Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 8
1.1. Биологически активные белки молока 8
1.2. Биологически активные белки молока в составе БАД и пищевых продуктах лечебно-профилактической направленности 26
1.3. Комплексные препараты на основе биологически активных белков молока 39
ГЛАВА 2 Объекты и методы исследования 46
2.1 Постановка эксперимента 46
2.2 Препаративные методы
2.3. Аналитические методы 51
2.4. Микробиологические методы 58
2.5 Медико-биологические исследования 59
ГЛАВА 3 Основные аспекты создания и хранения комплекса биологически активных сывороточных белков молока: лактопероксидазы, лактоферрина и иммуноглобулина G 61
3.1. Получение комплекса на основе иммуноглобулина, лактопероксидазы и лактоферрина в жидкой форме 61
3.2 Применение лизоцима в составе комплекса в качестве природного консерванта 75
3.3 Получение сухой формы комплекса «иммуноглобулин-лактоферрин-лактопероксидаза» 77
ГЛАВА 4 Изучение биологических свойств и показателей безопасности комплекса «Л-ПФИ» 80
4.1. Антиоксидантная активность 80
4.2. Антибактериальная активность 82
4.3. Биологическая ценность 90
4.4. Токсичность и физиологическая активность
ГЛАВА 5 Производство комплекса «Л-ПФИ» из вторичного молочного сырья 104
5.1. Вторичное молочное сырье-источник компонентов комплекса «Л-ПФИ» 104
5.2. Технология получения комплекса «Л-ПФИ» 106
5.3 Изучение свойств комплекса «Л-ПФИ» ПО
5.4 Изучение показателей качества и безопасности комплекса «Л-ПФИ» 116
ГЛАВА 6 Обогащение стерилизованного молока комплексом «Л-ПФИ»
6.1 Определение содержания иммуноглобулина G, лактоферрина и лактопероксидазы в молочных продуктах 119
6.2 Разработка способа обогащения стерилизованного молока комплексом «Л-ПФИ» 124
6.3 Характеристика стерилизованного молока, обогащенного комплексом «Л-ПФИ» 131
Выводы 135
Библиографический список
- Биологически активные белки молока в составе БАД и пищевых продуктах лечебно-профилактической направленности
- Микробиологические методы
- Применение лизоцима в составе комплекса в качестве природного консерванта
- Биологическая ценность
Введение к работе
Актуальность работы. Ухудшение здоровья населения, связанное с ростом вторичных иммунодефицитных состояний определяет необходимость повышения неспецифической резистентности здоровых и больных людей, улучшения функционирования естественных систем детоксикации и механизмов обеспечения иммунобиологической реактивности организма. Это становится возможным за счет использования в питании физиологичных безвредных природных соединений и их сочетаний, действие которых направлено на коррекцию поврежденных функций обеспечения гомеостаза. Биологически активные белки — полифункциональные естественные факторы защиты живых организмов, участвующие в регуляции многих физиологических и иммунологических функций, полностью отвечают данным требованиям.
В молоке биологически активные белки, каждый из которых обладает целым рядом уникальных свойств, существуют в комплексе и за счет синергетического взаимодействия образуют полифункциональный защитный фактор. Однако в настоящее время практическое применение находят в основном монопрепараты на основе очищенной формы отдельных сывороточных белков, что ограничивает их функциональные возможности и позволяет создавать продукты и БАД только для специального питания узких групп населения. Сочетание биологически активных белков молока с учетом взаимного влияния компонентов может обеспечивать возможность создания высокоэффективных биологически активных препаратов и продуктов лечебно-профилактической направленности широкого спектра действия. Переработка молочного сырья с целью получения биологически активных веществ с сохранением их биологической активности является перспективным направлением развития биотехнологии. Особый интерес среди биологически активных защитных факторов молока представляют лактопероксидаза и лактоферрин — полноценные по аминокислотному составу и характеризующиеся высокой биологической активностью сывороточные белки, а также специфические защитные факторы молока — иммуноглобулины.
