Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Литературный обзор 10
1.1 Характеристика сырьевого потенциала птицеперерабатывающей отрасли: проблемы и перспективы 10
1.2 Современные методы биотехнологии в повышении продуктивности птицы и безопасности пищевых продуктов на ее основе 16
1.3 Обзор информации в области производства мяса птицы высокого качества, биологической ценности и безопасности при использовании кормовых добавок в опытах in vivo 28
1.4 Новые подходы к контролю безопасности мяса птицы и продуктов его переработки 40
Заключение по литературному обзору 45
ГЛАВА 2 Организация эксперимента, объекты и методы исследований 46
2.1 Организация и схема проведения исследований 46
2.2 Характеристика объектов исследования 47
2.3 Методы исследований 47
ГЛАВА 3 Биотехнология кормового комплексного ферментного препарата 60
3.1 Особенности кормового рациона цыплят-бройлеров 60
3.2 Физиолого-биохимические особенности продуцента, оптимизация и масштабирование процесса микробиологического синтеза комплексного ферментного препарата 64
3.3 Обоснование условий применения комплексного ферментного препарата 79
3.4 Совершенствование процесса получения комплексного ферментного препарата 83
ГЛАВА 4 Исследование пребиотических свойств продуктов гидролиза маннанов 91
4.1 Идентификация фракционного состава гидролизата маннана 91
4.2 Исследование пребиотической активности маннозосодержащего гидролизата 93
4.3 Влияние маннозосодержащего гидролизата на факторы неспецифического иммунитета лабораторных животных в состоянии антибиотикоассоциированного дисбиоза 98
4.4 Исследование влияния маннозосодержащего гидролизата на нормофлору цыплят-бройлеров в состоянии дисбактериоза 101
4.5 Оценка состояния микрофлоры желудочно-кишечного тракта птицы с помощью анализатора газов «МАГ-8» 105
ГЛАВА 5 Влияние комплексного ферментного препарата на метаболическую активность, масс-метрические, гистоморфологические и токсико-биохимические характеристики мяса птиц при откорме 114
5.1 Исследование влияния ферментного препарата на переваримость и использование питательных веществ рациона 114
5.2 Влияние качества откорма на продуктивность птицы 119
5.3 Исследование изменений гематологических и биохимических показателей крови птицы в зависимости от кормового рациона 124
5.4 Экономическая эффективность применения комплексного ферментного препарата в рационах цыплят-бройлеров 131
136
ГЛАВА 6 Биотехнологический потенциал мяса цыплят-бройлеров в условиях прижизненной коррекции гомеостаза при откорме
6.1. Пищевая и биологическая ценность мяса 136
6.2 Функционально-технологические свойства мяса цыплят-бройлеров 144
6.3 Оценка органолептических показателей мяса цыплят-бройлеров 148
6.4 Разработка системы мониторинга критических контрольных точек производства полуфабрикатов из мяса птицы при модифицированном откорме 158
6.5 Изучение потребительских предпочтений в области продуктов из мяса цыплят-бройлеров 166
Основные выводы и результаты 174
Список основных сокращений 177
Список литературы
- Современные методы биотехнологии в повышении продуктивности птицы и безопасности пищевых продуктов на ее основе
- Характеристика объектов исследования
- Обоснование условий применения комплексного ферментного препарата
- Исследование влияния маннозосодержащего гидролизата на нормофлору цыплят-бройлеров в состоянии дисбактериоза
Введение к работе
Актуальность работы. Программа «Развития биотехнологий РФ на период до 2020 года» (разделы «Сельскохозяйственная биотехнология», «Пищевая биотехнология») предполагает создание благоприятных условий для производства ферментов и пребиотических препаратов, использование которых позволит увеличить продуктивность, повысить конкурентоспособность мясного животноводства в РФ, исключить из кормового рациона птицы антибиотики за счет внедрения геномных и постгеномных технологий. Создание условий прогнозирования и управления качеством продукции путем прижизненной биокоррекции питательного статуса во многом определяет успех достижения безопасности и высокой биологической ценности продуктов, получения стабильного поголовья, устойчивого к стресс-факторам и заболеваниям. В последние годы три четверти от общего количества потребляемого мяса приходится на птицеводство. Доля России в мировом производстве мяса птицы составляет 5 %, что обеспечивает четвертую строчку рейтинга после США, Китая, ЕС и Бразилии. К 2020 г. объемы производства, по прогнозам экспертов, вырастут до 4,5 млн т в убойной массе.
