Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Источники коллагенов 10
1.2 Современные представления о структуре и свойствах коллагенов 14
1.3 Опыт и тенденции применения коллагеновых субстанций в отраслях экономики 32
ГЛАВА 2. Постановка эксперимента, объекты и методы исследований
2.1 Характеристика объектов исследований и условия эксперимента 42
2.2 Порядок проведения экспериментов 43
2.3 Общие методы исследования 45
2.4 Инструментальные и специальные методы исследования 47
ГЛАВА 3. Исследование сырья и обоснование параметров получения коллагеновых дисперсий
3.1 Обоснование выбора источников рыбного коллагена 57
3.2 Гистоморфологическая характеристика и химический состав исследуемого сырья 58
3.3 Исследование условий и разработка режимов получения коллагеновых дисперсий 62
3.4 Идентификация структурных особенностей коллагена 71
3.5 Оценка качества и безопасности коллагеновых дисперсий 72
ГЛАВА 4. Исследование свойств коллагеновых субстанций
4.1 Определение аминокислотного состава 76
4.2. Исследование электрофоретической подвижности коллагеновых белков 77
4.3 Электронно-микроскопический анализ коллагеновых дисперсий 78
4.4 Сравнительная оценка суммарных ароматов коллагеновых дисперсий различного происхождения 82
4.5 Изучение структурообразования коллагеновых дисперсий 86
ГЛАВА 5. Разработка рекомендаций по рациональному применению коллагеновых дисперсий
5.1 Использование коллагеновых дисперсий в технологиях пищевых продуктов 95
5.2 Проведение технических и токсикологических испытаний в рамках доклинических исследований 102
5.3 Применение коллагеновых дисперсий в качестве биологически активного компонента косметических средств 106
Выводы 113
Список используемых источников
- Опыт и тенденции применения коллагеновых субстанций в отраслях экономики
- Общие методы исследования
- Исследование условий и разработка режимов получения коллагеновых дисперсий
- Сравнительная оценка суммарных ароматов коллагеновых дисперсий различного происхождения
Введение к работе
Актуальность работы. Рыба и рыбные продукты являются важным компонентом в пищевом рационе, а для населения ряда стран -основным продуктом питания. Сложившаяся политическая ситуация и санкции Евросоюза, США и других сторонников существенно отразились на жизни нашей страны. Продуктовое эмбарго лишило Россию ряда импортного сырья и продуктов, в том числе рыбных. Поэтому развитие прудового рыболовства и аквакультуры является актуальным, перспективным и поддерживается Правительством РФ, о чем свидетельствуют важнейшие стратегические документы: «Водная стратегии Российской Федерации на период до 2020 года», «Стратегия развития рыбохозяйственного комплекса Российской Федерации на период до 2020 года», «Доктрина продовольственной безопасности Российской Федерации на период до 2020 года» от 24 апреля 2012г. №1853п-П8.
Производство прудовой рыбы постоянно растет. Этому способствует увеличивающийся спрос на недорогую рыбу и умелое использование экономических рычагов для развития отрасли.
Увеличение производства подразумевает разделку и
переработку, а, следовательно, большое количество побочных продуктов, которые в лучшем случае идут на удобрения или кормовую муку, а в худшем просто на свалку. Многие из этих отходов содержат функциональный биополимер коллаген – белок, который благодаря своим уникальной структуре и физико-химическим свойствам нашел применение во многих отраслях промышленности.
В России и за рубежом значительный вклад в изучение источников, свойств, способов получения и применения коллагенов внесли работы Л.В. Антиповой, А.И. Сапожникова, И.А. Глотовой, О.П. Дворяниновой, С.А. Сторублевцева, Ю.В. Болтыхова, А.Г. Хаустовой, Н.В. Черниги, Э.М. Расулова, В.И. Воробьёв, А.Д. Неклюдова, G,Y Li, A.K. Lampe,M. Ruehl и др.