В связи с этим актуальной является разработка технологии получения комплекса биологически активных белков молока с учетом природного соотношения компонентов, их взаимного влияния, биологической активности и безопасности, перспективности его применения в качестве основы БАД и продуктов лечебно-профилактической направленности, а также эффективного способа получения разработанного комплекса, входящего в схему безотходной переработки молочного сырья.
Научной базой представленного исследования явились фундаментальные работы отечественных (И.А. Рогова, В.А. Тутельяна, А.Г. Храмцова, Г.С. Комоловой, Н.А. Тихомировой, А.М. Шалыгиной) и зарубежных ученых.
Целью настоящей работы является разработка технологии получения биологически активного комплекса «иммуноглобулин-лактоферрин-лактопероксидаза» из молочного сырья, предназначенного для создания на его основе продуктов лечебно-профилактической направленности.
В соответствии с поставленной целью определены основные задачи исследований:
Экспериментально обосновать компонентный состав комплекса «иммуноглобулин-лактоферрин-лактопероксидаза» с учетом совместимости и функциональной взаимосвязи компонентов по тестам их биологической активности.
Получить готовый комплекс в жидкой и сухой формах и изучить его физико-химические свойства, питательную ценность и биологическую активность по показателям: антимикробное действие, антиоксидантная активность.
В экспериментах с животными исследовать токсичность и влияние при пероральном приеме разработанного комплекса на устойчивость к стрессовым воздействиям.
Провести изучение и обосновать условия и сроки хранения комплекса.
Разработать технологию получения комплекса из молочного сырья в рамках схемы его безотходной переработки.
Провести апробацию комплекса в технологии производства молочных продуктов, на примере стерилизованного молока, в лабораторных и промышленных условиях.
Разработать проект технической документации на производство биологически активного комплекса на основе лактоферрина, лактопероксидазы и иммуноглобулина.
Научная новизна работы.
Научная новизна представленной работы состоит в следующем:
Обоснован состав и соотношение компонентов нового полифункционального комплекса «Л-ПФИ» (лактопероксидаза, лактоферрин, иммуноглобулин), полученного в нативном виде из молочного сырья.
Установлены зависимости биологической активности компонентов «Л-ПФИ» от условий и сроков хранения комплекса.
Обнаружен синергизм в действии компонентов комплекса «Л-ПФИ» по таким значимым показателям, как антиоксидантная активность и антимикробное действие.
Показано, что разработанный комплекс при пероральном приеме повышает устойчивость животного организма к стрессовым воздействиям и физическим нагрузкам.
Теоретически и экспериментально обоснована целесообразность обогащения молочных продуктов биологически активным комплексом «Л-ПФИ» для повышения их биологической ценности.
Практическая значимость работы
Разработанная технология получения комплекса «Л-ПФИ» может быть
одним из направлений безотходной переработки молочного сырья. Она
предусматривает получение биологически активных белков в нативном виде
при сохранности качества исходного сырья, которое может быть использовано в дальнейшем для производства широкого ассортимента молочных продуктов.
Разработан проект технической документации (ТУ, ТИ) на производство биологически активного комплекса БАЛ «Л-ПФИ» из вторичного молочного сырья.
Проведена опытная промышленная выработка стерилизованного молока, обогащенного «Л-ПФИ», показавшая возможность использования разработанного комплекса для повышения биологической ценности молочных продуктов.
Подана заявка на патент на способ получения биологически активного комплекса «Л-ПФИ» (лактопероксидаза, лактоферрин, иммуноглобулин) из вторичного молочного сырья и полученный этим способом БАП. Регистрационный номер заявки 2009122405 от 11.06.2009 г.
Полученные результаты исследований внедрены в учебный процесс: разработаны и изданы учебно-методические указания к выполнению лабораторных работ для студентов, обучающихся по направлению 260100 — Технология продуктов питания по дисциплине «Биологически активные вещества сырья животного происхождения».
Работа выполнялась в рамках аналитических ведомственных целевых программ: «Развитие научного потенциала высшей школы (2007-2008)» по проекту «Исследование апо-лактоферрина коровьего молока — источника биологической основы препаратов-парафармацевтиков», «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010)» по проекту «Исследование минорных биомолекулярных белковых веществ молока и композиций на их основе, оценка биотехнологических свойств, показателей качества и безопасности, разработка прикладных основ использования».