Корма играют основную роль в формировании питательного статуса сельскохозяйственной птицы в связи с чем разработка способов повышения усвояемости комбикормов, в том числе с применением ферментных препаратов, является актуальной задачей. По оценкам аналитиков, потребность отечественного рынка в кормовых ферментах превышает 16 тыс. т, а доля препаратов российского производства составляет 6,9 %. Экспорта такого рода отечественной продукции не существует.
Степень разработанности темы. Проблемы обеспечения качества и безопасности мяса птицы и продуктов его переработки с использованием методов и объектов биотехнологии требует разработки комплексных ферментных препаратов (КФП) для птицеводства, способствующих повышению конверсии корма и сохранности поголовья птицы, а также механизмов коррекции дисбиотических состояний с помощью пребиотических препаратов. Данное направление представляет большой научно-практический интерес и отражено в работах отечественных и зарубежных ученых: Л.В. Антиповой, В.Н. Бевзюк, В.Н. Бабина, А.В. Бондаренко, Н.М. Грачевой, Д.М. Грачева, И.Ф. Драганова,
4 И.А. Егорова, О.С. Корнеевой, В.И. Криштафович, Т.С. Кузнецовой, А.В. Кулакова, С.А. Молоскина, Т.М. Околеловой, В.И. Фисинина, Б.А. Шендерова, S.A. Abramsа, P.M. Davila, G.R. Gibsonа, I.J. Griffinа, M. Hruby и многих других.
Работа выполнялась в рамках госбюджетной НИР кафедры биохимии и биотехнологии ФГБОУ ВО «ВГУИТ», а также в рамках федеральных целевых программ Минобрнауки РФ (ГК № 02.512.11.2206, ГК № П1074, ГК 16.512.11.0078).
Цель исследований – создание ферментных технологий производства модифицированных кормов для прижизненной коррекции питательного статуса птицы, улучшения функционально-технологических свойств и гарантированной безопасности мяса.
Для реализации поставленной цели сформулированы следующие задачи:
-
Обосновать выбор научного направления, объектов и методов экспериментальных исследований.
-
Разработать высокоактивный комплексный ферментный препарат, обеспечивающий ферментативный гидролиз трудногидролизуемых некрахмалистых полисахаридов в составе комбикорма для цыплят-бройлеров и условия масштабирования процесса его биосинтеза.
-
Идентифицировать фракционный состав маннозосо-держащих гидролизатов и провести оценку их влияния на микрофлору желудочно-кишечного тракта опытных животных с ан-тибиотикоассоциированным дисбактериозом.
-
Исследовать влияние маннозосодержащего гидролиза-та на факторы неспецифического иммунитета в опытах in vivo.
-
Определить состав и численность основных представителей индигенной кишечной микрофлоры цыплят-бройлеров в зависимости от фазы откорма при введении в их основной рацион маннозосодержащего гидролизата.
-
Научно обосновать и экспериментально подтвердить методологию диагностики дисбиоза сельскохозяйственной птицы на ранней стадии заболевания.
-
Исследовать влияние биомодифицированного корма на гематологические и биохимические показатели крови птицы.
-
Определить функционально-технологические свойства мяса птицы при использовании биомодифицированного корма с оценкой экономической эффективности.
9. Разработать комплект проектно-технической документации.
Научная концепция работы. Разработка подходов, принципов и методов формирования показателей безопасности и качества мяса птицы путем создания кормовых рационов с использованием объектов и методов биотехнологии.
Научные положения, выносимые на защиту:
биотехнология комплексного ферментного препарата для биодеструкции некрахмалистых полисахаридов;
пребиотические свойства и иммуностимулирующие свойства маннозосодержащего гидролизата;
методология раннего выявление дисбактериоза с помощью анализатора запахов «МАГ-8» в системе «электронный нос»;
закономерности изменения показателей кишечной микрофлоры при введении в рацион цыплят-бройлеров маннозосо-держащего гидролизата;
целесообразность применения биомодифицированного корма для стабилизации поголовья и повышения продуктивности цыплят-бройлеров;
улучшение качественных показателей, безопасности и функционально-технологических свойств мяса птицы при введении в рацион биомодифицированного корма.
Научная новизна. Экспериментально доказана и теоретически обоснована эффективность включения в рационы цыплят-бройлеров биомодифицированного комбикорма. Установлено, что введение в суточный рацион цыплят-бройлеров комплексного ферментного препарата гидролитического действия способствует гидролизу гемицеллюлозных питательных компонентов корма, представленных, в основном, ксиланами, бета-маннанами, бета-глюканами, клетчаткой и неперевариваемых желудочно-кишечным трактом (ЖКТ) птицы.