На сегодняшний день в России имеется всего два предприятия,
производящих коллаген: ОАО «Лужский завод «Белкозин»» (г. Луга
Ленинградской области), построенный еще в советский период и
крупнейший в России промышленный комплекс по производству
коллагена на базе Верхневолжского кожевенного завода в г.
Осташкове Тверской области, открывшийся в феврале 2015 года. До
его появления практически весь коллаген импортировался
российскими пищевыми заводами из Бразилии и стран Европы. Оба предприятия используют коллагенсодержащее сырье животного происхождения, преимущественно спилок шкур крупного рогатого
скота. Проблемы, связанные с бешенством с/х скота в Европе, создали непреодолимые трудности в поставками этих продуктов в Россию.
В связи с этим чрезвычайно актуален поиск новых источников коллагеновых белков и исследование их свойств, где внимание привлекают рыбные источники
Они открывают перспективы создания отечественного производства коллагеновых белков на основе методов биотехнологии и принципах ресурсосбережения.
Диссертационная работа проводилась в рамках Государственного задания №2014/22 НИР №3017 «Биотехнологии переработки сельскохозяйственных животных и рыб в обеспечении продовольственной безопасности страны».
Цель работы - состоит в обосновании условий создания отечественного производства коллагеновых субстанций рыбного происхождения для обеспечения различных секторов экономики.
В рамках поставленной цели были сформулированы и решались следующие основные задачи:
провести патентно-информационный поиск, обосновать выбор сырьевых объектов;
гистоморфологическая характеристика, химический и фракционный состав рыбных шкур как источника функциональных биополимеров;
разработать технологию получения коллагеновых белков, обосновать параметры и режимы обработки рыбных шкур;
идентифицировать и изучить свойства коллагеновых дисперсий;
выявить структурные особенности коллагеновых белков животного и рыбного происхождения;
оценить биологическую безопасность в опытах in vivo и функциональную эффективность коллагеновой дисперсии;
разработать практические рекомендации по использованию рыбных коллагенов в пищевой промышленности и при получении косметических средств;
разработка проекта технической документации на новый вид продукции; провести апробацию результатов исследований, дать оценку экономической эффективности новых технических решений.
Научная новизна
Результаты информационно-патентного поиска показали целесообразность использования рыбного сырья в качестве альтернативного источника коллагеновых белков. На основании гистоморфологической идентификации коллагеновых белков в рыбных
побочных продуктах переработки, анализа общего химического
состава, количественного соотношения фракций, аминокислотного
состава белков в качестве источника предложено использовать шкуру
толстолобика – наиболее распространенной рыбы прудовых хозяйств
ЦЧР. Выявлены закономерности растворения коллагеновых белков
шкуры под действием химических реагентов в результате чего
обоснованы условия получения коллагеновых дисперсий.
Идентификация состава аминокислот показала близость к аналогам
животного происхождения, отклонения обозначают особенности
физико-химических свойств методом электрореза и атомно-силовой
микроскопии доказано, что для рыбных коллагенов характерна более
выраженная электрофоретическая подвижность, молекулярная масса
лежит в области 212 кДа, рыбные коллагены характерны
выраженными ФТС. Комплекс свойств рыбных коллагенов позволяет обосновать рациональные пути использования в качестве пищевой добавки, съедобных покрытий и в составе основ для косметических средств. Коллагеновые субстанции безопасны, что доказано в опытах in vivo на теплокровных животных.
Практическая значимость Разработана технология,
отвечающая принципам рационального природопользования,
обеспечивающая получение биологически безопасной и эффективной коллагеновой дисперсии для получения пищевых продуктов и косметических средств.
Разработан проект технической документации на субстанцию
коллагеновую (ТУ 9283-001-02068108-2015). Проведена
промышленная апробация производства рыбных котлет в
коллагеновом пленочном покрытии в кафе «Виктория», г. Бобров
(Воронежская обл.), коллагеновой дисперсии рыбного происхождения
ООО «ЛДЦ Альдомед плюс» г. Лиски (Воронежская обл.); ИЦ
«Бирюч» (Белгородская обл.) подтвердившая положительные
результаты исследований.
Научные положения, выносимые на защиту.
технология получения коллагеновых дисперсий;
результаты сравнительного анализа свойств коллагенов животного и рыбного происхождения;
обоснование технических решений по применению коллагеновых дисперсий в получении функциональных пищевых продуктов и косметических средств.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Диссертационная работа соответствует 3, 5, 10 и 14 пунктам паспорта специальности 05.18.07 - «Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ».
Апробация работы Основные положения и результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на международных, всероссийских научно-практических конференциях и семинарах: «Научные перспективы ХХI века. Достижения и перспективы нового столетия» (Новосибирск, 2015), International congress industrial-academic networks in cooperation activities for Pharmaceutical, chemical and food fields (L`Aquila, 2014), «Продовольственная безопасность: научное, кадровое и информационное обеспечение» (Воронеж, 2014), «Российская аквакультура: состояние, потенциал и инновационные производства в развитии АПК» (Воронеж, 2012), «Биология – наука ХХI века» (Пущино, 2015), «Инновации и решения в косметической индустрии» (Воронеж, 2015), «Инновационные разработки молодых ученых воронежской области на службу региона» (Воронеж, 2015) (представленная работа стала победителем), LIII отчетной научной конференции преподавателей и научных сотрудников ВГУИТ за 2014 г.;
Разработка экспонировалась на 6-ой межрегиональной
специализированной выставке «Ваше здоровье» в рамках 4-го
социального форума «Здоровый мир – курс на долголетие (г. Воронеж,
2014 г.), VII выставке-фестивале моды и красоты «Идеаль» (21
23.11.2014г.) (получена награда «За инновационный продукт
отечественного производства»)
По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 1 статей и тезисов докладов, подана заявка на патент РФ.
Структура и объем работы Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, выводов, списка литературы из 149 наименований и 4 приложений. Основное содержание работы изложено на 159 страницах машинописного текста, содержит 47 рисунков и 26 таблиц.
Опыт и тенденции применения коллагеновых субстанций в отраслях экономики
Коллагены широко применяются в различных областях промышленности. Однако, производители, как правило, не акцентируя внимание на том, какой именно вид коллагена добавлен в тот или иной продукт.
На современном рынке фигурируют три разновидности коллагена: животный, морской и растительный.
Наиболее известным, изученным и применяемым является животный коллаген, который начали получать с 30-х годов ХХ века из отходов кожевенного производства (краевые участки шкур, гольевой спилок шкур, гольевая спилковая обрезь шкур, сухожилия крупного рогатого скота (КРС), гольевой спилок шкур свиней) и отходы мясной промышленности (костная ткань) [138]. Но из-за губчатой энцефалопатии (болезни бешенства КРС) и угрозы передачи вируса человеку, коллаген животного происхождения снят с производства в западных странах. [41,73,90,92] По мнению Сапожниковой А.И., попадание шкур от больных животных на предприятия по переработке кожевенного сырья, где в результате операций золения и двоения шкур образуются гольевая спилковая обрезь, являющаяся сырьем для получения коллагена, полностью исключено благодаря тщательному многократному ветеринарно-санитарному контролю. Кроме того в процессе получения коллагена животное сырье подвергается действию концентрированных щелочей и органических кислот [125]. По мнению других источников [74], прионы (безвредные клеточные белки, обладающие природной способностью превращаться в устойчивые структуры, вызывающие смертельно опасные заболевания, в том числе коровье бешенство. Они не содержат нуклеиновые кислоты, чем и отличаются от известных микроорганизмов: вирусов, бактерий, грибков), устойчивы к распространенным методам дезинфекции: высоким температурам, замораживанию, высушиванию, химической обработке спиртами, формальдегидом, кислотами, и ферментами. Даже автоклавированием (134 C - 18 минут) не достигнуть полного разрушения прионов, способность которых вызвать заражение сохраняется.