Апробация работы. Основные положения и результаты работы доложены на: научных чтениях с международным участием, посвященных 100-летию со дня рождения П.Ф. Дьяченко (Москва, 2006 г.); научно-технической конференции «Технология живых систем» (Москва, 2008 г.); II Всероссийской научно-практической конференции детских диетологов и нугрициологов «Питание и здоровье» (Москва, 2008 г.); III Международной научно-технической конференции «Инновационные технологии и оборудование для пищевой промышленности» (Воронеж, 2009 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах, 1 методическое указание для студентов.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, аналитического обзора литературы, объектов и методов исследований, экспериментальной части, содержащей 4 главы, выводов, библиографического списка, приложений. Основной текст работы изложен на 152 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц и 36 рисунков. Библиография представлена 181 источниками, в том числе 109 зарубежных авторов, количество приложений — 5.
Биологически активные белки молока в составе БАД и пищевых продуктах лечебно-профилактической направленности
Лактоферрин присутствует в большинстве биологических жидкостей (молоке, слюне, панкреатическом и желудочном соке, выделениях из носа, бронхов и кишечника, слезной жидкости), а также во вторичных гранулах нейтрофилов [108, 179]. Установлены одинаковые физико-химические свойства и иммунохимическая идентичность экскреторного и сывороточного лактоферрина.
Количественное содержание лактоферрина видоспецифично в связи с особенностями пищеварительной системы разных видов. Лактоферрин обнаружен в молоке коров, свиней, мышей, но полностью отсутствует в молоке собак и крыс. В большом количестве лактоферрин содержится в молозиве (1280-3200 мкг/мл), при этом его уровень снижается до уровня нормального молока через 15-30 дней [73]. В грудном молоке его концентрация составляет от 1г/л до 7 г/л. Содержание лактоферрина в сыворотке крови здоровых взрослых людей колеблется от 0,13 до 1,62 мкг/мл в зависимости от этнических и географических особенностей исследуемых популяций [177].
Уровень лактоферрина в панкреатическом соке связан с различными заболеваниями поджелудочной железы. В частности, отмечен постепенный рост его концентрации в чистом секрете при хроническом калькулезном панкреатите на стадии образования протеиновых пробок, а затем камней в протоках, понижение же уровня лактоферрина выявлено при раке поджелудочной железы [60, 137].
Функциональные свойства лактоферрина необходимо рассматривать с учетом его молекулярной структуры, которая имеет две формы. Первая форма — закрытая, стабильная, относительно жесткая и устойчивая к действию протеиназы — образуется при связывании металла (обычно железа) (рис. 2). Вторая форма, которую приобретает лактоферрин без металла, является открытой, гибкой и более чувствительной к протеиназе. В обоих состояниях большая часть поверхности молекулы лактоферрина остается одинаковой, поэтому на нее не должно влиять присоединение металла. Но когда молекула переходит в открытую форму, не содержащую металл, она может обладать дополнительными свойствами [7]. К основным свойствам лактоферрина относятся антибактериальные и антивирусные активности, регуляция роста и дифференциация клеток, противовоспалительные и иммуномодуляционные характеристики. Кроме всего прочего, лактоферрин экспрессируется на поверхности слизистой, создавая бактериостатический и бактерицидный барьер между организмом и средой, участвует в транспорте и регуляции всасывания ионов железа, цинка и меди [132, 164].
Лактоферрин является белком неспецифической защиты организма от бактериальных и вирусных агентов [78]. Он отвечает за первичную защиту организма, является компонентом вторичных гранул нейтрофилов и секретируется непосредственно в очаге инфекции при развитии воспалительного процесса, причем во время воспаления количество высвобождающегося лактоферрина возрастает в десятки раз. Низкое значение рН в очаге воспаления обеспечивает минимальную активность кислых гидролаз и пероксидазы первичных гранул, что в свою очередь активирует лизоцим и лактоферрин во вторичных гранулах, и эти реакции характерны для начального периода фагоцитоза [96].
Лактоферрин обладает способностью соединяться со многими типами клеток, включая макрофаги, моноциты, активированные лимфоциты, которые являются ключевыми компонентами в реакции иммунной системы человека [143]. Отмечена стимуляция природных клеток-киллеров как in vitro, так и in vivo [115]. Выявлен ряд ингибирующих влияний лактоферрина на различные звенья иммунных и воспалительных реакций, при этом ингибирующее действие находится в обратной зависимости от степени насыщенности его железом [113,163].
Лактоферрин обладает способностью активировать клеточный рост. Так, развитие желудочно-кишечного тракта новорожденных животных, вскармливаемых материнским молоком, интенсивнее, чем у вскармливаемых молочными смесями. Было показано, что лактоферрин человека является фактором роста, так как активирует синтез ДНК в клетках крысы, причем такая способность лактоферрина не зависит от наличия связанного железа [156]. В последние годы были проведены исследования, подтверждающие возможность использования лактоферрина, как стимулятора роста. В частности что касается костной ткани отмечена стимуляция дифференцировки и уменьшение апоптоза остеобластов. У мышей доза лактоферрина 4мг в четыре раза усиливала формирование костной ткани [8].
Благодаря способности связывать железо и препятствовать реакции регенерации двухвалентного железа лактоферрин обладает антиоксидантной активностью. В результате концентрация Fe при захвате лактоферрином снижается до 10_18М, что приводит к ингибированию образования свободных радикалов — гидроксилрадикалов и супероксидных ионов. В работе [9] было исследовано влияние препаратов лактоферрина из молозива человека на интенсивность свободнорадикальных процессов в модельной системе реакции Фентона и в суспензии желточных липопротеинов. Установлено, что лактоферрин ингибировал свободнорадикальные процессы в модельной системе реакции Фентона в 4,7 раза. Аполактоферрин обладал большей эффективностью по сравнению с лактоферрином из молозива на 45% насыщенного Fe3+ и менее способного к его связыванию. При 100%-ом насыщении лактоферрина железом, его антиоксидантные свойства снижались, но при этом интенсивность хемилюминесценции на 23,7% была меньше, чем в контроле, что говорит о выраженном антирадикальном эффекте, реализующемся разными способами.
Лактоферрин оказался более эффективным, чем традиционные ловушки свободных радикалов (гистидин, манитол), так как кроме способности связывать железо, он снижал уровень НОг-радикалов в системе реакции Фетона. Антирадикальные свойства лактоферрина позволяют считать его компонентом сложной системы эндогенных антиоксидантов, поддерживающей уровень свободнорадикальных процессов на безопасном для биологических структур уровне [80, 131].
Лактоферрин является одним из ведущих молекулярных факторов, сдерживающих размножение и рост бактерий, низших грибов, что объясняется его способностью снижать их резистентность к токсическому действию химических реактивных производных кислорода, создавать и поддерживать дефицит железа и тем самым лишать многих грамположительных и грамотрицательных бактерий необходимых для их роста и жизнедеятельности микроэлементов, входящих в состав цитохромов дыхательной цепи [175]. Помимо этого лактоферрин вызывает изменение проницаемости наружной мембраны некоторых грамотрицательных бактерий, что может быть результатом неспецифического связывания с лактоферрином ионов кальция и магния [78, 96]. Лактоферрин способен выщеплять молекулы липосахаридов (эндотоксинов) из наружной мембраны грамотрицательных бактерий, что происходит в результате связывания им Mg и Са , которые стабилизируют наружную мембрану. Возможно взаимодействие электростатического характера слабоосновного лактоферрина (pi 8,5) с карбоксильными группами в составе мембраны. Так же не исключена вероятность, что дезорганизация оболочки бактерии приводит к активации вещества, вызывающего аутоповреждение. Бактерицидные свойства лактоферрина в отношении некоторых видов микроорганизмов могут быть также объяснены образованием коротких основных (катионных) пептидов N-концевых участков белка путем ограниченного протеолиза [88]. Пептиды лактоферрина крупного рогатого скота с аминокислотной последовательностью 1-54 и более короткий 1-41, так называемый лактоферрицин В, обладают еще большим, чем лактоферрин бактерицидным
Микробиологические методы
В обезжиренное молоко вносили раствор соляный кислоты (4% по объему молока) и проводили осаждение казеина. Полученную молочную сыворотку подщелачивали до рН=6,8 и для получения иммуноглобулиновой фракции подвергали ультрафильтрации, используя мембрану селективностью ЮОкДа. Для обеспечения микробиологической чистоты полученной фракции выделенные иммуноглобулины подвергали холодной стерилизации с применением керамических мембран с селективностью пор 0,2 мкм (давлении 0,005-0,2 мПа) и отправляли на промежуточное хранение. Пермеат подвергали повторной ультрафильтрации через мембраны с селективностью 30 кДа. Из полученного концентрата с использованием метода катионнообменной хроматографии на карбоксилметилагарозе выделяли лактопероксидазу и лактоферрин [85]. Для этого фильтрат, полученный при ультрафильтрации (на фильтре с селективностью пор 30 кДа), растворяли в дистиллированной воде, с последующим введением в раствор подготовленной агарозы («Bio Rad», США).
Агарозу предварительно отмывали на стеклянном фильтре сначала трехкратным объемом дистиллированной воды, а затем 0,05 М калийфосфатным буфером (рН = 6,7). После суспендирования агарозы в белковом растворе измеряли значение рН раствора и при необходимости доводили его до значения рН = 6,7. Сорбцию проводили в течение 2 часов при периодическом помешивании. После 60 мин отстаивания из системы удаляли основную часть сыворотки. Оставшуюся часть сыворотки с агарозой промывали на керамическом фильтре пятью объемами калийфосфатного буфера (рН = 6,7). Агарозу упаковывали в хроматографическую колонку (2,5 50см). Колонку промывали тремя объемами калийфосфатного буфера со скоростью 150 мл/ч и элюировали белки NaCl с градиентом 0,35М до 1М со скоростью 90 мл/ч. Были получены две фракции с A2so 0,l, которые собирали и диализовали против дистиллированной воды при температуре +4С, в течение 12 часов. Для обеспечения микробиологической чистоты проводили микрофильтрацию полученных растворов через мембраны с размером пор 0,2-0,3мкм (Millipore, США).
В качестве одного из наиболее щадящих способов консервирования растворов белковых препаратов применяли лиофильное высушивание. Эта технология включает два основных этапа — предварительное замораживание высушиваемых материалов до температуры минус 20-25С в среде жидкого азота и последующее удаление замороженной части влаги в вакууме при температуре минус 20±4С и температуре досушки плюс 37±2С, в результате получают сухой препарат белка. Флаконы с полученным препаратом герметично укупоривали и маркировали и хранили до использования при температуре 4-6С.
Определение массовой доли общего белка Белок в исследуемых образцах определяли по методу Лоури, а так же, в ряде случаев, спектрофотометрическим методом по Калькару, используя формулу: С(мг/см3)=1,45 А280 — 0.74 А260, где С-концентрация белка, А2бо, A2S0 — оптическая плотность белкового раствора при длинах волн 260 и 280 нм соответственно. Определение ферментативной активности лактопероксидазы Метод основан на свойстве лактопероксидазы катализировать окисление перекисью водорода фенолов, ароматических аминов [82]. В качестве субстрата использовали диаммониевую соль 2,2 — азино-ди-Зэтил-2,3-димдробензо-тиазолин-6-сульфоновой кислоты (ABTS). Анализ исследуемых образцов: 1. Вносили 2,25 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН = 6.4), 150 мкл 10 мМ раствора Н2Ог, 150 мкл ABTS в пробирку на 10 мл; 2. Перемешивали смесь растворов на мешалке (миксер ВП); 3. Оставляли смесь при комнатной температуре на 15 мин; 4. После того как температура смеси достигла комнатной, ее переливали в кювету спектрофотометра (толщина слоя 1 см); 5. Реакцию инициировали добавлением в кювету 10 мкл исследуемого образца; 6. Измеряли оптическую плотность опытной пробы против контрольной при длине волны 436 нм. Оптическую плотность измеряли с тридцатисекундным интервалом. Контрольную пробу готовили также как и опытную, но вместо исследуемой жидкости добавляли 10 мкл дистиллированной воды. Активность фермента рассчитывают по формуле: A = AD436/E, где А — активность фермента, выраженная в международных единицах, мкмоль/ мин см ; AD436 — изменение оптической плотности за 1 мин при длине волны 436нм; Е — коэффициент экстинкции субстрата, который для ABTS при длине волны 436 нм равен 29 500 л / моль. При расчете величины активности лактопероксидазы анализируемого образца учитывали разведение пробы. А =д п где Аисх — ферментативная активность исследуемого образца; п — ферментативная активность разведенного в п раз раствора. Определение иммуноглобулина Для определения иммуноглобулина в работе использовали твердофазный, конкурентный, гетерогенный ИФА (ELISA — enzyme-linked immunosorbent assay) — определение фермента, связанного с иммуносорбентом [106]. s В основе метода имму но ферментного анализа лежит конкуренция за связывание с коньюгатом Атиг-ПХ между антигеном (иммуноглобулин G), сорбированным на дне лунки планшетов, и анализируемыми образцами, вносимыми в те же лунки (рис. 4).
Применение лизоцима в составе комплекса в качестве природного консерванта
Для увеличения хранимоспособности компонентов комплекса «лактопероксидаза — лактоферрин — иммуноглобулин G» применяли коммерческий препарат лизоцима из белка куриных яиц (Sigma, Бельгия). Как уже отмечалось ранее, лактопероксидаза является наименее стабильным компонентом изучаемого комплекса, в связи с этим она была выбрана в качестве тестового компонента для определения консервирующего эффекта лизоцима при введении его в состав комплекса.
В таблице 5 приведены данные экспериментов по определению длительности сохранности ферментативной активности лизоцима и лактопероксидазы в монопрепаратах и комплексе.
Полученные данные указывают на то, что уровни активности лизоцима в монопрепарате и комплексе изменялись практически одинаково. Следует отметить, что лизоцим в процессе хранения при комнатной температуре характеризовался большей способностью к сохранению активности, чем при температуре плюс 4±2С. Время 50% инактивации составило 23,9+0,80 и 83,1+1,50 часов, соответственно. Полученные данные позволяют сделать вывод о проявлении «автозащитного эффекта» лизоцима, который, вероятно, перекрывает негативное влияние на хранение белкового раствора температуры более благоприятной для развития микрофлоры, чем при плюс 4±2С. Применение лизоцима способствовало стабилизации сохранности активности лактопероксидазы при различных температурных режимах Защитный эффект лизоцима в отношении лактопероксидазы в наибольшей степени проявлялся при комнатной температуре по сравнению с холодильными условиями хранения. Так, увеличение времени 50% инактивации лактопероксидазы составило 24.8 и 5.2 часов, соответственно. При этом лактопероксидаза в составе комплекса оказывала незначительное влияние на сохранность лизоцима.
Анализ данных указывает на перспективность применения лизоцима в качестве консервирующего агента с целью пролонгирования сроков хранения жидкой формы комплекса сывороточных белков.
Как было определено выше, в процессе длительного хранения комплекса «иммуноглобулин-лактоферрин-лактопероксидаза» происходит значительная потеря биологической активности его компонентов. Одним из путей решения данной проблемы является применение лиофилизации для обеспечения длительных сроков сохранности биологически активных композиций с минимальной потерей нативных свойств их компонентов. При сублимационном способе высушивания температура обезвоживаемого материала в течение всего периода удаления свободной воды остается ниже температуры замерзания, вследствие чего белки не подвергаются денатурирующему действию повышенных концентраций электролитов и сохраняют биологическую активность в обычных условиях длительное время.