Показано, что применение биомодифицированного корма в суточном рационе цыплят-бройлеров улучшает переваривае-мость биополимеров и повышает физиологическую активность организма.
Научно и экспериментально доказано, что введение в основной рацион цыплят-бройлеров с антибиотико-ассоциированным дисбиозом маннозосодержащего гидролизата приводит к восстановлению состава и численности основных
6 представителей индигенной кишечной микрофлоры (Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp., Escherichia cоli) до показателей нормы за 5-10 дней в зависимости от фазы откорма. В опытах in vivo установлена способность маннозосодержащего-гидролизата индуцировать экспрессию про- и противовоспалительных цитокинов, что свидетельствует об его иммуностимулирующих свойствах.
Установлена зависимость образования солерастворимых белков, формирующих коагуляционно-денатурационные структуру белковых систем и консистенцию продукта, от состава кормовых рационов.
Практическая значимость работы. Результаты исследований рекомендованы к использованию в птицеводстве для повышения естественной резистентности, сохранности и продуктивности цыплят-бройлеров. Практическая значимость работы состоит в том, что применение биомодифицированного корма способствует повышению скорости роста, мясных качеств, снижению расхода корма на единицу продукции бройлеров и увеличению рентабельности производства мяса птицы. Разработки успешно апробированы в условиях предприятий ООО «Белгран-корм», ООО «Дело», ООО «Птицепром Бобровский», АНО «НТЦ «КОМБИКОРМ».
Новизна технических решений и практическая значимость подтверждены 7 патентами РФ (патент № 2392332 «Способ получения маннанов из растительного сырья», патент № 2437663 «Способ коррекции микрофлоры кишечника», патент № 2512908 «Способ производства кормов», патент № 2484129 «Способ производства биомассы аэробных микроорганизмов», патент № 2495122 «Способ получения порошкообразных ферментных препаратов», патент № 2510494 «Способ определения дисбиоза у птиц», патент № 2612783 «Способ получения кормовой добавки»). Заключены лицензионные договора (№ 22/14 от 11.06.2014 г., № 23/14 от 27.10.2014 г.) на право использования интеллектуальной собственности предприятием ООО «Машиноиспытательная станция» по патентам РФ на изобретения № 2512908, № 2484129.
Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс и используются при проведении занятий у бакалавров и магистров в качестве мультимедийного сопровождения лекционных курсов «Биотрансформация веществ», «Теоретические
7 основы направленного синтеза и управления биотехнологическими процессами», «Безопасность товаров», а также при разработке программ дополнительного образования по направлению подготовки «Биотехнология».
Методология и методы исследования. Методологическая основа исследования включает комплекс общенаучных (анализ, синтез, дедукция, проверка истинности теории путем обращения к практики и др.) и частнонаучных методов познания. Исследования проводили согласно методологии, в основу которой положен системный подход.
Соответствие темы диссертации паспорту научной специальности. Диссертационное исследование соответствует п. 3, 4, 5, 13 паспорта специальности 05.18.07 – «Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ».
Степень достоверности и апробация результатов.
Степень достоверности результатов проведенных исследований подтверждается глубокой проработкой литературных источников по теме диссертации, постановкой многочисленных экспериментов, применением современных инструментальных методов анализа, математической обработкой результатов экспериментов, публикацией основных положений диссертации.
Основные положения и результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на ежегодных международных и всероссийских научно-практических конференциях различного уровня (2003-2017 гг.) и отмечены дипломами, золотыми медалями и сертификатами участников.
Всего по теме диссертации опубликовано 135 научных трудов, в том числе, 4 учебных пособия (в соавторстве), 3 монографии (в соавторстве), 19 статей в ведущих рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК, 7 статей – в изданиях из списка Scopus, 95 научных статей и тезисов.
Структура и объем работы. Основной текст диссертации изложен на 350 страницах машинописного текста, включающих введение, 6 глав экспериментального и аналитического материала, основные выводы и результаты, список использованной литературы из 519 наименований, в том числе 192 – на иностранных языках, 10 приложений. Приведено 45 таблиц, 93 рисунка.
Современные методы биотехнологии в повышении продуктивности птицы и безопасности пищевых продуктов на ее основе
При высокой эффективности использования энергии корма птицей клетчатка переваривается максимум на 30 %, а протеин и жир в среднем на 90 % [149].
В микрофлоре зоба преобладают лактобактерии. Эти микроорганизмы способствуют ферментации корма и образованию молочной кислоты, которая снижает значение pH кишечника. рН содержимого зоба здоровой птицы равно 4,5-5,5. Содержимое зоба поступает в железистый желудок, рН содержимого которого колеблется в пределах 2,6-3,9, перемешивается с его соком и перемещается в желудок мускульный [248, 118].
Содержимое мускульного желудка поступает в тонкий кишечник и далее в подвздошную кишку. При прохождении через тонкий отдел кишечника происходит дальнейшее расщепление основных питательных веществ корма [282, 65].
На баланс микрофлоры кишечника оказывают влияние такие факторы, как кормление (смена рациона, сырье, физическая структура корма), уровень технологии содержания, особенно в периоды повышенного риска (вакцинации), микроклимат, микотоксины, инфекции (вирусные, бактериальные или кокцидиозные) и другое [261, 293, 47].
При нарушении здоровья кишечника ухудшается пищеварение и усвоение питательных веществ, что в последствии ведет к ухудшению конверсии корма, физиологического состояния, выхода, увеличению заболеваемости и падежа, снижая экономическую прибыльность производства [296, 432]. Несмотря на малую изученность вопроса, следует ожидать снижение пищевой и биологической активности источников пищи. Кроме того, недавние изменения законодательства стран ЕС, касающиеся использования антибактериальных препаратов, причина повышенных требований к здоровью желудочно-кишечного тракта птицы [341, 11, 143, 395, 418].
В настоящее время имеются сведения об идентификации микрофлоры желудочно-кишечного тракта птицы, к которой относятся бифидобактерии, лактобактерии, бактероиды, энтерококки, эшерихии, дрожжеподобные грибы и некоторые другие [160, 326].
Размножению патогенных и условно- патогенных бактерий препятствует бифидофлора в кишечнике, которая нормализует микробиоценоз кишечника. Одной из важнейшей функций бифидобактерий является их участие в регуляции иммунных функций макроорганизма [64, 281].
Молочнокислые бактерии активно участвуют в процессах протекающих в желудочно-кишечном тракте, в частности в ферментации углеводов и синтезе белка.
Эшерихии также как бифидобактерии и лактобактерии, активно участвуют в ферментативных процессах в кишечнике, образуя при этом органические кислоты, витамины и другие, биологически активные вещества [281, 326].
Внутри желудочно-кишечного тракта происходит взаимодействие между клетками организма птицы, кишечной микрофлорой, клетками бактерий и компонентами корма, нарушение которого ведет к увеличению объемов неусвоенных питательных веществ в тонком кишечнике, доступных для кишечных бактериальных микроорганизмов, что вызывает избыточный рост бактериального сообщества и, соответственно, скажется на общей биологической безопасности [94, 221, 297, 488]. Данное обстоятельство может вызвать отвод протеинов, углеводов и жиров в слепую кишку, с нарушением бактериального баланса микрофлоры и снижению функции бактериальных ферментов [290, 283]. Подобно всем животным организмам, в пищеварительных железах птицы не образуются ферменты, расщепляющие некрахмалистые полисахариды и другие сложные полисахаридные комплексы. Микрофлора желудочно-кишечного тракта, синтезирует эти ферменты недостаточно для переваривания клетчатки, что в целом снижает общую усвояемость кормов [51, 48, 49, 151].
Некрахмалистые полисахариды подразделяют на две группы - растворимые и нерастворимые. Растворимые некрахмалистые полисахариды повышают вязкость химуса, что ведет к замедлению транзита в пищеварительном тракте [249, 289].
Данные по содержанию в кормах трудногидролизуемых компонентов представлены в таблице 1.3.
Некрахмалистые полисахариды отрицательно влияют на оптимальное соотношение воды и корма, изменяют микробиологический баланс кишечника, способствуют образованию липкого помета, ухудшают качество продукции, а также микроклимат в помещениях [161, 113, 519].
Следовательно, поддержка пищеварительной системы с помощью кормовых добавок, повышающих эффективность усвоения корма стала актуальной проблемой в промышленном птицеводстве [38, 330, 307, 90, 132].
Широко используемая классификация кормовых добавок отражает скорее позиционирование продукта на рынке, чем биологические функции [71, 112]. Обычно выделяют технические добавки, действующие непосредственно на корм, например, органические кислоты; сенсорные добавки, влияющие на поедаемость корма, например, ароматизаторы; питательные добавки, обеспечивающие необходимый уровень аминокислот, витаминов и микроэлементов в рационе; зоотехнические добавки, улучшающие использование питательных веществ корма, например, ферменты; кокцидиостатики и гистомоностатики [112, 71].
Ранее, до запрета применения в Европейском союзе, выделялась также группа кормовых антибиотиков – стимуляторов роста [345].
Решение проблемы низкой эффективности использования комбикормов с повышенным вводом нетрадиционных компонентов и поиск методов удешевления кормов, повышения сохранности и продуктивности поголовья за счет использования кормовых добавок на основе комплексных ферментных препаратов представляет большой научный и практический интерес, так как ферментные процессы протекают в мягких условиях среды, не требуют агрессивных технических условий и, следовательно, высокой степенью экологичности обладают производства в которых они применяются [78, 111, 70, 106, 266, 107, 504, 336, 340]. Ферментативные процессы относятся к факторам интенсификации процессов в технологиях.
В денежном выражении, по данным аналитиков компании AB Vista, мировой рынок целлюлозолитических ферментов оценивается величиной около 550 млн дол. и проявляет тенденцию к быстрому росту. Основные потребители ферментов страны Западной Европы и Юго-Восточной Азии, а доля России не велика [336].
По оценкам аналитиков, потребность отечественного рынка в кормовых ферментах превышает 16 тыс. т [105].
Ассортимент зарегистрированных в России ферментов для кормления сельхозживотных и птицы на первое полугодие 2015 г насчитывал 145 наименований, на долю России приходится только 6,9 % (рисунок 1.7).
Характеристика объектов исследования
В соответствии со структурно-логической схемой исследований в работе предполагалось исследование комплекса показателей с применением стандартных и оригинальных методов, позволяющих получить данные о составе, свойствах и качественных показателях объектов исследований.
Культивирование микромицета Trichoderma harzianum F114 проводили глубинным способом на среде следующего состава, г/л: глюкоза - 40, дигидрофосфат калия - 1, нитрат натрия - 4, сульфат магния - 0,5, хлорид калия - 0,05, сульфат железа - 0,1. Культуру выращивали в течение 3 сут при температуре 35-37 С и рНисх 4,0±0,1 [96, 212].
Биомассу осаждали центрифугированием при 8 000 об/мин в течение 15 мин. В культуральной жидкости определяли активность целевого фермента /?-маннаназы в стандартных условиях [96]. Влияние компонентов углеродного и азотного питания на биосинтез -маннаназы исследовали на питательной среде при замене источников углерода и азота испытуемым веществом в таком количестве, чтобы их содержание во всех опытах было одинаковым (0,1 % по азоту) [212].
Подбор источника углерода осуществляли при культивировании продуцента на шейкере-качалке при 170 об/мин-1, температуре 32±1 С в колбах Эрленмейера вместимостью 500 см3 в среде Чапека. В состав среды дополнительно вводили различные источники углерода: глюкозу, маннозу, пшеничные отруби, ржаные отруби, ржаную муку, кукурузную муку, семена льна, тыквенные выжимки, свекловичный жом.
Для определения эффективности действия различных источников азота на рост T. harzianum 114, синтез маннаназы в питательную среду отдельно вводили рыбную муку, мясокостную муку, БВК (белково-витаминный комплекс), пептон, альбумин, шрот соевый.
Различные значения рН среды устанавливали добавлением 1 н HCl или NaOH. Состав питательной среды и условия культивирования варьировали в зависимости от задач и условий эксперимента. Состав рациональной питательной среды был уточнен с помощью методов математического планирования эксперимента.
Для определения маннаназной активности использовали метод Сомоджи-Нельсона [211]. За единицу активности -маннаназы принимали количество фермента, которое образует 1 мкмоль маннозы за 1 мин в стандартных условиях.
Для определения целлюлазной активности по отношению к фильтровальной бумаге использовали метод Сомоджи-Нельсона [211]. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое за 1 ч образует 1 мг глюкозы в принятых условиях.
Метод определения ксиланазной активности основан на гидролизе окрашенного ксилана с последующим определением оптической плотности образовавшегося окрашенного продукта реакции [211]. За единицу ксиланазной активности принимали количество фермента, которое гидролиз ует 1 мкмоль гликозидн ых связей ксилана за 1 мин при 40 С в принятых условиях.
Протеолитическую активность определяли модифицированным методом Ансона [211]. В супернатанте определяли количество тирозиновых остатков по методу Лоури. За единицу протеолитической активности принимали такое количество фермента, которое за 1 мин при 30 0С превращает в неосаждаемое трихлоруксусной кислотой количество казеината натрия, эквивалентное 1 мкмоль тирозина.
