлоропластных генов 23
1.5 Транскрипционная система хлоропластов 25
1.5.1 Роль сигма-подобных факторов в дифференциальной экспрессии хлоропластных генов 26
1.5.2 ДНК-связывающие белки хлоропластов 27
1.5.3 НеспецифическиеДНК-связывающие белки хлоропластов 31
2. Объект и методы исследований 34
2.1 Объект исследований 34
2.2 Синтез коньюгата цитокинина с белком 34
2.3 Получение иммунной сыворотки против зеатинрибозида 35
2.4 Выделение моноспецифических антител к зеатину 35
2.5 Синтез иммуноаффинного сорбента (АТ2-сефарозы) для выделения АТа 36
2.6 Получение антиидиотипических антител к зеатину 37
2.6.1 Иммунизация кроликов моноспецифическими антителами к зеатину 37
2.6.2 Выделение А Та^и с помощью хроматографии на A Tz сефарозе 37
2.7 Выделение хлоропластов из листьев ячменя и экстракция из них белков 38
2.8 Хроматографическая очистка зеатин-связывающего белка 38
2.8.1 Гель-фильтрация на сефадексе Г-50 39
2.8.2 Гидрофобная хроматография на фенил-сефарозе 39
2.8.3 Аффинная хроматография 39
2.9 Твердофазный иммуноферментный анализ 40
2.9.1. Идентификация зеатин-связывающего белка 41
2.9.2 Определение специфичности антисыворотки против зеатин-рибозида и очищенных антител к зеатину 41
2.9.3 Выявление присутствия АТа.и в антисыворотке против зеатинрибозида 42
2.10 Участие ЗСБ в цитокинин-зависимоЙ регуляции транскрипции 42
2.11. Электрофорез белков в денатурирующих условиях 43
2.12. Электрофорез белков в неденатурирующих условиях 43
2.13. Электроперенос и иммуноблотинг белков 44
3. Результаты экспериментов и их обсуждение 45
3.1 Изучение чувствительности к цитокинину листьев первого яруса ячменя отделенных от растений разного возраста 45
3.2 Выделение хлЗСБ из первого листа растений ячменя разного возраста 49
3.2.1 Экстракция зеатиН'Связываюгцего белка из хлоропластов.49
3.2.2 Очисткахлоропластного зеатин-связывающего белка 51
3.3 Функциональные свойства выделенного хлЗСБ 55
3.3.1 Сравнение транскрипционной активности хлЗСБ, выделенных из 3-, 10-и 14-дневных растений ячменя 57
3.4 Изучение хлЗСБ в условиях нативного электрофореза 62
3.4.1 Сравнение хлЗСБ из листьев ячменя 3-, 10-и 14-дневных растений в условиях нативного электрофореза 66
3.5 Исследование видовой специфичности цитокининсвязывающего белка 72
3.5.1 Исследование транскрипгщонной активности хлЗСБ из листьев ячменя в хлоропластном лизате из листьев риса и люпин 72
3.5.2 Выделение ЗСБ из хлоропластов риса 73
Заключение 75
Выводы 78
- Физиологические эффекты цитокинина
- Синтез коньюгата цитокинина с белком
- Участие ЗСБ в цитокинин-зависимоЙ регуляции транскрипции
- Исследование видовой специфичности цитокининсвязывающего белка
Введение к работе
В настоящее время установлено, что действие гормонов на клетки-мишени осуществляется через специфические клеточные рецепторы. Изучение механизма действия гормонов заключается в исследовании их рецепторов и процессов, приводящих к проявлению специфического гормонального эффекта (Розен, 1994).
Для цитокининов открыты мембранные рецепторы (Inoue et. al., 2001; Ueguchi et. al., 2001), воспринимающие внешний по отношению к клетке цитокинин. Эти рецепторы участвуют в активации ядерных генов первичного ответа (ARR типа А) цитокинином (Sakakibara et. al., 1998; D'Agastino et. al., 2000). Кроме того, обнаружены ядерные цитокинин-связывающие белки, способные в присутствии цитокинина активировать транскрипцию in vitro в гомологичных транскрипционных системах, содержащих выделенные ядра или препараты хроматина (Каравайко с соавт., 1995, Kulaeva et. al., 1995, 2000), Эти белки являются кандидатами на роль внутриклеточных рецепторов цитокинина, подобно ядерным рецепторам стероидных гормонов животных (Hall et. al., 2001).
Обнаружение как мембранного, так и ядерного рецепторов цитокинина говорит о сложности системы восприятия цитокининового сигнала и приводит к вопросу о разделении функций между этими рецепторами. Так как мембранный рецептор цитокинина в основном локализован в корне, возможно, что в надземной части рецепция цитокинина происходит с помощью других белков (Inoue et. al., 2001). Возможно также, что мембранный и растворимый рецепторы необходимы одновременно в клетке, как это показано на животных (Hall, 2001; Watson and Gametchu, 2003).
Множественность рецепторов обнаружена для стероидных гормонов животных. Восприятие стероидных гормонов у животных осуществляется не только ядерными, но также и мембранными рецепторами (Hall, 2001, Watson and Gametchu, 2003). Мембранные рецепторы индуцируют быстрые ответы на стероиды (синтез вторичных месенджеров и активация сигнальных каскадов), ядерные рецепторы -более медленные (синтез макромолекул). В настоящее время остается не решенным вопрос о роли различных рецепторов в ответе клетки на стероидные гормоны. В некоторых случаях показано взаимодействие между мембранными и ядерными рецепторами. Для растений пока такие данные отсутствуют.
Несмотря на значительный прогресс в изучении механизма действия цитокинина, практически ничего не известно о поступлении цитокининового сигнала в хлоропласты и о белках, которые участвуют в рецепции и передаче этого сигнала. Между тем известно, что хлоропласты являются одной из основных мишеней действия цитокининов в клетке листа (Хохлова с соавт., 1978, Kusnetsov et. al., 1994, Kulaeva et. al., 2002). Показано также, что хлоропласт содержит большой набор цитокининов (Benkova et. al., 1999). Несколько лет назад в нашей лаборатории был выделен из хлоропластов листьев ячменя цитокинин-связывающий белок (хлЗСБ), который, совместно с зеатином, регулировал тотальную хлоропластную транскрипцию в системе in vitro. До настоящего времени это единственный белок, который может претендовать на роль предполагаемого рецептора цитокинина в пластидах.