Перед высушиванием комплекс подвергали быстрому замораживанию в жидком азоте при температуре минус 195С. Последующую сублимационную сушку проводили в рабочей камере сублимационной установки при температуре сублимации минус 20±2С и максимальной температуре досушки плюс 35±2С. Рисунок 15 — Содержание лактопероксидазы, лактоферрина и иммуноглобулина G в составе комплекса (сухая форма) в процессе хранения при температуре плюс 20±2С (а) и плюс 4±2С (б). По оси абсцисс — время хранения (месяцы); По оси ординат — биологическая активность компонентов (%). За 100% принята биологическая активность компонентов в исходном комплексе. Э Лактоферрин Щ Иммуноглобулин G Ш Лактопероксидаза Сравнительный анализ данных, полученных в ходе определения свойств компонентов комплекса до и после лиофильной сушки, показал, что при применяемых режимах лиофилизации потери биологической активности компонентов не превышали 13%. В наименьшей степени ингибировалась активность иммуноглобулина G, в наибольшей — лактопероксидазы, что согласуется с данными, полученными в ходе изучения сохранности компонентов комплекса в жидкой форме.
Проводили изучение хранимоспособности комплекса «иммуноглобулин-лактоферрин-лактопероксидаза», полученного в сухой форме. Комплекс хранили 0,5,1,3,6,12 месяцев при температурах плюс 4±2С и плюс 20±2С(рис. 15).
Изучение сохранности полученного комплекса показало, что при температуре плюс 4±2С его компоненты длительное время сохраняли биологическую активность. Через 1 месяц потеря активности была незначительной и составляла от 5% (лактоферрин) до 17% (лактопероксидаза). Наименьшей стабильностью в процессе хранения сухой формы комплекса отличалась лактопероксидаза, а наиболыпей-иммуноглобулин. Однако через год потеря нативности иммуноглобулина приближалась к 50%.
При комнатной температуре лиофилизированная форма изучаемого комплекса хранилась хуже, чем в холодильнике. Уровень активности наиболее лабильного компонента комплекса — лактопероксидазы снизился на 6% (р 0,05) уже через месяц хранения, через 3 месяца она приблизилась к 50%. Через год остаточная активность лактопероксидазы составила всего около 17%, в то время как этот показатель для лактоферрина и иммуноглобулина составлял 68% и 58%, соответственно.
Высокий уровень ферментативной активности и отсутствие изменений органолептических, физико-химических и микробиологических показателей в процессе хранения сухой формы комплекса позволяют говорить о целесообразности применения лиофилизации в качестве эффективного способа консервирования сывороточных белков молока.
Биологическая ценность
Проведенные исследования (Глава 3,4) показали, что созданный биологически активный комплекс «Л-ПФИ» является высокоэффективным полифукциональным препаратом, обладающим широким спектром физиологического действия. Однако ввиду высокой стоимости коммерческих монопрепаратов промышленное производство биологически активных композиций на их основе является экономически нецелесообразным, поэтому была проведена работа по созданию безотходной высокоэффективной технологии переработки молочного сырья, позволяющей получать в нативном виде такие биологически активные белки молока, как лактопероксидаза, лактоферрин и иммуноглобулин G.
С целью подбора оптимального источника получения компонентов биологически активного комплекса «Л-ПФИ» было изучено содержание их во вторичном молочном сырье. На содержание ЛП, ЛФ, ИГ G были проанализированы обезжиренное молоко, творожная и посырная сыворотки. Результаты исследований представлены в таблице 9.
Из данных, представленных в таблице видно, что в обезжиренном молоке присутствуют все изучаемые биологически активные белки. При этом обезжиренное молоко значительно превосходит по их содержанию различные виды сыворотки. Снижению уровня биологически активных белков во вторичном молочном сырье, в частности сыворотке, способствуют технологические факторы, применяемые при производстве молочных продуктов (высокие температуры, изменение рН среды и т.д.), вызывающие денатурационные изменения в молекуле белков.
Полученные нами результаты свидетельствуют об отсутствии ЛП во всех видах сыворотки. Поскольку лактопероксидаза является термолабильным белком, то температурные режимы, применяемые при производстве творога и сыра, приводят к значительному снижению ее активности.