При определении активности -глюказидазы в качестве субстрата использовали р-нитрофенил--D-глюкопиранозид. Активность -глюкозидазы определяли по количеству отщепившегося р-нитрофенила. За единицу активности принимали количество фермента, которое расщепляло 1 мкмоль субстрата в мин при 37 С.
Оценку эффективности ферментного препарата при гидролизе некрахмалистых полисахаридов проводили по методу [250]. Для ферментативной обработки использовали оптимизированные кормовые рационы для неразделенных по полу бройлеров кросса «ROSS-308» (приложение А). Образец размалывали в лабораторной зерновой мельнице и просеивали через сито с размером ячеек 150 мкм. К 200 мкг муки приливали 4,5 мл ацетатного буфера (0,1 М, рН 4,5) и 0,5 мл раствора ферментного препарата в том же буфере (концентрация препарата 0,005, 0,025, 0,125, 0, 625 и 3,125 мг/мл реакционной смеси). Образец помещали в водяной термостатируемый шейкер и реакцию проводили при 40 0С и 200 об/мин-1 в течение 3 ч, после чего образец центрифугировали 5 мин при 15 000 g. В центрифугате определяли восстанавливающие сахара.
Содержание манноолигосахаридов определяли методом тонкослойной хроматографии [103]. Для количественной обработки хроматограмм использовали сканирующий денситометр CAMAG TLC Scanner 3. Прием данных и количественную обработку полученных результатов проводили на компьютере с использованием программы WinCATS. Для изучения пребиотических свойств маннозосодержащих продуктов осуществляли культивирование бактерий Bifidobacterium bifidum in vitro на средах с различными источниками углерода. В опытах использовались бакпрепараты B. bifidum. Препарат «Бифидобактерин сухой» (ФГУП «НПО «Микроген») предварительно растворяли в питательной среде и активизировали при температуре 37 - 38 С в течение 24 ч. Затем препарат вносили в подготовленные для культивирования питательные среды из расчета 5 доз на 1 л среды. Выращивание микроорганизмов проводили в анаэробных условиях на модифицированной среде Блаурокка.
Для определения эффективности действия различных углеводов на рост микроорганизмов B. bifidum в питательную среду поочередно включали манозу, маннозосодержащий гидролизат, инулин. Углеводы вносили в количестве 10 % по углероду в среду следующего состава: пептон - 10; NaCl - 5; агар-агар - 0,75; цистеин солянокислый - 0,1; печеночный отвар, рН 7,5. Подсчет клеток бифидобактерий проводили на фиксированных окрашенных мазках по методу Виноградского-Шульгиной-Брига.
Накопление биомассы B. bifidum определяли весовым методом, высушивая отмытые от питательной среды клетки до постоянной массы при 105 С, а также нефелометрическим путем измерения оптической плотности клеточной суспензии бактерий [276].
Обоснование условий применения комплексного ферментного препарата
При выборе сырья для выделения маннанов руководствовались такими критериями, как широкое распространение на территории Российской Федерации, низкая стоимость, высокий процент содержания маннанов в клеточной стенке. В качестве сырья для получения маннанов рассматривали широкодоступные компоненты комбикормов, такие, как жмыхи и шроты подсолнечника (рапса), отходы зерноперерабатывающей промышленности -пшеничные и ржаные отруби. Все это сырье является доступным источником получения гемицеллюлозной фракции, богатой маннанами, что значительно удешевляет продукт.
Выделение маннанов проводили в соответствии с методом [192]. Разработанный способ получения маннанов из растительного сырья позволяет получать маннан с высоким процентом выхода, снизить затраты энергии за счет проведения реакций при низких температурах, упростить процесс.
Для гидролиза полученных маннанов использовали спиртоосажденный препарат -маннаназы Trichoderma harzianum F114. Гидролизовали растворы с массовой долей маннанов 10 %. Процесс гидролиза проводили при ранее определенных рациональных параметрах действия фермента рН 4,5, температуре 60С, дозировке ферментного препарата 15 ед/г и продолжительности 4 ч [183], степень гидролиза - 95 %.
Продукты гидролиза маннанов идентифицировали с помощью тонкослойной хроматографии (рисунок 4.1). Количественную обработку хроматограмм проводили с помощью денситометра CAMAG TLC Scanner 3 (Швейцария) сразу после проведения элюирования. Экспериментальные данные показали, что в гидролизатах (n = 3, P = 0,95, r = 0,99350) присутствовали в основном манноза, маннотриоза, маннотетроза и незначительное количество других олигомеров маннозы. -маннаназа продуцируемая микромицетом Trichoderma harzianum F114, как свидетельствуют полученные результаты, является ферментом эндо-действия, что соглас уется с литературными данными [474]. Изменение фракционного состава гидролизата говорит о трансгликозилирующей способности фермента [484] (рисунок 4.2).