Некоторые специалисты считают, что в коллагене наземных животных меньше полезных свойств, нежели в растительном и морском. Из-за большого размера молекул он не доступен глубоким слоям кожи. Но подобный вид коллагена отлично подходит для производства косметических средств в сфере ногтевой и парикмахерской индустрии, где необходим поверхностный эффект. Поэтому его добавляют в препараты для восстановления структуры волос, смягчения кожи рук, стоп, области локтей. [89]
Морской коллаген начали добывать из кожи морских рыб примерно с 70-х годов ХХ века. Многие исследователи уделяют ему особое внимание, потому что рыбий коллаген минимально отличается от человеческого. И, на удивление, более приближен к нему по биохимическому составу, чем коллаген крупного рогатого скота. Однако для того, чтобы косметика с морским коллагеном была действительно эффективной и оказывала выраженное омолаживающее действие, необходимо сохранение его трехспиральной структуры. [89]
Получению коллагеновых белков из гидробионтов в настоящее время уделяется много внимания, потому что они обеспечивают дефицит коллагенов животного происхождения.
В 2000 г. в Европе был запущен проект, объединивший семь крупных компаний и научно-исследовательских институтов по изучению рыбного коллагена. Голландский НИИ рыбного хозяйства (RIVO), являясь ведущей организацией данного проекта, предлагает применять коллаген в косметической и фармацевтической промышленности для производства кремов и носителей. Ученые считают, что коллаген может быть основой искусственной кожи, для людей с серьезными ожогами, позволяющей снизить риск возникновения инфекционных заболеваний. [55] В университете Хоккайдо учеными созданы искусственные кровеносные сосуды из коллагена, полученного из кожи лосося. Изобретение с успехом прошло клинические испытания на крысах, которым заменили аорты новыми искусственными сосудами.[56] Приверженцы морского коллагена отмечают: температура денатурации животного коллагена слишком высока для проникновения в кожу, в то время как морской коллаген более приспособлен для подобного проникновения. Но необходимо помнить, что средства с таким коллагеном могут вызывать аллергию. Кроме того, он легче разрушается при низких температурах, чем коллаген животного происхождения, поэтому разработчиками предъявляются весьма строгие требования к организации его производства, транспортировке и хранению. Это обусловливает высокую стоимость средств с морским коллагеном[119].
Первую эффективную гидратацию коллагена из шкур пресноводных рыб, используя органические кислоты, произвел в 1985 году коллектив химиков из Гданьска Мечислав Скродски, Антони Михневич и Генрик Куява. В 1989 году они получили патент № 144584 на открытый ими «Метод производства раствора коллагена».[41]
В последующие годы другие польские химики разрабатывали и совершенствовали этот метод. В результате в 2003 году был получен водный раствор коллагена в виде дермокосметологического препарата. В 2007 году была издана (и переиздана в 2009 году с тем же названием) монография «Коллаген. Новая стратегия сохранения здоровья и продления молодости» украинских ученых С.А. Батечко и А.М. Ледзевирова, посвященная открытию польских биохимиков.
Недавно появились российские сведения о возможности получения коллагеновых субстанций из рыб внутренних водоемов [8,29,41,75,76,145], которые проявили некоторые преимущества, по сравнению с морскими. В частности аллергенности, хранимости, стоимости.
Общие методы исследования
Фракцию растворимых белков анализировали с помощью SDS-электрофореза в 8% ПААГ. Образцы наносили по 5 мкл в каждую лунку. В качестве маркера использовали коммерческий набор полипептидов. Во время миграции образцов в концентрирующем геле ( 10% от общего объема геля) напряжение поддерживали на уровне 100В. При перемещении фронта в разделяющий гель напряжение повышали до 140В. Электрофорез проводили до выхода бромфенолового синего из геля. Гели окрашивали 0,25% раствором Кумасси синего R250 (Sigma, USA) в смеси вода:этанол:уксусная кислота (6:4:1). [39]
Идентификация коллагенов на основании электронно микроскопического анализа – атомно-силовая микроскопия. [102,121]
Оценку морфологических отличий коллагеновых дисперсий различно происхождения проводили методом атомно-силовой микроскопии (АСМ). Этот метод используется для определения рельефа поверхности с разрешением от десятков ангстрем вплоть до атомарного. Принцип работы атомно-силового микроскопа основан на регистрации силового взаимодействия между поверхностью исследуемого образца и зондом. В качестве зонда используется наноразмерное остри, располагающееся на конце упругой консоли, называемой кантилевером. Сила, действующая на зонд со стороны поверхности, приводит к изгибу консоли. Появление возвышенностей или впадин под острим приводит к изменению силы, действующей на зонд, а значит, и изменению величины изгиба кантилевера. Таким образом, регистрируя величину изгиба, можно сделать вывод о рельефе поверхности. [147] При работе в полуконтактном режиме также возбуждаются колебания кантилевера. В нижнем полупериоде колебаний кантилевер касается поверхности образца. Такой метод является промежуточным между полным контактом и полным бесконтактом.
Достоинства метода: - Наиболее универсальный из методов АСМ, позволяющий на большинстве исследуемых образцов получать разрешение 1-5 нм; - Латеральные силы, действующие на зонд со стороны поверхности, устранены - упрощает интерпретацию получаемых изображений; Недостатки метода: - Максимальная скорость сканирования меньше, чем в контактном режиме. Для калибровки атомно-силового микроскопа Интегра–Вита (NT-MDT, Россия) были использованы плазмидаpGem длиной 8896 н.п., ДНК фага (Progema, Россия) длиной 48502 п.о. так как изучаемые препараты скорее всего содержат именно коллаген, который является фибриллярным белком. Препараты в буфере, содержащем 0,5 М уксусную кислоту, наносили на свежеприготовленный скол слюды и проводили абсорбцию в течение 5 минут, затем промывали дистиллятом и высушивали в течение 30 минут. Определение суммарных ароматов [96,97,98] «Электронный нос» – прибор на основе пьезокварцевых резонаторов (ПКР), который позволяет электронным способом различать всевозможные запахи. Это набор датчиков с тонкими пленками – полимерами. С помощью которых определяются отдельные компоненты запаха исследуемого вещества. Схема прибора представлена на рисунке 2.3.
Пленки формируются методом статического испарения капли раствора сорбентов. Сорбенты – неподвижные газохроматографические фазы с высокими параметрами избирательности и эффективности сорбции спиртов, эфиров и альдегидов (полиэтиленгликоль адипинат ПЭГА, полистирол с метиловым оранжевым, поливинилприрралидон ПВП), а также нетрадиционные фазы на основе фотометрических реагентов, природных материалов (пчелиный клей). Химические сенсоры широко применяются в качестве детектирующих устройств во многих хроматографических методах анализа как самостоятельные датчики, реагирующие световым или звуковым сигналом на изменение концентрации в газовых или жидких средах органических и неорганических соединений различной природы.
Принцип действия химических сенсоров – превращение аналитического сигнала, возникающего в результате химической реакции анализируемой пробы с реагентами в околосенсорном пространстве или на поверхности, в любой физический сигнал.
Электроды 8-и пьезокварцевых резонаторов с собственной частотой колебания 10 МГц модифицировали путем равномерного нанесения микрошприцем 0,5-2,0 мкдм3 (в зависимости от концентрации и вязкости растворов) этанольных растворов полиэтиленгликоль адипината и пчелиного клея, ацетоновых растворов поливинилпирролидона, смесь полистирола с индикатором метилового оранжевого с последующим статическим испарением свободных растворителей в сушильном шкафу. Модифицированные резонаторы охлаждают в эксикаторе над слоем осушителя до 20±2 С в течение 10-15 мин. Масса пленок после охлаждения составила 10-20 мкг.
Сенсоры закрепляли в держателях на крышке и помещали в герметичную ячейку детектирования. Подготовка образцов заключалась в отборе средней пробы, которую помещали в бюкс с притертой пробкой и полиуретановой мембраной, выдерживали 10-15 мин, после насыщения газовой фазы парами легколетучих соединений через полиуретановую мембрану отбирали шприцем 3-5 см3 равновесной газовой фазы. Газовую пробу быстро инжектировали в ячейку детектирования. Отклики сенсоров регистрировали частотомером или IBM PC в течение 2 мин. Сигналы сенсоров формировали в кинетический «визуальный отпечаток», рассчитывали их площадь.
Исследование условий и разработка режимов получения коллагеновых дисперсий
Поиск альтернативных источников коллагена является актуальной задачей, но не менее значимым является изучение строения и свойств коллагенов. Поэтому в ходе данной работы был проведен сравнительный анализ коллагеновых белков животного и рыбного происхождения.
Первичная структура белков представлена набором свободных аминокислот, соединенных пептидной связью. Специфическая последовательность и состав аминокислот определяют особенности структурных уровней пространственного строения, а, следовательно, функции белков, в нашем случае коллагенов. [39] Сравнительные данные представлены в таблице 4.1
Аргинин 6,8±0,02 8,33±0,02 +1,53 Как видно из данных таблицы, коллагеновые субстанции различного происхождения имеют одинаковый набор аминокислот, но характеризуются разным содержанием отдельных аминокислот, что предполагает различия в структуре, а, следовательно, в свойствах.
Наибольшее отклонение отмечено в количестве аланина, оксипролина. Низкомолекулярные аминокислоты создают условия для более компактных спиралей полипептидных цепей.
Характерной особенностью коллагеновых белков является наличие и высокое содержание таких аминокислот, как пролин и оксипролин.[47] Из таблицы 4.1 видно, что наибольшие значения имеют именно эти аминокислоты, это доказывает, что полученная дисперсия содержит коллагеновые белки. Именно эти аминокислоты обеспечивают формирование специфической вторичной структуры в виде трехцепочечных спиралей. Отсутствие триптофана и невысокое содержание серосодержащей аминокислоты – метионина, так же свидетельствует о наличие коллагеновых белков. Существует мнение, что такие аминокислоты как глицин, аланин, глутаминовая кислота, пролин, серин, аспарагиновая кислота, тирозин могут принимать участие в синтезе коллагена. Большее содержание этих аминокислот наблюдается в случае дисперсии рыбного происхождения, что может говорить о его большей эффективности.
Исследование электрофоретической подвижности коллагеновых белков Анализ фракций проводили с помощью электрофореза в 8% полиакриламидном геле. В качестве маркеров использовали стандартный набор белков AppliChem (ProductNo.A4402). Электрофорез проводили в денатурирующих условиях. Образцы наносились по 5 мкл в каждую лунку. В качестве маркера использовали коммерческий набор полипептидов. Во время миграции образцов в концентрирующем геле ( 10% от общего объема геля) напряжение поддерживали на уровне 100В. При перемещении фронта в разделяющий гель напряжение повышали до 140В. Электрофорез проводили до выхода бромфенолового синего из геля. Гели окрашивали 0,25% раствором Кумасси синего R250 (Sigma, USA) в смеси вода: этанол: уксусная кислота (6:4:1). [32] (рис. 4.1)
Как видно на рис.4.1 фракционный состав коллагеновых дисперсий рыбного и животного происхождения, имеет отличия. Так, для животных коллагенов характерна миграция фракций в области свыше 212кДа. Имеются фракции, мигрирующие в области соответствующей диапазону 66-212кДа, что может быть связано с наличием минорных компонентов и сопутствующих белков. Однако количество их значительно меньше. Это свидетельствует о том, что даже в условиях денатурирующего электрофореза основную массу препарата составляет высокомолекулярные белки, для которых не характерна субъединичная структура. Для препарата рыбного происхождения также наблюдается миграция мономеров в высокомолекулярной области, выше 212кДа, однако количество этих фракций значительно меньше. Основная часть коллагена, полученная из рыбных шкур, мигрирует в области 212кДа. Также присутствует большое количество фракций, мигрирующих в области от 45 до 212кДа. [32]
Как видно на рис. 4.1, белки коллагеновых субстанции представляют собой многокомпонентные системы с различной подвижностью фракций под действием электрического поля. Это свидетельствует о необходимости глубокой очистки и выделения фракций для тонких экспериментальных исследований. Возможно, это свидетельствует о деструктивном воздействии в условиях получения коллагеновой дисперсии
Электрофоретическое фракционирование образцов, содержащих коллаген. Дорожки 1,4,7,10 – маркеры молекулярной массы; дорожки 2,5,8 дорожки – образец, полученный из кожи рыб; дорожки 3,6,9 – образец, полученный из спилка шкуры КРС.
Согласно данным [41] коллаген имеет молекулярную массу около 300кДа, по данным С.А. Батечко и А.М. Ледзевирова коллаген, полученный польскими учеными из шкур рыб имеет значения 357-362кДа, для цепочек 2 значение около 130кДа, для 1 – 105кДа, а для – 250кДа и являются доминирующими единицами [19]. В целом следует отметить сходимость полученной информации с данными польских и украинских авторов и доказывает наличие третичной структуры тропоколлагена.
Сравнительная оценка суммарных ароматов коллагеновых дисперсий различного происхождения
На течение и продолжительность беременности субстанция не оказывала влияния. Так, у контрольных и опытных крыс беременность продолжалась 22-23 дня, у самок, которые получали субстанцию - 23 дня. Была отмечена разница в численности помета крысят и дальнейшем их развитии. Проводилось сравнение развития крысят опытной и контрольной групп.
Установлено, что двигательная активность крысят, матери которых получали коллагеновую субстанцию, практически не отличалась от двигательной активности контрольных.
Проведенные эксперименты показали, что потомство, родившиеся у крыс, получавших при беременности коллагеновую субстанцию не отличалось от контрольного увеличенной ориентировочной активностью. На 20 день жизни число крысят, мамы которых во время беременности получали препарат, и контрольных животных, поднявшихся по сетке, было одинаковым. Изменение ориентировочных рефлексов у животных опытной группы не носило статистически значимого характера. Порог болевого раздражения (зажатие хвоста) у животных обеих групп был одинаков.
Тератогенное действие коллагеновой субстанции изучали на белых крысах. После спаривания самкам через день в течение всей беременности вводили максимально возможную дозу по объему для введения в желудок — 5000 мг/кг, и получили от них потомство. У новорожденных крысят изменений, классифицируемых как уродства, не было выявлено.
В течение всего опыта за подопытными животными вели наблюдение, учитывали поедаемость корма, прием воды, состояние слизистых оболочек, волосяного покрова, поведение, взвешивали в начале и в конце эксперимента.
В результате у грызунов не зарегистрировали гибели, не отмечали признаков интоксикации и заболеваний. Динамика прироста массы тела представлена на рисунке 5.6.
Достоверных различий по массе тушек и внутренних органов у белых крыс в опыте и контроле не выявлено, не установлено также и патологических изменений во внутренних органах при скармливании коллагеновой субстанции в течение 45 дней. Морфологические показатели крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина и гематокрит) у животных всех групп существенно не отличались и находились в пределах нормы. Углеводная, белково-образовательная и мочевинообразовательная функции печени не нарушены.