Кроме того, высокотемпературное воздействие на этапе пастеризации молока усугубляется последующим изменением рН среды в результате сквашивания, что в свою очередь, приводит к ее полной инактивации.
Содержание лактоферрина в сыворотках также незначительно по сравнению с обезжиренным молоком.
Иммуноглобулин менее чувствителен к технологическим факторам, чем ЛП, но и в этом случае отмечается значительное снижение уровня иммунного белка в исследованных образцах. Критическим условием в этом случае является снижение рН среды при сквашивании молока. Есть основание полагать, что после температурной обработки молекулы иммуноглобулина вследствие определенных конформационных изменений, еще не приводящих к необратимым нарушениям, становятся более чувствительными к денатурирующему влиянию повышенной кислотности среды при сквашивании.
Таким образом, обезжиренонное молоко является наиболее перспективным источником выделения биологически активных белков. Технология получения комплекса «Л-ПФИ» из обезжиренного молока состоит из ряда последовательно осуществляемых операций (рис. 27) В качестве сырья для производства комплекса «Л-ПФИ» используют молоко коровье натуральное в соответствии с ФЗ РФ 88 «Технический регламент на молоко и молочные продукты».
Для получения комплекса «Л-ПФИ» молоко натуральное с нативными биологически активными белками подогревают до 40-45С и направляют на сепарацию, в результате чего получают сливки и обезжиренное молоко.
Сливки направляют на производство сливочного масла, а обезжиренное молоко, полученное после сепарации, подвергают кислотной коагуляции под действием 0,1 М раствора соляной кислоты. Полученную сыворотку охлаждают до температуры 6±2С с последующим добавлением 0,1 М раствора NaOH до значения рН=6,8, что обеспечивает ренатурацию частично денатурированных сывороточных белков. После тщательного перемешивания сыворотку подвергают ультрафильтрации на установке, вкулючающей три секции (Приложение В). На первой стадии для получения иммуноглобулиновой фракции сыворотку пропускают через полисульфонамидные мембраны с селективностью пор ЮОкДа, при давлении 0,3-0,8 МПа. В результате ультафильтрации получают две фракции — очищенную фракцию иммуноглобулина и пермеат I. Иммуноглобулиновую фракцию подвергают холодной стерилизации с применением керамических мембран с размером пор 0,2-0,Змкм и при давлении 0,05-0,2МПа и направляют на промежуточное хранение в аспетических условиях.
Полученный на первой стадии ультрафильтрации пермеат I, содержащий лактозу, минеральные вещества и белки с молекулярной массой менее 100 кДа, направляют во вторую секцию ультрафильтрационной установки. Обработка пермеата производится с применением полисульфонамидных мембран, с селективностью пор 30 кДа и при давлении 0,3-0,8 МПа. В результате получают белковую фракцию, содержащую в нативном виде биологически активные белки с молекулярным весом более ЗОкДа. Для разделения полученного белкового концентрата и выделения очищенных фракций лактопероксидазы и лактоферрина применяют метод катионнобменной хроматографии на карбоксиметилагарозе и элюируют градиентом NaCl от 0,35М до 1М. Две полученные фракции с Aaso 0,1 собирают отдельно в разные емкости и проводят диализ их против дистиллированной воды. Для обеспечения микробиологической чистоты проводят микрофильтрацию полученных фракций через керамические мембраны с селективностью пор 0,2-0,3 мкм (давление 0,05-0,2МПа) и направляют на промежуточное хранение в асептических условиях.
Выделенные монофракции лактопероксидазы и лактоферрина, а также полученную ранее фракцию иммуноглобулина смешивают в среде физиологического раствора в соотношении, соответствующем этому показателю в свежевыдоенном коровьем молоке. Смешивание монофракций осуществляется с помощью дозирующего устройства в аспетических условиях. Полученный стерильный комплекс «Л-ПФИ» расфасовывают в стеклянные флаконы и подвергают замораживанию до температуры минус 20-25С с последующей лиофилизацией при температуре минус (20±4)С. Досушка осуществляется при температуре плюс (37±2)С до остаточной влажности 4%. Общая продолжительность процесса сушки 6 часов.
