Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор научной, технической и патентной литературы 10
1.1 Биологическая роль полиненасыщенных жирных кислот и их значение для здорового питания 10
1.2 Липиды водных биологических ресурсов как перспективные источники функциональных пищевых ингредиентов 16
1.3 Методология переработки пищевых жиров в получении функциональных пищевых продуктов 22
Глава 2 Объекты, материалы и методы исследований 32
2.1 Организация работы и схема проведения исследований 32
2.2 Объекты исследований 34
2.3 Материалы, используемые в экспериментальной работе 34
2.4 Методы исследования качества и химического состава жира, концентрата ПНЖК и липосом 34
2.5 Получение липосом 36
2.6 Методы исследования биологической эффективности липосом и хлеба 39
2.4 Методы приготовления и исследования качества хлеба 43
2.5 Микробиологические методы исследования 46
2.6 Статистический анализ 47
Глава 3 Разработка технологии липосомальной формы концентрата полиненасыщенных жирных кислот 48
3.1 Исследование качественных показателей жира из покровного сала байкальской нерпы Phoca sibirica и получение из него концентрата ПНЖК 48
3.2 Получение и установление сроков и условий хранения липосомальной формы ПНЖК 56
3.3 Изучение биологической активности липосом с концентратом ПНЖК, выделенного из жира байкальской нерпы Phoca sibirica 69
Глава 4 Получение хлеба пшеничного, обогащенного ПНЖК в липосомальной форме 77
4.1 Разработка рецептуры хлеба пшеничного, обогащенного ПНЖК в липосомальной форме 77
4.2 Исследование биологической эффективности пшеничного хлеба «Кардионорм» 89
Заключение 96
Список сокращений и условных обозначений 98
Список литературы 100
Приложения 120
- Липиды водных биологических ресурсов как перспективные источники функциональных пищевых ингредиентов
- Исследование качественных показателей жира из покровного сала байкальской нерпы Phoca sibirica и получение из него концентрата ПНЖК
- Изучение биологической активности липосом с концентратом ПНЖК, выделенного из жира байкальской нерпы Phoca sibirica
- Исследование биологической эффективности пшеничного хлеба «Кардионорм»
Введение к работе
Актуальность темы исследования. По данным Всемирной организации здравоохранения сердечно-сосудистые заболевания являются самыми распространенными среди населения Земли. Одним из возможных способов профилактики заболеваний сердечно-сосудистой системы может быть создание функциональных пищевых продуктов (ФПП), обогащенных эссенциальными полиненасыщенными жирными кислотами (ПНЖК) (Покровский А.А., 1971, Погожева А.В., 1996, Тутельян В.А., 1999, Шевченко А.И., 2004).
Анализ результатов мониторинга современного питания большинства населения показывает, что со-6 и со-З ПНЖК поступают в организм в соотношении от 10/1 до 30/1. Очень важно, чтобы соотношение ПНЖК семейств ю-6 и ю-З составляло не более 10/1, а в случаях нарушений липидного обмена - 5/1 и даже 3/1 (MP 2.3.1.2432-08). Традиционно в качестве пищевых источников ПНЖК используются растительные масла (подсолнечное, кукурузное, хлопковое), содержащие в основном со-6 ПНЖК. Особенно эта тенденция наблюдается в рационе населения, проживающего в регионах, удаленных от морей и океанов, и, поэтому считающихся дефицитными по со-3 ПНЖК, основными источниками которых являются водные биологические ресурсы. Особенно ими богаты жиры холодноводных рыб (сельдь, лосось, печень трески), а также жиры морских млекопитающих (тюлени, моржи, киты).
Непосредственное введение жиров водных биологических ресурсов в пищевые продукты имеет свои трудности и ограничения - это: липофильность, способность к быстрому окислению, присутствие специфического вкуса и запаха. Уменьшить контакт между восприимчивыми к окислению жирами, содержащими со-З ПНЖК, с кислородом воздуха и другими ингредиентами пищевого продукта можно с помощью микрокапсулирования, в том числе введения их в состав липосом, которые способны включать в себя и удерживать вещества различной природы. Мембрана липосом состоит из природных фосфолипидов, поэтому они нетоксичны и биодеградируемы (Барсуков Л.И., 1998, Каплун А.П., 1999, Безруков Д.А., 2006, Шахмаев А.Е., Краснопольский Ю.М., 2012). Таким образом, актуальным на сегодняшний день является введение микрокапсулированной формы со-З ПНЖК в пищевые модули для увеличения ассортимента ФПП, входящих в ежедневный рацион большинства потребителей, таких как хлеб и хлебобулочные изделия.
Степень разработанности темы. Возможность получения концентратов ПНЖК из рыбных жиров рассмотрена в работах Боевой Н.П. (2016), концентратов ПНЖК со-3 в работе Баскаковой Н.А. (2017). Исследования по разработке микроэмульсий с со-3 ПНЖК изложены в работах Исаева В.А. (2016). Исследованиям возможности включения концентратов ПНЖК из лососевых рыб в рецептуру хлеба посвящены работы Байдалиновой Л.С., Андроновой СВ. (2014). Некоторые сведения о внесении микрокапсул с ЭПК и ДГК в рецептуру хлеба описаны в работах Leilane Costa de Conto (2012). Однако в данных работах не рассматривалась возможность капсулирования
эссенциальных ПНЖК из жиров водных биологических ресурсов ВБР в липосомы для создания ФПП.
Цель и задачи исследования.
Цель работы - разработка технологии липосомальной формы ПНЖК, полученной на основе липидов тканей байкальской нерпы Phoca sibirica (Gmelin, 1788), и оценка ее холестеринкорригирующего эффекта, в том числе в составе хлебобулочных изделий.
В соответствии с поставленной целью решали следующие задачи:
- исследовать качественные показатели жира байкальской нерпы Phoca
Sibirica как источник эссенциальных ПНЖК и выбрать способ его переработки;
разработать технологию липосомальной формы ПНЖК;
оценить биологическую эффективность ПНЖК в липосомальной форме;
- разработать рецептуру хлеба пшеничного, обогащенного ПНЖК в
липосомальной форме;
- оценить влияние липосомальной формы ПНЖК на показатели качества
хлеба пшеничного;
- оценить липидкорригирующий эффект хлеба, обогащенного
липосомальной формой ПНЖК, в эксперименте in vivo;
- разработать проект технической документации на хлеб пшеничный,
обогащенный ПНЖК в липосомальной форме.
Научная новизна работы:
научно обоснована и экспериментально подтверждена перспективность использования липидов байкальской нерпы Phosa sibirica для получения липосомальной формы эссенциальных ПНЖК;
предложен и обоснован способ включения эссенциальных ПНЖК в липосомы;
в модельном эксперименте выявлено липидкорригирующее и холестеринснижающее действие липосомальной формы ПНЖК, полученной на основе липидов байкальской нерпы Phosa sibirica;
изучена возможность введения липосомальной формы ПНЖК в рецептуру хлеба пшеничного с целью придания ему функциональных свойств;
получен положительный результат по коррекции содержания фракций холестерина сыворотки крови экспериментальных животных, получавших хлеб, обогащенный липосомальной формой ПНