Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 10
1.1 Общие представления о полиаминах и их биологической роли 10
1.2 Общие представления о биосинтезе главных полиаминов (путресцина, спермидина, спермина) 13
1.3 Катаболизм и превращение полиаминов у растений 17
1.4 Роль полиаминов в адаптации растений к неблагоприятным условиям окружающей среды 20
1.5 Особенности метаболизма кадаверина и его физиологической роли 35
Глава 2. Объект и методы исследования 46
2.1 Объект исследования 46
2.2 Условия выращивания хрустальной травки в водной культуре 47
2.3 Условия проведения опытов 50
2.4 Определение содержания свободных полиаминов 53
2.5 Определение интенсивности выделения этилена и 02 55
2.6 Определение содержания этилена в тканях растений 56
2.7 Определение содержания свободного пролина 57
2.8 Измерение рН и титруемой кислотности 58
2.9 Определение активности лизиндекарбоксилазы 58
2.10 Определение содержания ионов СГ 59
2.11 Определение количества перекиси водорода 60
2.12 Опредедение активности растворимой пероксидазы 60
2.13 Определение интенсивности транскрипции гена ФЕПК 61
2.14 Математическая обработка данных 66
Глава 3. Экспериментальная часть 67
3.1 Содержание кадаверина и главных полиаминов у хрустальной травки в норме и при действии NaCl 67
3.1.1 Возрастные особенности аккумуляции кадаверина и полиаминов семейства путресцина в листьях хрустальной травки в нормальных условиях произрастания 68
3.1.2 Изменения в содержании кадаверина и полиаминов путресцинового ряда у хрустальной травки при адаптации к засолению 73
3.2 Особенности взаимодействия этилена и кадаверина в условиях засоления 83
3.2.1 Влияние этилена на аккумуляцию кадаверина 84
3.2.2 Механизмы этилен-индуцированного образования кадаверина 88
3.2.3 Влияние экзогенного кадаверина на содержание главных полиаминов и элюцию этилена листьями 92
3.3 Физиологическая роль этилен-индуцированной аккумуляции кадаверина у хрустальной травки в стрессорных условиях 96
3.3.1 Влияние аккумуляции этилена и кадаверина на процессы роста и развития 97
3.3.2 Влияние кадаверина и этилена на экспрессию гена ключевого фермента С4М-метаболизма 105
3.3.3 Суточные колебания содержания кадаверина в листях и корнях хрустальной травки в период С4М-фотосинтеза 109
Заключение 112
Выводы 116
- Общие представления о биосинтезе главных полиаминов (путресцина, спермидина, спермина)
- Роль полиаминов в адаптации растений к неблагоприятным условиям окружающей среды
- Условия выращивания хрустальной травки в водной культуре
- Особенности взаимодействия этилена и кадаверина в условиях засоления
Введение к работе
В настоящее время во многих лабораториях мира ведутся интенсивные исследования в области адаптации растительных организмов к неблагоприятным факторам окружающей среды, в том числе к одному из главных абиотических стрессоров - засолению. Большой интерес вызывает участие полиаминов в стресс-реакциях и адаптации растений к экстремальным условиям среды. Во многих работах показано, что полиамины в условиях адаптационного процесса проявляют защитные свойства (Galston et al., 1997; Bouchereau et al., 1999). При этом обращает на себя внимание тот факт, что в основном исследуется метаболизм и биологическая роль полиаминов семейства путресцина (путресцин, спермидин, спермин).
Гораздо менее изученным полиамином следует признать кадаверин. По сравнению с путресцином и его производными (спермидин и спермин) специальные исследования по аккумуляции кадаверина при действии на растения абиотических стрессоров практически не проводились. Только спорадически единичные сведения об его аккумуляции в растениях в стрессорных условиях можно встретить в публикациях.
Известно, что регуляция полиаминами физиологических процессов осуществляется в тесном взаимодействии с этиленом. Подавляющая часть проведенных в этом направлении исследований также касается лишь полиаминов семьи путресцина, что вполне естественно, поскольку у этих полиаминов с этиленом имеется общий предшественник - S-аденозилметионин (SAM) (Altman, 1986; Kaur-Sawhney, 1995).
В подобных исследованиях практически не уделялось внимания кадаверину, хотя процессы биосинтеза этилена, полиаминов (спермидина и спермина) и кадаверина косвенно связаны, поскольку кадаверин образуется в боковом ответвлении аспартатного пути, ведущего к биосинтезу метионина и SAM.
Тем не менее, в ряде работ еще в 90-е годы было установлено необычное поведение кадаверина в отношении этилена и полиаминов группы путресцина у некоторых кадаверин-содержащих видов растений (Apelbaum et al., 1985; Bakhanashvili et al., 1985; Icekson et al., 1986). Недавно в ряде исследований (Дам, 1999; Kuznetsov et al., 2000; Кузнецов и др., 2000; Shevyakova et al., 2001; Kuznetsov et al., 2002) был обнаружен необычный характер взаимовлияния кадаверина и этилена у хрустальной травки в условиях теплового шока, который являлся не конкурентным, как в случае со спермидином, а скорее синергическим. Хрустальная травка отвечала на тепловой шок транзиторным выделением этилена и последующей межорганной транслокацией кадаверина, что могло быть связано с процессами адаптации и выживания растений в экстремальных условиях.
Однако, особенности аккумуляции кадаверина при действии других абиотических стрессоров, в частности засоления, а также характер отношений между кадаверином и этиленом в этих условиях, в настоящее время практически не изучены. Не выяснена также биологическая роль кадаверина при стрессе. Изучение данных вопросов способно внести определенный вклад в выяснение общих механизмов адаптации растений к действию абиотических стрессоров.
Цель и задачи исследования. Настоящая работа является продолжением выше указанных исследований в направлении более углубленного изучения способности растений хрустальной травки аккумулировать кадаверин при солевом стрессе (NaCl), выяснения механизмов индуцирующего действия этилена, установления связи аккумуляции кадаверина с функционированием С4М-метаболизма и возможной физиологической роли кадаверина в условиях засоления.
В связи с этим были поставлены следующие задачи: 1. Определить содержание кадаверина у растений трех возрастных групп в норме и при засолении NaCl и сравнить его с изменениями в активности лизиндекарбоксилазы (ЛДК) и содержанием полиаминов семейства путресцина.
2. Установить изменения в эндогенном уровне этилена у хрустальной травки при действии NaCl и исследовать взаимовлияние экзогенного этилена и кадаверина в опытах с изолированными листьями.
3. Исследовать механизмы индуцирующего действия этилена на аккумуляцию кадаверина в опытах с изолированными листьями при экспонировании их в присутствии предшественника этилена 1-аминоциклопропан-1-карбоксиловой кислоты (АЦК) и при действии NaCl.
4. Выяснить, включаются ли процессы фосфорилирования/дефосфорили-рования белков как компоненты цепи трансдукции этиленового сигнала в образование кадаверина, проведя для этой цели ингибиторный анализ.
5. Исследовать, вовлекается ли кадаверин и этилен в индукцию САМ-типа фотосинтеза, применив для этой цели оценку уровня мРНК гена ключевого фермента С4М-метаболизма фосфоенолпируват-карбоксилазы (ФЕПК) - Ррс 1 с помощью метода обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).
6. Изучить влияние экзогенного кадаверина на процесс растяжения гипокотилей проростков и рост корешков проростков хрустальной травки и арабидопсиса и сравнить с действием на эти параметры АЦК, а также выяснить влияние долговременной обработки растений хрустальной травки экзогенным кадаверином на накопление биомассы надземными органами и корнями и определить изменения в составе полиаминов.
7. Исследовать суточную динамику содержания кадаверина в корнях и листьях растений хрустальной травки в период протекания САМ-фотосинтеза.
Научная новизна. Впервые продемонстрировано, что компетентность растений хрустальной травки к аккумуляции кадаверина в норме находится под онтогенетическим контролем, а в регуляцию их эндогенного уровня при действии солевого стресса включается этилен. Подтвержден ранее установленный характер взаимодействия в системе этилен/полиамины: синергический в отношении этилен -»кадаверин и реципрокный в отношении этилен -»спермидин. Впервые установлено, что этилен-индуцированное образование кадаверина в листьях хрустальной травки могло быть опосредовано процессами фосфорилирования/дефосфорилирования белков на этапе трансдукции этиленового сигнала. Впервые представлены экспериментальные доказательства того, что аккумуляция в листьях хрустальной травки кадаверина и повышенное образование в них этилена не имеют отношения к регуляции экспрессии стресс-индуцибельного гена ФЕПК (Ррс 1) на уровне аккумуляции соответствующей мРНК. Впервые установлены суточные колебания содержания кадаверина в листьях и корнях хрустальной травки в фазе С4М-фотосинтеза. Показана двойственность действия кадаверина на процесс растяжения гипокотилей проростков хрустальной травки: стимуляция при низких концентрациях диамина (0,2-1,0 мМ) и торможение растяжения при высоких (свыше 2,0 мМ), что может иметь адаптивное значение в условиях засоления.
Практическая значимость. Полученные в работе теоретические данные о механизмах аккумуляции кадаверина и полиаминов семьи путресцина у хрустальной травки в условиях засоления имеют существенное значение для выяснения хода формирования адаптивных процессов у галофитов и при разработке технологии создания трансгенных модельных растений с повышенной солеустойчивостью. Теоретические обобщения и совокупность экспериментальных данных работы могут использоваться в курсах лекций для студентов биологических факультетов вузов страны.
Апробация работы. Результаты исследований докладывались на международной конференции «Актуальные вопросы экологической физиологии растений в XXI веке» (Сыктывкар, 2001), на международном симпозиуме «Plant under Invironmental Stress» (Москва, 2001), на V Съезде общества физиологов растений России и Международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследований, изложения полученных результатов, обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, включая 6 таблиц, 35 рисунков; библиография содержит 199 названий, в т.ч. 170 на иностранных языках.
Общие представления о биосинтезе главных полиаминов (путресцина, спермидина, спермина)
Метаболизм полиаминов у растений достаточно хорошо изучен, но в основном это касается полиаминов семьи путресцина. Путресцин является не только обязательным предшественником, но и ключевым соединением в биосинтезе спермидина и спермина у растений (Рис. 2). В растениях существует несколько путей биосинтеза путресцина. Этот диамин может образовываться при декарбоксилировании трех аминокислот орнитинового цикла: орнитина, цитруллина и аргинина. Из орнитина и цитруллина путресцин образуется в результате прямого декарбоксилирования, катализируемого орнитиндекарбоксилазой (ОДК) и цитруллиндекарбоксилазой (ЦДК), соответственно (Slocum, 1991). Путь образования путресцина из цитруллина обнаружен у весьма немногочисленных видов растений и только на определенных стадиях онтогенеза.
Путресцин также может образовываться непрямым путем через серию промежуточных продуктов, включая агматин, при декарбоксилировании аргинина аргининдекарбоксилазой (АДК). Агматин гидролизуется агматин-иминогидролазой (АИГ) до N-карбамоилпутресцина, который превращается в путресцин при участии N-карбамоилпутресцин амидогидролазы (Шевякова, 1981). Скорость-лимитирующим ферментом биосинтеза путресцина является аргининдекарбоксилаза.
В растениях функционируют как аргининовый, так и орнитиновый путь биосинтеза полиаминов. Однако, несмотря на непрямое образование путресцина из аргинина, этот путь биосинтеза является основным для большинства растений, особенно при действии на растение негативных факторов. Тем не менее, вопрос о характере взаимодействия и взаимной регуляции двух биосинтетических путей остается дискуссионным (Bouchereau et al., 1999). Эта проблема представляется особенно интересной в силу различной компартментации этих ферментов. Предполагают, что ОДК локализована в основном в цитоплазме, тогда как АДК - в тилакоидных мембранах хлоропластов (Borell et al., 1995; Walden et al., 1997; Kakkar, Sawhney, 2002). Только в одной работе локализация ОДК в растениях установлена в ядре (Slocum, 1991). В то же время в клетках животных функционирование ОДК тесно связано с ядром (Dodds et al., 1990).
Таким образом, благодаря различной локализации ферментов, два пути биосинтеза (через АДК и/или ОДК), приводящие к образованию путресцина, оказываются пространственно разделены. Высказано предположение, что полиамины, образованные разными путями биосинтеза, возможно, играют различную физиологическую роль (Hiatt, 1989). Так, оказалось, что полиамины, образующиеся через ОДК-путь, играют роль в пролиферации в активно растущих растительных тканях, тогда как полиамины, образующиеся через АДК-путь, главным образом включаются в процессы растяжения клеток и адаптации растений к абиотическим стрессам (Galston et al., 1997; Bouchereau et al, 1999).
Путресцин является родоначальником целой семьи полиаминов (спермидина, спермина, и ряда необычных полиаминов). Наращивание алифатической цепи путресцина с образованием спермидина и спермина идет путем последовательной полимеризации с помощью присоединения пропиламина, образующегося при декарбоксилировании SAM S-аденозилметиониндекарбоксилазой (SAM/JK). Реакция, катализируемая 8АМДК, является скорость-лимитирующим шагом в биосинтезе полиаминов. Сначала пропиламин полимеризуется с путресцином (образуется спермидин), а затем со спермидином (образуется спермин). Последовательно протекающие реакции полимеризации катализируются спермидинсинтазой и сперминсинтазой, соответственно (Шевякова, 1981, Bouchereau et al., 1999). SAM является предшественником не только при биосинтезе полиаминов путресциновой группы, но и при биосинтезе этилена. Биосинтез этилена включает следующую цепь реакций: АЦК-синтаза определяет скорость образования этилена и ее активность зависит от влияния фитогормональных факторов, факторов среды, а также от фазы онтогенеза растения (Kende, 1993; Zarembinski, Thoelogis, 1994). АЦК-оксидаза является зависимым от кислорода и СОг ферментом, а также может регулироваться различными индукторами образования этилена, хотя и в значительно меньшей степени (Dong et al., 1992; Kende, 1993).
Роль полиаминов в адаптации растений к неблагоприятным условиям окружающей среды
На содержание и метаболизм полиаминов в растениях большое влияние оказывают различные биотические и абиотические факторы. Однако, самые известные и, вероятно, самые значительные изменения метаболизма полиаминов в растительной клетке происходят при действии абиотических стрессоров (Flores, 1991).
Впервые на стресс-зависимое накопление полиаминов обратили внимание Richards и Coleman (1954-1956). В их опытах с листьями ячменя, испытывавших калийное голодание, наблюдалось почти стократное увеличение концентрации путресцина (Richards, Coleman, 1952). С тех пор начались интенсивные исследования по выявлению роли ди- и полиаминов в стрессорных условиях. Было показано, что накопление диаминов в растениях наблюдается не только при дефиците катионов, но и при их избытке, при засолении. Впервые внимание к этим вопросам было привлечено в работах отечественных авторов (Строганов, Шевякова, 1961; Строганов, 1962, Приходько, Клышев, 1964). В них было показано, что высокие концентрации NaCl ( 50 мМ) в основном при внезапном (шоковом) воздействии приводят к резкому повышению содержания путресцина или кадаверина в растениях.
Однако, в самых первых исследованиях полиаминам приписывалась исключительно негативная роль в растительной клетке, связанная с проявлением токсичности при чрезмерном их накоплении в тканях. Так, введение путресцина и кадаверина в срезанные листья ячменя, конских бобов, хлопчатника, гороха, приводило к потере в них тургора и вызывало образование некрозов (Richards, 1954; Строганов, 1962). Ингибирующее действие полиаминов установлено для прорастания пыльцы петунии, роста культуры тканей розы (Smith et al., 1985), превращения метионина в цистеин в тканях конских бобов (Шевякова, 1979). Высокие концентрации диаминов вызывали токсический эффект, индуцируя хромосомные нарушения у растений (Smith et al., 1985). Таким образом, сама аккумуляция полиаминов считалась следствием и даже отчасти критерием неблагоприятного воздействия абиотических факторов окружающей среды.
Защитные и регуляторные функции полиаминов при действии стрессоров на растения долгое время оставались вне сферы интенсивного изучения. Однако позднее был обнаружен двойственный и диаметрально противоположный эффект полиаминов на процесс адаптации растений в зависимости от их содержания: низкие концентрации этих соединений (10-100 мкм) стимулируют рост, стабилизируют полимерные структуры, тогда как высокие ( 1 мМ) - являются токсичными для растительного организма. То, что высокие эндогенные концентрации полиаминов могут быть летальными для растительных клеток и вызывать образование некрозов на листьях, показано на примере трансгенных растений, у которых регуляция биосинтеза полиаминов нарушена сверхпродукцией одного из них (Walden et al., 1997).
В настоящее время экспериментально подтверждено изменение концентраций индивидуальных полиаминов и активности ферментов их биосинтеза в растениях при целом ряде неблагоприятных условий, таких как засоление, засуха, осмотический, окислительный и тепловые стрессы, аноксия, заморозки, дефицит микро- и макроэлементов в почве, вредное воздействие гербицидов, подкисление и загрязнение среды (Шевякова, 1981; Smith, 1985; Evans, Malmberg, 1989; Reggiani et al., 1990, Bouchereau et al., 1999). Абиотический стресс различного характера вызывает значительные изменения в метаболизме полиаминов.
Так, листья овса и ячменя отвечают на дефицит калия в почве накоплением путресцина и параллельным увеличением активности АДК; подобная реакция отмечалась и в почках регенерантов табака (Young, Galston, 1983). Высокая кислотность среды также вызывает усиление активности АДК и биосинтеза путресцина у листьев овса (Young, Galston, 1983).
В условиях осмотического стресса значительное увеличение уровня путресцина и усиление активности АДК, сопровождающееся параллельным снижением количества спермидина и спермина, совпадают с появлением таких признаков стресса, как завядание и разрушение белка. Предобработка листьев овса ингибитором АДК дифлюорометиларгинином (ДФМА) перед осмотическим шоком вызывает уменьшение количества путресцина и увеличение спермина, при этом в них значительно улучшается способность синтезировать белки и РНК (Tiburcio et al., 1995). Если изолированные листья овса выдержать в растворе сорбитола в темноте, они теряют хлорофилл и быстро стареют. Старение, вызванное осмотическим стрессом, может быть замедлено путем добавления спермина в инкубационную среду, что приводит к усилению синтеза белков, РНК и ДНК, а также ингибированию рибонуклеазной и протеазной активности. Наличие информации о локусе, кодирующем АДК овса, и получение антител к данному ферменту позволило предметно исследовать изменения активности АДК при осмотическом стрессе (Bell, Malberg, 1990; Borell et al., 1996). Обработка изолированных листьев овса 0,6 М раствором сорбитола в темноте способствовала потере хлорофилла и быстрому старению листьев. При этом количество мРНК АДК значительно возрастало спустя час после инкубации и коррелировало с увеличением активности АДК. В присутствие же спермина также наблюдалось увеличение уровня мРНК АДК через час после инкубации, однако оно не сопровождалось параллельным увеличением активности этого фермента. Попытки объяснить этот феномен были предприняты при помощи использования антител. Полученные результаты свидетельствовали о значительной разнице в уровне содержания активной АДК. В присутствии экзогенного спермина количество активной формы фермента резко снижалось, в то время как прогрессировало накопление неактивного предшественника (Borrell et al., 1996).