Известно, что уровень и состояние рецепторов в клетке изменяются под воздействием различных внешних и внутренних факторов (Розен, 1994). Так как хлЗСБ ранее выделялся только из проростков 10-дневных растений, не известно присутствует ли он в хлоропластах более молодых и старых листьев ячменя. Известно, что содержание цитокинина в первом листе ячменя достигает максимума в 3-дневных проростках и далее резко падает (Kulaeva, 1996). Возникает вопрос, что происходит при этом с зеатин-связывающим белком.
В связи с этим целью работы являлось изучение функциональных и некоторых структурных особенностей хлЗСБ в листьях ячменя разного возраста.
Для ее достижения были поставлены следующие задачи:
1) Исследовать чувствительность к цитокинину в онтогенезе первого листа растений ячменя, сравнив разные сорта для выбора оптимального для работы обьекта.
2) Изучить присутствие хлЗСБ в первом листе ячменя в ходе его развития.
3) Проанализировать в условиях нативного электрофореза изменения хлЗСБ в листьях разного возраста, различающихся по чувствительности к цитокинину.
Сравнить функциональные свойства хлЗСБ из листьев ячменя разного возраста, а также из других видов растений.
Изучить активность ЗСБ в хлоропластных лизатах, полученных из первого листа ячменя разного возраста.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1.Молекулярные механизмы действия гормонов на клетки
По современным представлениям физиологическое действие гормона на клетку осуществляется при его взаимодействии со специфическим белком-рецептором. В результате этого взаимодействия происходит ряд событий, приводящих в итоге к проявлению специфического гормонального эффекта. Исследование свойств и структуры рецепторов гормонов необходимо для раскрытия природы чувствительности клеток к гормональным сигналам.
На животных показано, что разные клетки могут по-разному отвечать на гормон. В настоящее ремя причины этого явления достаточно хорошо изучены. Характер, направленность, длительность действия гормона определяется типом и количеством рецептора, а также балансом белков коактиваторов и корепрессоров. Разные клетки и ткани отличаются составом рецепторов, корегуляторов. Это объясняет такие явления как полифункциональность гормонов, компетентность клеток к гормону (Розен, 1994).
У одного и того же гормона может существовать несколько рецепторов, которые могут отличаться сродством к гормону и механизмом действия (Смирнов, 2001). Рецепторы могут быть мембранные и растворимые. Связываясь с мембранными рецепторами, гормоны могут активировать ионные каналы или ферментные системы. В некоторых случаях рецепторы могут сами обладать ферментативной активностью (Розен, 1994). Растворимые рецепторы способны взаимодействовать с промоторами генов (Glass, 1996).
Показано, что растворимые рецепторы стероидных гормонов действуют на промоторы не сами по себе, а с помощью белков коактиваторов и корепрессоров (Glass and Rosenfeld, 2000). Разные ткани могут отличаться составом рецепторов данного гормона, а также набором коактиваторов и корепрессоров, что влияет на конечный ответ клетки на гормон.
Реакция клетки на гормон может модулироваться в результате посттрансляционных модификаций как корегуляторов, так и самих рецепторов гормонов (Glass and Rosenfeld, 2000). Эти реакции являются следствием активации путей трансдукции различных внеклеточных факторов (Hermanson et. al., 2002), что приводит к взаимодействию различных сигналов и делает ген чувствительным одновременно к нескольким факторам.
Известно также, что рецепторы разных гормонов у животных могут непосредственно взаимодействовать между собой, активируя или репрессируя действие друг друга (Katzenellenbogen, 2000). Таким образом, действие гормона на клетку может модулироваться другими внешними и внутренними факторами с помощью различных механизмов. На растениях данные о механизмах взаимодействия различных сигналов пока ограничены, но на уровне физиологических эффектов хорошо известно взаимодействие цитокинина и ауксина, цитокинина и АБК и т.д.
В настоящее время для некоторых растительных гормонов обнаружены рецепторы.
Сигнал АБК передается через мембранный рецептор ассоциированный с гетеротримерным G-белком на фосфолипазу Д, которая гидролизует фосфолипиды мембраны с образованием вторичных посредников, обеспечивающих дальнейшую передачу сигнала (Zhang et. al, 2002).
Для этилена открыто семейство рецепторов относящихся к б и компонентным регулятори ым системам бактерий (Bleecker, Kende, 2000). Показано участие МАР-киназного каскада в передаче этиленового сигнала (Moshkov, 2003).
Для ауксина известно два бел ка-кандидата на роль рецепторов ауксина, один из которых растворимый (Woo et. al., 2000) , другой локализован в мембране (Kim et. al, 1998).
Цитокининовый рецептор также гомологичен би компонентной регуляторной системе бактерий. Об этом более подробно написано в следующей части обзора.
1.2, Физиологические эффекты цитокинина.
Цитокинины участвуют в регуляции деления клеток, формирования побега, старения листа, развития хлоропластов, в регуляции углеводного метаболизма и т.д. ( Кулаева, 1973). В дальнейшем было показано, что циркинины оказывают влияние на экспрессию многих генов (Schmulling et. al, 1997). В настоящее время получены данные, касающиеся молекулярного механизма передачи цитокининового сигнала (Kulaeva ON, Prokoptseva OS., 2004).
1.3. Элементы трансдукции цитокининового сигнала
Уже более двадцати лет ученые продолжают искать цитокиниы-связывающие белки, обладающие рецепторными свойствами. Рецептор должен иметь достаточно высокое сродство к гормону.
1.3.1. Цитокинин-связывающие белки
В настоящее время выделены цитокинин-связывающие белки из различных растительных объектов, однако очень немногие из них удовлетворяют ряду свойств предъявляемых к рецепторному белку. Далее будут описаны все выделенные к настоящему времени цитокинин-связывающие белки.