На основании вышеизложенного можно заключить, что проведенными токсикологическими исследованиями не установлено отрицательного влияния коллагеновой субстанции на организм экспериментальных животных, не выявлены противопоказания к проведению дальнейших исследований и использованию.
Как уже говорилось ранее, коллаген является самым распространенным белком в организме млекопитающих и человека в том числе. Однако с возрастом его выработка постепенно сокращается (рис. 5.7). [41]
Сокращение количества коллагена влияет на состояние кожи, ее увлажненность и упругость. Поэтому для сохранения здоровья, молодости и красоты кожи необходимо восполнять недостаток коллагена с помощью внешних аппликаций косметических средств и БАД для нутритивной коррекции.
Для того чтобы использовать полученные рыбные коллагеновые белки, как активный компонент косметических средств было необходимо провести проверку на соответствие ТР ТС 009/2011 «О безопасности парфюмерно-косметической продукции»[140]. Исследования проводились в ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Воронежской области». Результаты представлены в таблице 5.9.
На базе ИЦ «Бирюч» (Белгородская обл.) были проведены исследования потребительских свойств коллагеновой дисперсии рыбного происхождения, а так же косметических средств: без коллагена, с коммерческим коллагеном (животного происхождения, фирмы «CRODA») с коллагеном рыбного происхождения. Косметические средства производились сотрудниками исследовательского центра, по запатентованным рецептурам. В испытаниях принимали участие 30 женщин в возрасте от 20 до 48 лет. Критериями включения в исследование являлись: - возраст от 18 лет; - клиническое здоровье; - осознанное и добровольное согласие на участие в апробации. Критериями исключения из исследования служили: - повышенная чувствительность к компонентам, входящим в состав исследуемого продукта; - гиперреактивность кожи на внешние и/или внутренние стимулы, проявляющаяся субъективными и/или объективными симптомами, связанными с развитием воспаления; - дерматологические заболевания в фазе обострения, наличие повреждений целостности кожных покровов в области кистей; - одновременное участие в другом клиническом исследовании; - планирование беременности, беременность и период лактации.
Во время испытаний исключалось использование каких-либо косметических продуктов для ухода за кожей и волосами (таких как, например, кремы, бальзамы, шампуни и т.д.).
Объектами исследования были волосы для испытания шампуня и бальзама и кожа внутренней стороны запястья для крема и коллагеновой дисперсии. Испытания проводились по схеме, представленной на рисунке 5.8.
Исходя из данных, полученных в результате компаративного исследования средств для волос и средств для кожи без содержания коллагена, с содержанием коммерческого коллагена и с содержанием коллагеновой дисперсии, следует, что средства с содержанием коллагеновой дисперсии проявляют свойства на уровне коммерческого аналога.
Показатели, полученные аппаратными методами исследования после использования средств для волос с рыбной коллагеновой дисперсией находятся в пределах нормы. По субъективным оценкам пробантов действие средств с рыбным коллагеном сравнимо с действием коммерческого аналога. Согласно мнению респондентов, средства с рыбной коллагеновой дисперсией проявляют достаточно высокую смываемость, не вызывают эффекта утяжеления и жирности волос.
Исследование потребительских свойств средств для кожи с глицерином, с коммерческим коллагеном, а также с рыбным коллагеном, показало, что крем с рыбной коллагеновой дисперсией продемонстрировал результаты на уровне коммерческого аналога, а в рамках субъективной оценки состояния кожи до и после использования — превзошел коммерческий аналог.
Анализ действия коллагеновой дисперсии, без каких-либо добавок позволяет сделать вывод, что после использования в течение двух недель уровень увлажненности кожи рук увеличился на 21% (степень увлажненности увеличилась у 9 из 10 пробантов), а степень покраснения и шелушения кожных покровов снизилась в среднем на 5% у большей части пробантов (рис. 5.9, 5.10).