Введение к работе
Актуальность темы. Производство ферментных препаратов занимает одно из ведущих направлений в развитии биотехнологии во всем мире. Их применение в промышленности позволяет интенсифицировать множество технологических процессов, увеличить объем выпускаемой продукции, повысить ее качество и снизить себестоимость, а так же сэкономить дефицитное сырье.
В современной пищевой промышленности существует важная проблема - это модификация жиров с целью придания им определенных биологических и физико-химических свойств: нужной пластичности, твердости, консистенции, повышения пищевой ценности. Достичь этого можно с помощью регулирования жирнокислотного состава жиров и масел. Наиболее перспективным методом в этом отношении считается ферментативная трансформация растительных масел.
Известные в отечественной и зарубежной практике микробные липолитические ферментные препараты являются, как правило, грибного и бактериального происхождения, оптимум действия липаз которых чаще всего находится в нейтральной и щелочной областях рН. В этой связи возникла необходимость поиска нового высокоактивного дрожжевого штамма-продуцента липаз, проявляющего свою активность в кислой области значений рН, пригодного для использования в пищевой промышленности.
Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы состояла в поиске нового активного дрожжевого продуцента липазы, разработке условий его культивирования для биосинтеза фермента, получении очищенного ферментного препарата липазы и его апробации в пищевой промышленности.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
скрининг микроорганизмов-продуцентов липаз, выделенных из природных мест обитания, с целью отбора штаммов, обладающих наибольшей липазной активностью; отбор штаммов-продуцентов липазы дрожжевого происхождения по совокупности их морфологических и культуральных признаков;
идентификация выбранного штамма-продуцента липазы на основании изучения совокупности его морфологических, культуральных, физиолого-биохимических характеристик, а также на основе анализа участка ДНК, кодирующего часть 18S рРНК; - разработка эффективного режима глубинного культивирования штамма-продуцента и оптимизация состава питательной среды;
проведение индуцированного мутагенеза штамма-продуцента с целью получения дрожжевого мутанта, обладающего повышенной липазной активностью;
разработка биотехнологии ферментного препарата липазы на основе нового перспективного штамма дрожжей;
изучение состава ферментного препарата липазы и условий его использования в пищевой промышленности;
установление жирнокислотной специфичности полученного ферментного препарата на примере гидролиза растительных масел, применяемых в пищевой промышленности.
Научная новизна работы. В результате проведенного направленного скрининга микроорганизмов отобран новый штамм дрожжей, продуцирующий липазу. На основании изучения совокупности морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик штамм идентифицирован как Candida parapsilosis M10.
В результате проведенного индуцированного мутагенеза получен мутант C.parapsilosis M10-10, обладающий липазной активностью на 15% выше по сравнению с родительским штаммом.
На основе лабораторных исследований и полученных зависимостей накопления новым штаммом C. parapsilosis M10-10 липазной активности и выхода липазы от условий культивирования этого штамма, параметров выделения и очистки ферментного препарата, дано научное обоснование разработаной биотехнологии препарата дрожжевой липазы.
Впервые проведена оптимизация условий гидролиза растительных масел с применением липазы M10-10 Г20х в отсутствии эмульгатора, исследованы состав, условия действия и жирнокислотная специфичность полученного ферментного препарата.
Практическая значимость работы. Проведенные лабораторные исследования явились основой для разработки технологии дрожжевой липазы, пригодной для применения в пищевой промышленности. С использованием математических методов планирования экспериментов были оптимизированы основные значимые параметры процессов в технологии ферментного препарата липазы.
На основе наиболее продуктивного штамма C. parapsilosis M10-10, полученного в результате скрининга микроорганизмов-продуцентов липаз, разработан проект Лабораторного технологического регламента по производству ферментного препарата липаза М10-10 Г20х, на основе которого проведена наработка липазы М10-10 Г20х штамма C. parapsilosis M10-10 с активность 30600 ед/г (оптимум действия препарата: рН 5,5; t=37С) в условиях опытного производства ОАО «Биохиммаш». Результаты подтверждены актом о наработке (утверждены заместителем генерального директора по науке ОАО «Биохиммаш» 20.03.2014 г.). Составлен проект Технических условий на ферментный препарат липаза М10-10 Г20х штамма C. parapsilosis M10-10.
Проведенный расчет экономической эффективности разработанной технологии липазы М10-10 Г20х показал, что оптовая цена ферментного препарата находится ниже уровня мировых рыночных цен и составляет 14909,63 руб/кг.
Штамм дрожжей C. parapsilosis M10 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ Y-4055.
Подана заявка №2014138579 от 24.09.2014 на выдачу патента РФ «Штамм дрожжей Candida parapsilosis М10 – продуцент липазы».
В производственных условиях ООО «Компания Трасса» и ООО «Золотой голос» осуществлено изготовление сдобных хлебобулочных изделий и майонеза с заменой в рецептуре растительных масел и маргарина на липидные продукты на их основе, модифицированные с помощью липазы М10-10 Г20х. Применение модифицированных липидных продуктов не оказало негативного влияния на форму, консистенцию, вкус и аромат продукции, при этом положительно сказалось на структуре изделия и его пищевой ценности. В производственных условиях ООО «Русский рыбный мир» осуществлены испытания по очистке сточных вод на локальных очистных сооружениях рыбоперерабатывающего предприятия с применением липазы М10-10 Г20х. Применение фермента оказало положительное действие на качество очистки стоков. Введение модифицированного узла реагентной обработки в схему очистки сточных вод предприятия позволило снизить содержание жировых загрязнений на 86,8%, БПКполн на 69,5%, ХПК на 61,3%. Результаты проведенной работы подтверждаются актом (приложение В).
Методология и методы исследований. Исследования выполнены по стандартным методикам с использованием современных микробиологических, биохимических и физико-химических методов исследования.
Основные положения, выносимые на защиту:
разработанная схема скрининга микроорганизмов-продуцентов липазы;
новый штамм дрожжей C. parapsilosis M10-10, обладающий липазной активностью;
оптимизированный состав питательной среды и условия глубинного культивирования штамма C. parapsilosis M10-10 на основании анализа его физиолого-биохимических особенностей;
обоснованные эффективные параметры выделения и очистки препарата липазы;
биохимический состав ферментного препарата и условия его использования в пищевой промышленности;
эффективные условия гидролиза растительных масел с использованием нового ферментного препарата липазы.
Степень достоверности результатов. Все измерения проводились не менее чем в трех повторностях. Результаты экспериментальных исследований обработаны с помощью Microsoft Office Excel 2007. В диссертационной работе представлены средние результаты с достоверностью 95%.
Апробация работы. Основные положения работы докладывались на Российских и международных конференциях и симпозиумах: Международной конференции «Биология – наука XXI века» (Москва, 2012 г.); Международной научно-практической конференции «Биотехнология и качество жизни» в рамках конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2014 г.); VII Международном научно-практическом симпозиуме «Перспективные ферментные препараты и биотехнологические процессы в технологиях продуктов питания и кормов» (Москва, 2014 г.), Международной научно-практической конференции «Биотехнология и качество жизни» в рамках конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2015 г.).
На международной научно-практической конференции «Биотехнология и качество жизни» в рамках конкурса молодых ученых на лучшую научно-исследовательскую работу результаты разработок отмечены дипломом и медалью.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 3 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 196 источников (в том числе 132 зарубежных), и 6 приложений. Работа изложена на 215 страницах машинописного текста, включает 23 таблицы и 21 рисунок.