Поддержание нормального биоценоза организма, в частности численности и функциональной активности микрофлоры в различных отделах пищеварительного тракта, всецело зависит от нормального физиологического состояния организма.
К известным бифидогенным факторам относятся моносахариды и олигосахариды, являющиеся источником энергии для микроорганизмов.
Одним из наиболее значимых и доминирующих представителей нормофлоры является род Bifidobacterium, бактерии, которые составляют от 85 до 98 % микрофлоры кишечника. Культивирование бактерий осуществляли на средах с различными углеводами (таблица 4.1).
К 24 ч культивирования микроорганизмов количество биомассы на среде с маннозой и маннозосодержащим гидролизатом было в 1,5 раза больше по сравнению с контролем и не уступало инулину. Полученные результаты не противоречат литературным данным, согласно которым бифидобактерии потребляют ряд моносахаридов и олигосахаридов, а из полисахаридов только инулин [101, 319].
Максимальное накопление биомассы наблюдалось к 42 ч, наибольшая физиологическая активность культуры проявлялась на средах с маннозой, маннозосодержащим гидролизатом и инулином.
При сбраживании маннозы и маннозосодержащих компонентов к 24 ч процесса культивирования наблюдалось наиболее интенсивное снижение рН среды до 6,0 - 6,2. Максимальное снижение рН среды 4,8 - 5,4 на всех вариантах сред наблюдалось к 48-60 ч культивирования. Введение в состав питательной среды маннозы и маннозосодержащего гидролизата оказывало положительное влияние на морфологию бифидобактерий.
На средах с маннозой и маннозосодержащим гидролизатом В. Bifidum и Е. coli проявляли максимальную способность к росту (таблица 4.2).
Полученные результаты позволяют предположить, что маннозосодержащий гидролизат, наряду с маннозой способствует повышению резистентности пробиотиков в стрессовых для микробной клетки ситуациях. Симбиотические взаимоотношения снижались на среде с фруктозой, что отражалось в снижении плотности популяций в этом варианте опыта.
Культивирование бифидобактерий В. bifidum на средах как с маннозой, так и с маннозосодержащими компонентами способствует увеличению скорости и интенсивности их роста, что косвенно свидетельствует о пребиотических свойствах этих углеводов.
С целью исследования пребиотических свойств гидролизата в опытах in vivo, оптимальную концентрацию определяли, перорально вводя гидролизат в количестве 0,01-0,02 % к массе тела опытного животного до восстановления нормофлоры (таблица 4.3). Массовую долю гидролизата выбрали исходя из данных полученных ранее для монопрепарата маннозы [193, 220].
В период исследований мыши оставались активными, гибели мышей не было отмечено.
Пероральное введение антибиотика (10 мг/мышь, 7 дней) приводило к контаминация кишечника условно-патогенной микрофлорой. Количество E.coti в фекалиях возрастало до 10 КОЕ/г, бифидобактерии не обнаруживались при посеве совсем, а содержание лактобацилл снижалось до 103 КОЕ/г. Кроме того, в кишечнике экспериментальных животных энтерококки в количестве 109 КОЕ/г, которые редко встречаются в нормофлоре мышей.
Маннозосодержащий гидролизат в дозировке 0,02 % способствовал восстановлению микрофлоры за достаточно непродолжительное время (5 сут). При введении в рацион гидролизата в количестве 0,01 % для восстановления нормофлоры требовалось более длительное время не менее 10 дней, что является с точки зрения лечебного воздействия, а также с точки зрения экономики нецелесообразным.
Исследование влияния маннозосодержащего гидролизата на нормофлору цыплят-бройлеров в состоянии дисбактериоза
С целью оценки качественного и количественного состава микрофлоры широко применяют самые различные методы анализа, которые имеют свои преимущества и недостатки.
Из-за большой скорости метаболических процессов самая достоверная информация о состоянии желудочно-кишечного тракта может быть получена по химическому и микробиологическому составу помета. При этом значимо получение информации практически в режиме реального времени для своевременной корректировки рациона и предотвращения крайне негативного воздействия внешних факторов на птицу.