В зародышах пшеницы был обнаружен цитокинин-связывающий фактор (ЦСФ-1) белковой природы (Fox and Erion, 1977). Этот белок выделялся несколькими авторами различными методами. Путем последовательных гель-фильтраций (Polya and Davis, 1978), а также с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованным конканавалином A (Polya and Davis, 1978), кинетинрибозидом (Moore, 1979), 6-Н-бензиладенином (Erion and Fox, 1981). Константа диссоциации гормон-белкового комплекса была примерно одинаковая
, м /ft Ї -4
0.6-10 М. Молекулярный вес нативного белка, определенный в разных лабораториях с помощью гель-фильтрации, составлял от 122 до 180 кД, а в условиях SDS электрофореза обнаруживалось несколько полипептидов от/60 до ЗОжД. Разногласия в определении молекулярного веса ЦСФ-1 могли быть результатом выделения продуктов различных генов или частичной деградации белка в исходных перемолотых пшеничных зернах, которые использовались во всех трех лабораториях. Из выделенных зародышей (Brinegar and Fox, 1985) очистили единственный полипептид 54 кД. Авторы предположили, что ЦСФ-1 — это тример, состоящий из идентичных субъединиц 54 кД. Этот белок трудно рассматривать в качестве рецептора цитокинина из-за его высокого содержания в тканях (9% от растворимого белка зародышей) и низкой константы диссоциации. Кроме того, он исчезает из клеток при прорастании семян и не обнаруживается в вегетативных органах растений.
Несколько цитокинин-связывающих белков было выделено из клеток табака.
Так, с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованным БАП (Takegami and Yoshida, 1975, Yoshida and Takegami, 1977), был выделен цитокинин-связывающий белок 4 кД, способный связываться с 40S субъединицами рибосом в присутствии цитокинина.
Методом аффинной хроматографии с иммобилизованным изопенте ни л аденозином из каллусной ткани табака были выделены цитокинин-связывающие белки с молекулярной массой по данным гель-фильтрации 123 и 8.5 кД (Chen et. al, 1980). Элктрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях показал наличие двух полипептидов с аналогичными молекулярными массами. Hamaguchi с соавторами (1985), используя другой метод, выделили из каллусных клеток табака другие два цитокинин-связывающих белка 32 и 9,4 кД, Данных об их функциональной роли не было получено ни в одном случае,
В 1986 году Гладун с сотрудниками, используя методику разработанную ранее в лаборатории О.Н. Кулаевой (Романко с соавт, 1980, 1982), выделили из культуры ткани табака два полипептида с молекулярными массами 60 и 20 кД по данным ДДС-ПААГ. Выделенная фракция активировала в присутствии БАП синтез РНК в изолированных ядрах культуры тканей табака.
В результате применения аффинной хроматографии с иммобилизованным БАП и транс-зеатином Momotani and Tsuji (1992) из растворимой фракции листьев табака был выделен мономерный белок 31 кД с неизвестной функцией.
С использованием серии хроматографических колонок из листьев табака был выделен цитокинин-связывающий комплекс 130 кД (Mitsui
Ль* and Sugiura, 1993а). По результатам ДДС-ПААГ электрофореза этот комплекс состоял из двух полипептидов 57 и 36 к Д. Попытки авторов
Физиологические эффекты цитокинина
Цитокинины участвуют в регуляции деления клеток, формирования побега, старения листа, развития хлоропластов, в регуляции углеводного метаболизма и т.д. ( Кулаева, 1973). В дальнейшем было показано, что циркинины оказывают влияние на экспрессию многих генов (Schmulling et. al, 1997). В настоящее время получены данные, касающиеся молекулярного механизма передачи цитокининового сигнала (Kulaeva ON, Prokoptseva OS., 2004). 1.3. Элементы трансдукции цитокининового сигнала Уже более двадцати лет ученые продолжают искать цитокиниы-связывающие белки, обладающие рецепторными свойствами. Рецептор должен иметь достаточно высокое сродство к гормону. 1.3.1. Цитокинин-связывающие белки В настоящее время выделены цитокинин-связывающие белки из различных растительных объектов, однако очень немногие из них удовлетворяют ряду свойств предъявляемых к рецепторному белку. Далее будут описаны все выделенные к настоящему времени цитокинин-связывающие белки. В зародышах пшеницы был обнаружен цитокинин-связывающий фактор (ЦСФ-1) белковой природы (Fox and Erion, 1977). Этот белок выделялся несколькими авторами различными методами. Путем последовательных гель-фильтраций (Polya and Davis, 1978), а также с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованным конканавалином A (Polya and Davis, 1978), кинетинрибозидом (Moore, 1979), 6-Н-бензиладенином (Erion and Fox, 1981). Константа диссоциации гормон-белкового комплекса была примерно одинаковая , м /ft Ї -4 0.6-10 М. Молекулярный вес нативного белка, определенный в разных лабораториях с помощью гель-фильтрации, составлял от 122 до 180 кД, а в условиях SDS электрофореза обнаруживалось несколько полипептидов от/60 до ЗОжД. Разногласия в определении молекулярного веса ЦСФ-1 могли быть результатом выделения продуктов различных генов или частичной деградации белка в исходных перемолотых пшеничных зернах, которые использовались во всех трех лабораториях. Из выделенных зародышей (Brinegar and Fox, 1985) очистили единственный полипептид 54 кД. Авторы предположили, что ЦСФ-1 — это тример, состоящий из идентичных субъединиц 54 кД. Этот белок трудно рассматривать в качестве рецептора цитокинина из-за его высокого содержания в тканях (9% от растворимого белка зародышей) и низкой константы диссоциации. Кроме того, он исчезает из клеток при прорастании семян и не обнаруживается в вегетативных органах растений. Несколько цитокинин-связывающих белков было выделено из клеток табака. Так, с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованным БАП (Takegami and Yoshida, 1975, Yoshida and Takegami, 1977), был выделен цитокинин-связывающий белок 4 кД, способный связываться с 40S субъединицами рибосом в присутствии цитокинина.
Методом аффинной хроматографии с иммобилизованным изопенте ни л аденозином из каллусной ткани табака были выделены цитокинин-связывающие белки с молекулярной массой по данным гель-фильтрации 123 и 8.5 кД (Chen et. al, 1980). Элктрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях показал наличие двух полипептидов с аналогичными молекулярными массами. Hamaguchi с соавторами (1985), используя другой метод, выделили из каллусных клеток табака другие два цитокинин-связывающих белка 32 и 9,4 кД, Данных об их функциональной роли не было получено ни в одном случае, В 1986 году Гладун с сотрудниками, используя методику разработанную ранее в лаборатории О.Н. Кулаевой (Романко с соавт, 1980, 1982), выделили из культуры ткани табака два полипептида с молекулярными массами 60 и 20 кД по данным ДДС-ПААГ. Выделенная фракция активировала в присутствии БАП синтез РНК в изолированных ядрах культуры тканей табака. В результате применения аффинной хроматографии с иммобилизованным БАП и транс-зеатином Momotani and Tsuji (1992) из растворимой фракции листьев табака был выделен мономерный белок 31 кД с неизвестной функцией. С использованием серии хроматографических колонок из листьев табака был выделен цитокинин-связывающий комплекс 130 кД (Mitsui Ль and Sugiura, 1993а). По результатам ДДС-ПААГ электрофореза этот комплекс состоял из двух полипептидов 57 и 36 к Д. Попытки авторов разделить эти два белка не привели к успеху. В дальнейшем была определена аминокислотная последовательность субъединицы 57 кД ( Mitsui and Sugiura, 19936). В результате была выявлена значительная гомология белка с Б-аденозил-Ь-гомоцистеин-гидролазой человека, крысы и других организмов. Этот фермент катализирует обратимый гидролиз 8-аденозил-Ь-гомоцистеина, ингибитора метил-трансфераз. Авторы выдвинули интересную гипотезу о том, что цитокинин может регулировать активность промоторов или транскрипционных факторов через регуляцию их метилирования. В 2000 году с помощью многоступенчатой очистки включающей \/ аффинную хроматографию из клеток каллуса табака были выделены два белка с молекулярной массой 34 и 26 кД (Kobayashi et. al.). Белковый сиквенс показал наличие большой гомологии в последовательности второго полипептида с осмотин-подобным белком, Цитокинин-связывающие белки выделялись также из проростков огурца - 43 и 8 кД Jayabaskaran (1988, Ї990) и этиолированных (-і проростков золотистой фасоли . Функциональная роль белков не ЧУ изучалась. Кроме растворимых цитокинин-связывающих белков описанных выше, высокоаффинные цитокинин-связываюшие сайты были также обнаружены и в мембранах. Kobayashi et. al. (1981) обнаружил связывание цитокинина с мембранной фракцией суспензии клеток моркови, Brault et. al. (1999) - с мембранной фракцией из культуры клеток Arabidopsis. Последние сольюбилизировались с мембран солью, что говорит об их периферическом расположении. Обнаружен цитокинин-связывающий белок 42 кД в тилакоидных мембранах табака (Nogue et. al., 1995). Наиболее успешная и фундаментальная работа по выделению и характеристике растворимых ЗСБ, предполагаемых рецепторов цитокинина, выполнена в ИФР РАН под руководством О. Н. Кулаевой (Кулаева, Кузнецов, 2002, Kulaeva, Prokoptseva, 2004). В лаборатории была разработана оригинальная многоступенчатая методика выделения ЗСБ, включающая аффинную хроматографию на колонке с иммобилизованным зеатин-рибозидом.
Из цитозоля и ядер листьев ячменя был выделен белок 67 кД со свойствами рецепторов цитокинина (Kulaeva, 1995, 2000), Особенность данного подхода заключалась в том, что в ходе выделения анализировали только транскрипционно активные ЗСБ. Белок 67 кД совместно с транс-зе&тином активировал транскрипцию в изолированных ядрах и хроматине из листьев ячменя. Показана высокая аффинность ЗСБ 67 кД к физиологически активным цитокининам (Kulaeva, 1998). По мере снижения сродства производных цитокинина к ЗСБ, падала их способность совместно с ЗСБ активировать синтез РНК в условиях in vitro. Эти результаты говорят о том, что ЗСБ 67 кД обладает свойствами ядерного рецептора цитокинина, участвующего в комплексе с зеатином в регуляции транскрипции. Следует отметить, что ЗСБ 61 кД выделен из высокочувствительных к цитокинину листьев ячменя. Аналогичный ЗСБ выделен из листьев Arabidopsis thaiana. Большой интерес представляет установленный факт наличия протеинкиназной активности у ЗСБ 67 кД. Другая группа исследователей лаборатории экспрессии генома ИФР РАН (Romanov et. al., 1988) из растворимой фракции листьев ячменя выделили белок 40-45 кД, который связывал меченный транс-зеатин, но не активировал транскрипцию. Этот белок присутствовал в листьях первого и второго ярусов, а также в корнях. Величина удельного связывания гормона белковой фракцией листьев была в два раза меньше, чем белковой фракцией корней. Этот белок был неактивен в системе транскрипции. Функциональную роль белка не удалось определить. В последнее время достигнут большой прогресс в области изучения трансдукции цитокининового сигнала (Kakimoto, 2003). Возможно, этому способствовало изменение сратегии поиска рецептора цитокинина (от гена к белку). 1.3.2. Участие двухкомпонентной системы в восприятии и передаче цитокининового сигнала В 1996 году (Kakimoto) изолировал ген CKI 1, оверэкспрессия которого приводила к цитокинин независимому росту растений in vitro, Мутанти ые каллуссы пролиферировали, зеленели и образовывали побеги в отсутствие цитокинина в среде. СКІ 1 белок имел области гомологичные гистидинкиназному и ресиверному доменам двухкомпонентной бактериальной системы и этиленового рецептора. Связывание CKI 1 белка с цитокинином не было продемонстрировано, поэтому роль этого белка в трансдукции цитокининового сигнала не известна. Автор предполагает что CKI 1 может действовать,регулируя уровень цитокинина в клетке, на ранних стадиях трансдукции. сигнал а или быть рецептором (Hua, Meyerowitz, 1998). Двухкомпонентная система передачи сигнала обнаружена как у про- так и у многих эу кари от. В растениях рецептор этилена является гибридной гистидин киназой (Bleecker, 2000).
Синтез коньюгата цитокинина с белком
Для иммунизации кролика был синтезирован коньюгат БСА («Serva», Германия) с зеатинрибозидом («Sigma», США), для постановки реакции в системе твердофазного ИФА - коньюгат овальбумина (« Sigma», США) с зеатинрибозидом. Для этого 6 мг зеатинрибозида растворяли в 10 мл 50% этилового спирта. К раствору добавляли 0.9 мМ периодата натрия (« Merc», Германия) и перемешивали раствор в течение часа при комнатной температуре в темноте. Затем в раствор вносили 1 ммоль этиленгликоля (« Serva», Германия) для разложения избытка периодата натрия. Через 5 мин добавляли при перемешивании 20 мг белка (БСА или овальбумина), растворенного в 10 мл воды. При этом рН раствора доводили до 9.3 при помощи 5f% карбоната натрия. Раствор перемешивали при комнатной темпиратуре в течение одного часа. Затем к нему добавляли 3.9 ммоля боргидрида натрия («Serva», Германия) и оставляли на 16-18 часов при перемешивании на холоду. Реакцию останавливали снижением рН до 5 при помощи 1 М муравьиной кислоты (« Fluka», Швейцария). Через 1 час рН поднимали до 8.5, добавляя 1Н аммиак. Для очистки коньюгата от свободного цитокинина и несвязавшихся белков применяли изоэлектрическое осаждение конъюгата при рН 4.3. Осадок отделяли центрифугированием и растворяли в 20 мМ фосфатно-солевом буфере, рН 7.7. После диализа в том же буфере конъюгаты хранили порциями при -70 С\ Количество белка в конъюгатах определяли по методу Лоури, а количество цитокинина — по УФ-спектрам поглощения. 2.3 Получение иммунной сыворотки против зеатинрибозида Иммунизацию кроликов проводили в течение 2-3 месяцев введением 1-1.5 мг конъюгата гормона с БСА с интервалом в 2 недели. Первую иммунизацию проводили введением конъюгата в смеси с полным адъювантом Фрейнда («Calbiochem», Швейцария) 1:1 подкожно в холку, вторую - с неполным адъювантом Фрейнда 1:1 подкожно в несколько точек живота. Последующие иммунизации проводили чистым копъюгатом в мышцу бедра. Через 8-10 дней после 6-7 иммунизации из ушной вены собирали примерно 50 мл крови. Собранную кровь инкубировали 2 часа при температуре 37С для разрушения комплемента, затем оставляли на ночь при 4С для отделения форменных элементов крови. После этого сыворотку отделяли и осветляли ее центрифугированием при 2000g (20 мин), расфасовывали по порциям и хранили при -70С. 2.4 Выделение моноспецифических антител к зсатину Моноспецифические антитела к зеатину выделяли из сыворотки против зеатинрибозида с помощью аффинной хроматографии на зеатинрибозид-сефарозе. Сефарозу 4B(«Farmacia», Швеция) уравновешивали 20 мМ трис-НО буфером, рН 7.4 (при 25С), содержащим 150 мМ NaCI, а затем наносили антисыворотку к зеатинрибозиду, перемешивали ее с сефарозой и оставляли на 1 час при комнатной температуре для связывания иммуноглобулинов с зеатинрибозидом.
Дальнейшие операции проводили при 4 С. Несвязавшуюся фракцию удаляли промывкой тем же буфером. Моноспецифические антитела к зеатину (ATz) элюировали 0.2 М глицин- HCI буфером, рН 3.0, диализовали в 20 мМ трис-HCI буфере, рН 7.7 (при 4С), содержащим 150 мМ NaCI. Концентрирование антител проводили на мембранном фильтре СХ-30 («МШЇрог», США). 2.5 Синтез иммуноаффинного сорбента (АТ2-сефарозы) для выделения AT а.и Выделенные моноспецифические антитела к зеатину иммобилизовали на CNBr-активированную сефарозу 4В («Farmacia», Швеция) по методическим рекомендациям фирмы «Farmacia» (Affinity Chromatography, 1979). Для этого иммуноглобулины диализовали в 200 мМ карбонатном буфере, рН 8.3, содержащем 500мМ NaCI, в течение ночи при 4 С. Сухую CNBr-активированную сефарозу (1.5г) замачивали 15 мин для набухания, а затем отмывали на стеклянном фильтре 1 мМ НО от консервирующих добавок. Влажный гель промывали 0.1 М карбонатным буфером, рН 8.3, содержащим 500 мМ NaCI,H немедленно смешивали с раствором антител (5 мг антител на 1мл набухшего геля). Суспензию перемешивали в течении 2 ч при помощи механической мешалки при комнатной темпиратуре. Несвязавшиеся иммуноглобулины отмывали тем же буфером, не использованные активные активны группы блокировали с помощью 1 М этаноламина, рН 9. Для удаления избытка лиганда и блокирующих агентов гель промывали на стеклянном фильтре попеременно кислым и щелочным буферами: 0.1 М ацетатным буфером, рН 4.0; 0.2 М карбонатным буфером, рН 9.6; 0.2 М глицин-HCI буфером, содержащим 500 мМ NaCT, рН 2.3; 20 мМ трис-HCI буфером, содержащим 500 мМ NaCI. Полученный сорбент содержал 1. 1 мг антител на 1 г влажного геля. 2.6 Получение антииднотипических антител к зеатину Антиидиотипические антитела выделяли хроматографией на ATZ-сефарозе. Для этого использовали антисыворотку против моноспецифических антител к зеатину (АТг), а также антисыворотку против зеатинрибозида после длительной иммунизации кролика. 2.6.1. Иммунизация кроликов моноспецифическими антителами к зеатину проводилась по той же схеме, что и при получении исходной антисыворотки к зеатинрибозиду. Для первой иммунизации использовали 100 мкг иммуноглобулинов против зеатина в смеси с полным адъювантом Фрейнда (1:1). Вторую иммунизацию проводили в смеси с неполным У адъювантом Фрейнда, в дальнейшем кролику вводили по ЮОмкг чистых иммуноглобулинов зеатина. Полученную антисыворотку использовали для выделения АТа.и. 2.6.2. Выделение АТа.„ с помощью хроматографии на АТг сефарозе проводили из антисыворотки против ATZ, а также из антисыворотки к зеатинрибозиду после иммунизации кролика в течении 6 мес. За этот период было проведено несколько циклов иммунизации, и в крови на образованные иммуноглобулины к антигену синтезировались AT а-и Антисыворотку против зеатинрибозида хроматографировали на ZR- сефарозе. Для выделения AT а.и использовали или исходную сыворотку к зеатинрибозиду, или фракцию антител, не связавшихся с ZR-сефарозой. В колонку, содержащую сефарозу с иммобилизованными моноспецифическими антителами к зеатину, предварительно промытую 20 мМ трис-HCI буфером, рН 7.4, содержащим 150 MMNaCI, вносили сыворотку и оставляли на 1 час при комнатной темпиратуре. Дальнейшие операции проводили при 4 С. Несвязавшуюся фракцию удаляли буфером посадки, а связавшиеся AT а.и элюировали 0.25 М раствором аммиака, рН 11. Полученные АТа.и диализовали в 20 мМ трис-HCI буфере, рН 7.4, содержащим 150 мМ NaCI, и использовали в реакциях. 2.7. Выделение хлоропластов из листьев ячменя и экстракция из них белков Для выделения хлоропластов срезанные листья гомогенизировали 10-15 с в гомогенизаторе марки «Komet» в буфере А, содержащем : 0.33 М сорбит, 0.05 М трицин рН 8.0, 2 мМ ЭДТА, 5 мМ 2-меркаптоэтанол (60 мл на 15 граммов листьев). Гомогенат фильтровали через два слоя мираклосс («Calbiochem», Швейцария) и центрифугировали при 4000g 10 мин.
Осадок, содержащий хлоропласты и ядра, ресуспендировали пипеткой в том же буфере и наслаивали на ступенчатый градиент перкола с градиентом концентрации 40-70%. Растворы готовили на буфере Б, содержащем растворенные в буфере А: 3 % ПЕГ 6000, 0.5 % БСА, 0.5 % фикол/После наслаивания хлоропластов и ядер содержимое пробирок центрифугировали при 5000 g 10-15 мин. После разделения ядра оседали на дно, а хлоропласты собирались на границе/70 и 40% перкола. Очищенные хлоропласты отмывали от перкола двумя промывками буфером А. Лизис хлоропластов и экстракцию хлоропластных белков проводили гипотоническим шоком. Для этого хлоропласты обрабатывали раствором 0.5 М NaCl в течение 15 мин, центрифугировали и далее осадок ресуспендировали в воде, содержащей 4 мМ 2-меркаптоэтанола и 0.2 мМ PMSF до конечной концентрации хлорофилла 0.5 мг/мл. Суспензию выдерживали 1 час на льду, периодически ресуспендируя пипеткой, и центрифугироали при 16000 g 20 мин для отделения мембранных компонентов. Супернатант использовали для проведения электрофореза и выделения хлоропластного ЗСБ. 2.8. Хроматографическая очистка зеатин-связывающего белка Полученную фракцию растворимых белков из хлоропластов ячменя использовали для выделения ЗСБ. Все процедуры по выделению ЗСБ проводили при 2-4 С. 2.8.1. Гель-фильтрация на сефадексе Г-50 была применена для очистки белков от низкомолекулярных соединений. Сефадекс Г-50 («Pharmacia», Швеция) упаковывали в колонку и уравновешивали тремя объемами буфера (50 мМ Tris Cl, рН7.5, 10 мМ MgCI2, 500 мМ NaCI, 4 мМ 2-меркаптоэтанол). Элюцию белков проводили тем же буфером и контролировали выход белков при помощи проточного УФ-детектора Uvicord S11 («LKB», Швеция) при 280 нм.
Участие ЗСБ в цитокинин-зависимоЙ регуляции транскрипции
Участие ЗСБ в цитокинин-зависимой регуляции транскрипции было исследовано сотрудником лаборатории экспрессии генома растений (ИФР РАН) к.б.н. СЮ. Селиванкиной. Активность ЗСБ проверяли в лизате хлоропластов, полученном из свежевыделенных органелл. Лизат получали помещением промытых после градиента перко л а буфером А хлоропластов в гипотонический раствор (50 мМ Трис-HCI, рН 7, 10 мМ MgCI2, 10 мМ КО, 4 мМ 2-меркаптоэтанола). Реакционная смесь для определения активности хлоропластной РНК-полимеразы (объем 100 мкл) включала следующие компоненты: 50 мМ Трис-HCI, рН 8, 1 мМ MgCl2 , 1 мМ 2-меркаптоэтанола, по 2 мМ ГТФ, ЦТФ, АТФ, и 3Н-УТФ (1.28 ТБк/мМ), 10-50 мкг хлоропластной ДНК, 2-60 нг ЗСБ хл. Реакцию проводили в течение 20 мин при 25С. Выделение хроматина и ядер из листьев ячменя , определение активности РНК-полимераз I и II, определение содержания ДНК описано ранее (Селиванкина и др., 2001). 2.11. Электрофорез белков в денатурирующих условиях проводили в системе Laemmly (1970) в 10% ПААГ. Размер пластин геля 9x7 см. Условия проведения электрофореза были следующие: сила тока при вхождении образцов в гель-15 мА, а затем в разделяющем геле -25 мА. В качестве лидирующего красителя использовали раствор бромфенолового синего. Электрофорез заканчивали сразу же после выхода лидирующего красителя из геля. Гели окрашивали 0.1 % раствором Кумасси R-250 в 50% этиловом спирте с 10% уксусной кислотой. Фон отмывали раствором 30% этанола с 7% уксусной кислоты. Для определения молекулярной массы полипептидов использовали набор маркерных белков с молекулярными массами 97, 66, 45, 30, 20.1, 14.4 кД (Pharmacia). 2.12. Электрофорез белков в неденатурирующих условиях проводили по методу Laemmly (1970), исключая из состава буферов ДДС-Na и уменьшая концентрацию 2-меркаптоэтанола до 4 мМ. В работе использовали 10 % гели и гели с линейным градиентом концентрации акриламида 15-30%. Электрофорез в 10 % геле проводили в таком же режиме, как и денатурирующий. А для проведения электрофореза в градиенте ПААГ использовали пластины размером 14x16 см, разделение проводили в течение ночи при силе тока 20 мА. В качестве лидирующего красителя использовали раствор бромфенолового синего. Гели окрашивали так же, как описано в п.2.11. Для определения молекулярной массы полипептидов использовали набор маркерных белков, включавший: тиреоглобулин- 669 кД, ферритин -440 кД, каталазу - 232 кД, лактатдегідрогеназу - 140 кД, бычий сывороточный альбумин — 67 кД (Pharmacia). 2.13.