Была предложена следующая модель регуляции экспрессии гена АДК. В отсутствии спермина при воздействии осмотического стресса активируется транскрипция гена АДК. Продуктом трансляции соответствующей мРНК является неактивный предшественник с молекулярным весом 60 кД, который затем расщепляется с образованием двух фрагментов, один из которых имеет молекулярную массу 24 кД и содержит активный сайт АДК (Malmberg et al., 1992; Malmberg and Cellino, 1994; Galston et al., 1997). Эта активная форма АДК катализирует декарбоксилирование аргинина, что приводит к чрезмерному накоплению путресцина и, как следствие, старению листьев овса. В присутствии же спермина активация транскрипции гена АДК приводит к накоплению неактивного предшественника (60 кД), что указывает на ингибирование посттрансляционной модификации фермента. В результате, несмотря на увеличение уровня мРНК АДК, количество ее активных форм снижается и, таким образом, биосинтез путресцина блокируется. Данная модель посттрансляционной регуляции спермином экспрессии гена АДК объясняет положительный эффект данного полиамина по предотвращению старения листьев овса (Borrell et al., 1996).
Условия выращивания хрустальной травки в водной культуре
Растения выращивали в водной культуре в камере фитотрона при температуре 23-25С и влажности воздуха 55% в дневное время суток. Ночью температуру и влажность воздуха поддерживали на уровне 15-17С и 70% соответственно. Для освещения использовали натриевые лампы высокого давления Reflux Н 220 мощностью 220 вт (по 2 лампы на 1,5 м ). Длина фотопериода составляла 14 часов при освещенности 350±50 мкмоль.м" .секунд" (освещенность измерена прибором фирмы LI-COR, Quantum/Radiometer/ Photometer, модель LI-189, датчик LI-COR, модель Quantum).
Для выращивания растений использовали 2-х литровые стеклянные сосуды (0=12,5 см; h=20 см), обернутые черной бумагой. Крышка сосуда представляла собой диск диаметром 15 см, изготовленный из винипласта. На диске имелось 3 отверстия диаметром 1,2 см для посадки растений. С помощью держателей из пористого полиэтилена растения фиксировали на диске. К каждому сосуду была проведена трубка с равномерной непрерывной подачей воздуха (скорость 30 мл .мин"1) для аэрации и перемешивания питательного раствора. Система подачи воздуха обеспечивалась при помощи безмасляного компрессора итальянского производства (Fiac; FX95F205). Питательный раствор. Состав и способ приготовления.
Для выращивания хрустальной травки в водной культуре использовался раствор Джонсона (Johnson, 1957), модифицированный по Winter (1973) (таб.1).