Широко используемые традиционные микробиологические методы для этой задачи не приемлемы вследствие длительности и трудоемкости. Косвенным, но не менее информативным решением является фиксирование изменений в химическом составе пробы, так как в результате развития дисбиоза или восстановления нормофлоры изменяется содержание кислот, аминов, других органических короткоцепочечных соединений. Для их детектирования возможно применение физико-химических методов анализа, требующих минимальной пробоподготовки и при этом обеспечивающих одновременный многокомпонентный анализ. Таким требованиям в настоящее время отвечают сенсорные методы анализа [476].
В связи с этим в качестве экспрессного метода контроля был выбран анализ равновесной газовой фазы над образцами с помощью экспериментального анализатора газов "МАГ-8" с методологией «Электронный нос» на основе массива газовых пьезокварцевых сенсоров. Анализатор газов позволяет за 15-20 мин без пробоподготовки зафиксировать наличие и изменение содержания в пробах кислот, спиртов, кетонов, альдегидов, аминов, аммиака.
В результате микробного метаболизма в толстой кишке образуются такие кислоты, как молочная, пропионовая; масляная, валериановая, углекислый газ, водород, вода. Углекислый газ в большой степени преобразуется в ацетат, водород всасывается и выводится через легкие, а органические кислоты утилизируются организмом.
В качестве измерительного массива в анализаторе запахов «МАГ-8» использовали сенсоры на основе пьезокварцевых резонаторов с базовой частотой колебаний 10,0 МГц с разнохарактерными пленочными сорбентами на электродах из массива «Дисбиоз».
Для формирования пленок способом «погружения в раствор» готовили растворы сорбентов с концентрацией 5–10 мг/см3 [128]. Электроды модифицированы покрытиями, чувствительными к азотсодержащим органическим соединениям, алифатическим кислотам, сложным эфирам, аминам ароматическим и алифатическим, аминокислотам, аммиаку, серосодержащим соединениям, воде. С этой целью на электроды наносятся пленки из ацетоновых растворов поливинилпирролидона (ПВП - сенсор-гигрометр № 1 позволяет определить свободную влагу в РГФ над пробой), тритона Х-100 (ТХ-100 - сенсор № 5 с покрытием, селективным к серосодержащим соединениям), полиэтиленгликольфталата (ПЭГФ – сенсор № 4 с покрытием, селективным к сложным эфирам (ацетатам), бромкрезолового синего, метилового оранжевого на подложке, сформированной из хлороформной суспензии многослойных углеродных нанотрубок (БКС/УНТ – сенсор № 7, МО/УНТ - сенсор № 3, с покрытиями, чувствительными к легколетучим органическим кислотам, спиртам), из толуольных растворов дициклогексана-18-краун-6 (18К6 - сенсор № 2 с покрытием, чувствительным к легколетучим органическим кислотам, спиртам), полиэтиленгликольсукцината (ПЭГС – сенсор № 6, чувствительный к азотсодержащим органическим соединениям, аминам, аммиаку), полидиэтиленгликольсукцината (ПДЭГС – сенсор № 8, чувствительный к азотсодержащим органическим соединениям, аминам, аммиаку) с общей массой покрытия после удаления растворителя 4–10 мкг.
Для оценки степени схожести состава РГФ над пробами анализировали «визуальные отпечатки». Форма и геометрические параметры (площадь) «визуальных отпечатков» максимумов изменялись в зависимости от фазы кормления - следствие изменения состава РГФ над пробами, а следовательно функционирования кишечника птиц. Из выборки исключены сигналы сенсоров с ПВП и ПДЭГС, так как при исключении сигналов наиболее активных сенсоров становятся заметными малые различия в составе РГФ по геометрическим параметрам.
Были выделены области на «визуальных отпечатках» максимумов, характерные для стабильного состояния функционирования желудочно-кишечного тракта исследуемых групп птиц. К 28 и 34 сут исследований, которые соответствуют II фазе откорма, пробы опытных групп достигают стабильного состояния.
Различаются «визуальные отпечатки» максимумов площадью поверхности фигуры, которые зависят от концентрации веществ в РГФ над образцами, а так же формой, которая в большей степени определяется соотношением концентраций отдельных групп соединений.
Для опытной группы 1 в начальный период исследования на 10 сут, установлено максимальное содержание таких легколетучи х веществ (ЛЛВ), как вода, кислоты, алифатические амины по сравнению с другими пробами, что характерно для исходного состояния дисбиоза в этой группе. Стабильный состав РГФ соответствовал в начальной точке исследований 2 опытной группе. К 23 дням с начала опыта состояние всех проб менялось. В контрольной и 2-й опытной группе увеличилось содержание ЛЛВ в РГФ, а в 1-й опытной группе их содержание снижалось (таблица 4.6).