Электроперенос и иммуноблотинг белков Белки после электрофореза переносили с незафиксированного геля на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C («Amersham», Англия) полусухим способом при 0.8 силе тока мА на см в течение 1.5 часа на приборе Мультифор-2 («ЬКВ»,Швеция). Электроперенос проводили в 50 мМ боратном буфере рН 9, с 20 % метанола. 3. Результаты экспериментов и их обсуждение 3.1 Изучение чувствительности к экзогенному цитокинину листьев первого яруса ячменя, отделенных от растений разного возраста Как известно, чувствительность ткани к гормону определяется в значительной степени содержанием в ней соответствующих рецепторов (Розен, 1994). Содержание и свойства рецептора в ткани находятся под воздействием различных факторов. У животных содержание и активность рецепторов гормонов изменяется в процессе развития (Samochocki , Strosznajder et. al., 1994; Igwe, Filla, 1995). У взрослых животных уровень различных рецепторов, как и уровень гормонов, подвержен суточным и сезонным колебаниям, изменяется в половых циклах и существенно зависит от физиологического статуса организма (Розен, Смирнов, 1981). Так как целью работы было изучение свойств хлоропластного цитокинин-связывающего белка из первого листа ячменя в ходе его развитии то, прежде чем выделять хлЗСБ, мы считали целесообразным изучить изменение реакции на цитокинин in vivo у растений ячменя разного возраста, используя биотест, основанный на задержке цитокинином пожелтения листьев ячменя (Кунаева, 1973). Результаты по чувствительности растений ячменя к цитокинину могут дать первоначальную информацию (возможно очень примерную) о состоянии системы восприятия и реализации цитокининового сигнала. Позеленение листа может быть обусловлено влиянием цитокинина на ультраструктуру пластид, как это было показано на стареющих листьях махорки (Курсанов с соавт., 1964), в семядолях тыквы (Хохлова с соавт., 1971; Микулович с соавт., 1971), семядолях люпина (Kusnetsov et al., 1994). Цитокинин увеличивает размер пластид и стимулирует их деление (Хохлова с соавт., 1971), а также влияет на активацию (или новообразование) ферментов биосинтеза хлорофилла или его предшественников (Kusnetsov et al, 1998). Хотя бы один полипептид всех белковых комплексов мембран хлоропластов находится под контролем цитокинина (Kusnetsov et al, 1994). В нашей лаборатории было показано, что экзогенные цитокинины вызывают задержку старения срезанных листьев ячменя, что сопровождается усилением синтеза РНК (Кулаева с соавт., 1979, Кулаева, 1982). Было также установлено, что цитокинин способен активировать синтез РНК в хлоропластах в системе in vitro (Романко с соавт., 1986). В дальнейшем было показано, что активация синтеза РНК происходит при участии растворимых цитокинин-связывагощих белков цитоплазмы и хлоропластов (Селиванкина с соавт., 1982). Мы изучили способность цитокинина задерживать разрушение хлорофилла на разных стадиях развития листа, чтобы выбрать временные точки для выделения и характеристики хлЗСБ. Как процесс старения листа, так и задержка старения цитокинином, представлют собой сложный процесс, регулируемый огромным количеством различных факторов. Вполне возможно, что идентифицированный мембранный рецептор цитокинина (Inoue et. al., 2001), также как и предполагаемый растворимый рецептор участвуют в задержке цитокинином старения листьев. Какова роль каждого из возможных рецепторов цитокинина пока не известно. Однако показано, что как ядро, так и пластом участвуют в задержке цитокинином старения листьев. Так как ферменты биосинтеза хлорофилла кодируются ядром то, очевидно, что накопление фотосинтетических пигментов при инкубации листьев на гормоне происходит при участии цитозольного рецептора. ХлЗСБ, скорее всего, также принимает участие в этом процессе, влияя на транскрипцию генов хлоропластных белков (Селиванкина с соавт., 1997). В предварительных опытах была изучена чувствительность к экзогенному цитокинину 4 сортов ячменя («Дина», «Дуэт», «Андрей», «Луч»), полученных проф. Н.А. Родиной (г. Киров) для районирования в Северо-восточной зоне Европейкой части России. Результаты показали, что наибольшей чувствительностью к цитокинину отличался сорт Луч, который и был использован для всех последующих экспериментов. Изучение динамики роста первого листа ячменя показало, что, в отличие от сорта Винер, первый лист которого рос в течение 6-7 дней (Kulaeva et al, 1996), рост первого листа сорта Луч продолжался всего в течение первых 4 дней (рис. 1). Столь разная динамика роста могла отразиться на чувствительности первого листа молодых растений к экзогенному цитокинину. Содержание хлорофилла а в первом листе ячменя сорта Луч достигало максимума в шести-дневных растениях и оставалось без изменения в течение длительного времени.