При приготовлении питательного раствора из маточных растворов в сосуды для выращивания растений наливали 2 литра дистиллированной воды, 20 мл маточного раствора №1,2 мл- №4, 2 мл - №3 и 2 мл - №2. При таком порядке внесения маточных растворов удавалось избегать образования нежелательного осадка. Питательная среда после внесения всех компонентов должна иметь рН 6,5. Посев
Семена высевали на поверхность влажного перлита в пластмассовом ящике (40x30x8см) с отверстиями на дне. Ящик закрывали сверху стеклом, и помещали в кювету. Для поддержания необходимой влажности перлита и подкормки всходов добавляли в кювету питательный раствор. Стекло снимали только после дружного появления всходов. Прореживание всходов проводили не реже 2-х раз в неделю до тех пор, пока расстояние между растениями не становилось около 3 см. К началу формирования 3-ей пары листьев, они были готовы к пересадке в водную культуру. Пересадка
С помощью шпателя растения аккуратно вынимали из перлита, стараясь не повредить корневую систему. Корневую систему погружали в емкость с питательным раствором для того, чтобы удалить не связанные с корнями частицы перлита. После этого растение вставляли в держатель из пористого полиэтилена на уровне семядоли с целью фиксации растения на крышке. Крышку с 3-мя растениями аккуратно помещали на сосуд так, чтобы корни растений были погружены в раствор. Затем сосуды с растениями накрывали на 3 дня камерой из полиэтиленовой пленки, чтобы избежать повреждения растений от излишней потери воды. Интенсивность света в этот период уменьшали в 2-3 раза по сравнению с нормой (см. выше). Уход за растениями
Питательный режим в среде культивирования растения поддерживали следующим образом: один раз в 3 дня шприцем вносили дополнительную дозу маточных растворов по такой схеме: 20 мл (№1), 2 мл (№4), 2 мл (№3), 2 мл (№2) в каждый сосуд.
Использовали водную культуру М. Crystallinum в возрасте 5-8 недель. С момента пересадки растений из перлита в водную культуру до начала эксперимента подкормка проводилась каждые три дня путем добавления маточных питательных растворов по описанной выше схеме. Для проведения экспериментов отбирали однородные по внешним показателям растения. Засоление проводили ступенчато, увеличивая концентрацию NaCl на 100 мМ каждый день до требуемой концентрации. Контрольные и произраставшие в условиях засоления растения подкармливали по обычной схеме, добавляя в исходные растворы концентрированные маточные растворы.
Образцы растительного материала для измерения титруемой кислотности отбирали в конце темнового (7.30) и в конце светового (19.30) периодов, для изучения влияния кадаверина и этилена на экспрессию гена ФЭПК - в начале темнового периода (20.30), для изучения суточных колебаний в содержании кадаверина - в течение дня и ночи, для всех остальных анализов - в 11 ч. Фиксация материала проводилась жидким азотом, после чего образцы хранили до начала анализов при - 80 С.
Для опытов с экспонированием изолированных листьев в присутствии предшественника этилена 1-аминоциклопропан-1-карбоксиловой кислоты (АЦК) и NaCl использовали 6 пару настоящих листьев САМ-растений и 3-4-ую пару молодых растений, произраставших на контрольной среде. Листья срезали и экспонировали в чашках Петри в воде (контроль) и в водных растворах с добавками: NaCl (300 мМ) или АЦК (50 мкМ) или NaCl (300 мМ) + АЦК (50 мкМ) в течение 2-х и 4-х часов в тех же световых условиях, которые указаны выше.
В опыте с ингибиторами различных компонентов фосфорилирующего каскада 3-4 пару листьев 4-5-недельных растений срезали с контрольных растений и черешками погружали в водные растворы ингибиторов на 3 ч. В темноте, после чего отделенные листья экспонировали в атмосфере этилена или на воздухе. Обработку растений экзогенным этиленом (10 мкл.л"1) проводили в герметичных стеклянных камерах (V=20 л), снабженных специальными штуцерами для ввода этилена. С помощью шприца в камеру вводили заданное количество этилена. Время обработки этиленом: 4 часа.
В специальном опыте по изучению влияния длительной обработки (14 дней) кадаверином интактных листьев на рост и развитие растений свежеприготовленный водный раствор кадаверина (1 мМ), содержащий 0,05% Твин-80, ежедневно наносили на поверхность листьев, начиная с фазы 4-5-ая пара листьев. Для этой цели использовали растения, произраставшие в водной культуре в отсутствии засоления и растения, в питательную среду которых одновременно с обработкой диамином листьев было внесено 300 мМ NaCl. Метрометрические показатели (биомасса, линейные размеры растений) и анализ содержания полиаминов проводили, когда растения перешли на САМ-тип фотосинтеза.
Особенности взаимодействия этилена и кадаверина в условиях засоления
Особое место в координации физиологических процессов у растений отводится взаимодействию полиаминов и этилена, во многом оказывающих на организм противоположные эффекты (Galston et al., 1997; Shevyakova et al., 2001; Кузнецов и др., 2002). Подавляющая часть проведенных в этом направлении исследований касается лишь полиаминов семьи путресцина, конечный этап биосинтеза которых тесно связан с образованием этилена через общий предшественник - SAM. Помимо конкуренции за SAM в стрессорных условиях между полиаминами и этиленом могут возникать реципрокные отношения, проявляющиеся во взаимном ингибировании их биосинтезов (Altman, 1986; Galston, Kaur-Sawhney, 1995). В подобных работах практически не уделялось внимания кадаверину, хотя он образуется в боковом ответвлении аспартатного пути, ведущего к биосинтезу метионина и SAM, т.е. пути биосинтеза этилена и кадаверина косвенно связаны.
Ранее было обнаружено этилен-зависимое образование диамина кадаверина у хрустальной травки в условиях гипертермии (Shevyakova et al., 2001; Кузнецов и др., 2002). Обработка хрустальной травки тепловым шоком (ТШ) приводила к транзиторной аккумуляции этилена и последующему накоплению и межорганному транспорту кадаверина.
В связи с этим представлялось важным выяснить, связана ли повышенная аккумуляция кадаверина в условиях засоления с образованием этилена. Исследование влияния засоления на содержание этилена в листьях растений хрустальной травки 2-й возрастной группы показало, что при действии NaCl содержание этилена в них возрастает (рис 17). На этом основании было высказано предположение, что у хрустальной травки сигнальным фактором, ответственным за накопление кадаверина в условиях засоления, как и в случае гипертермии, может оказаться этилен. Ранее было показано индуцирующее действие этилена на образование кадаверина в срезанных листьях ювенильных растений М. crystallinum, не содержащих кадаверин (рис. 18). Обработка листьев этиленом в этом случае приводила к резкому повышению в них содержание кадаверина, но при этом эндогенный уровень спермидина заметно снижался (Дам, 1999).
Для подтверждения индуцирующего действия этилена на образование кадаверина нами были проведены опыты с изолированными листьями (5-6 пара) взрослых растений хрустальной травки, перешедших на САМ. Для этого листья инкубировали в присутствии прямого предшественника при биосинтезе этилена в растительных клетках - АЦК, (50 мкМ) как дополнительного источника повышения его эндогенного уровня. В качестве теста на образование кадаверина использовали изменение активности ЛДК - основного кадаверин-образующего фермента в растениях.
Полученные данные (рис. 19) показали, что при экспонировании изолированных листьев растений в период С4М фотосинтеза экзогенная АЦК (50 мкМ) повышала активность ЛДК. NaCI (400 мМ) снижал активность фермента в первые 2 ч., а при инкубации листьев в течение 4 ч. Активность восстанавливалась и превосходила исходный уровень почти в 2,5 раза. Еще более высокий уровень активации ЛДК был характерен для совместного действия NaCl+АЦК (4 ч. экспозиции), что, вероятно, было вызвано более высокой эндогенной концентрацией этилена, характерной для стрессорных условий. На основании результатов данного опыта можно заключить, что стимуляция активности фермента могла быть опосредована этиленом, прямым продуктом АЦК-оксидазы, катализирующей последний этап его биосинтеза. При этом обращает на себя внимание тот факт, что инкубация изолированных листьев в присутствии предшественника этилена (АЦК) снижала содержание полиаминов, в том числе спермидина (табл. 5). Внесение в среду инкубации NaCl действовало подобным образом.