Исследование видовой специфичности цитокининсвязывающего белка
Предполагается, что одним из механизмов эволюции является изменение в регуляторных областях генов и возникновение новых транскрипционных факторов (Doebley, Lukens, 1998). Поэтому представляло интерес изучить способность хлоропластного зеатин-связывающего белка из листьев ячменя регулировать транскрипцию в хлоропластном лизате растений других видов, а также выделить хлЗСБ из других видов растений и проверить их активность в хлоропластном лизате из листьев ячменя. С этой целью активность хлЗСБ из ячменя была проанализирована в хлоропластных лизатах из листьев риса и люпина (табл.3), Из листьев 14-дневных растений риса был выделен хлоропластньтй ЗСБ. Оказалось, что ЗСБ из листьев ячменя способен активировать транскрипцию во всех изученных системах. В листьях люпина белок активировал транскрипцию только при совместном добавлении с зеатином, а в листьях риса и семядолях люпина хлЗСБ был способен активировать транскрипцию в отсутствии гормона. Таким образом, гормоннезависимая активность белка обуславливается возрастными особенностями растения. Гормоннезависимое действие ячменного белка в листьях риса и семядолях люпина напоминает действие ЗСБ в хлоропластах старых 14-дневных листьях ячменя. Полученные данные говорят о том, что в рисе и люпине присутствуют мишени для хлоропластного ЗСБ из ячменя. Однако на основании этих данных нельзя утверждать, что аналогичный белок присутствует в этих растениях. Для этого из хлоропластов риса был выделен ЗСБ. 3.5.2. Выделение ЗСБ из хлоропластов риса Выделение ЗСБ из хлоропластов риса проводили по методике используемой для выделения ЗСБ из хлоропластов ячменя. Выделенный белок был способен активировать транскрипцию в хлоропластных лизатах, как риса, так и ячменя. Цитокинин подавлял его действие в хлоропластах ячменя и не влиял на активность в хлоропластах риса. Полученные результаты говорят об отсутствии видовой специфичности в действии ЗСБ из ячменя. Отсутствие видовой специфичности показано также для цитозольного ЗСБ из ячменя, который активировал совместно с зеатином, синтез РНК в системе транскрипции in vitro, содержащей изолированный хроматин из арабидопсиса и ряда других видов растений (Селиванкина с соавт., 2001; Бровко с соавт., 1996). Как было сказано во введении, целью нашей работы было изучение свойств хлоропластного ЗСБ в листьях ячменя разного возраста, отличающихся чувствительностью к цитокинину. Способность хлЗСБ из листьев 10-дневных растений ячменя активировать транскрипцию была показана ранее (Селиванкина и др., 1997). Так как изначально белок выделяли только из первых листьев 10-дневного проростка ячменя, было не известно, присутствует ли он в листьях более молодых и старых растений.
Проделанная работа показывает, что зеатин-связывающий белок, обнаруженный ранее в хлоропластах листьев ячменя (Селиванкина и др., 1997), присутствует в хлоропластах листьев ячменя всех изученных возрастов, но изменяет свои свойства в процессе развития листа. Для изучения функциональных свойств хлЗСБ использовали белок, полученный с помощью многоступенчатой системы очистки, включающей аффинную хроматографию на зеатин-рибозид сефарозе. Белок выделяли из первого листа 3-, 10- и 14-дневных проростков ячменя. Было показано, что при использовании хлоропластного лизата из листьев 10-дневных растений, хлЗСБ из растений разного возраста отличаются по характеру действия и по-разному реагируют на добавление цитокиннна. Так, белок из 10-дневных растений не активен без добавления гормона, тогда как белки из 3- и 14-дневных проростков могли активировать транскрипцию. Добавление гормона в реакционную среду не влияло на активность хлЗСБ из 3-дневных растений и подавляло действие белка из хлоропластов 14-дневных растений. Изменение функциональной активности белка может быть вызвано различными посттрансляционными модификациями. Так как в результате такой модификации изменяется либо заряд, либо конформация белковой молекулы, то она может изменить подвижность белка в условиях нативного электрофореза. После электрофореза белков в 10% неденатурирующем ПААГ антителами идентифицировали два белка с молекулярной массой 67 ± 2 и 128 ± 2 кД. Взаимодействие с антителами данных полипептидов уменьшалось при старении первого листа ячменя. Возможно, это в какой-то степени обуславливает различную чувствительность листа к гормону. Обнаружение двух полипептидов, связывающихся с АТа.и в нативных условиях, ставило вопрос об их природе. При анализе белков 128 ± 2 и 67 ± 2 кД в условиях денатурирующего 10% ПААГ электрофореза был обнаружен единственный полипептид с молекулярной массой 65 ± 2 кД. Таким образом, полипептид с кажущейся молекулярной массой 128 кД, возможно, является димером состоящим из двух полипептидов 65 кД. Исследование хлоропластных белков в нативных условиях в градиенте ПААГ 15-30 % позволило выявить дополнительный зеатин-связывающий полипептид с кажущейся молекулярной массой 69 ± 2 кД. Анализ белков 67+ 2 и 69 + 2 кД в ПААГ в денатурирующих условиях показал, что оба полипептида обладают одинаковой молекулярной массой 65 ± 2 кД. Полученные данные позволяют предположить, что эти два полипептида отличаются зарядом или конформацией молекулы, что и приводит к изменению подвижности белка в геле. Для установления природы модификации, приводящей к появлению второй полосы, необходимы дополнительные исследования. Возможно также, что эти полипептиды являются продуктами разных генов. Полипептид 69 + 2 кД преимущественно обнаруживается в листьях 10-дневных растений. Полученные результаты говорят о существовании системы модификации ЗСБ, которая, вероятно, влияет на его активность. Чтобы изучить видоспецифичность хлЗСБ, его активность проверяли в хлоропластах из растений риса и люпина. Было показано, что белок из ячменя может активировать транскрипцию в этих видах. Из хлоропластов риса был выделен ЗСБ, который активировал транскрипцию в w хлоропластах ячменя. Эти данные свидетельствуют об отсутствии строгой видовой специфичности хлЗСБ в листьях высших растений.
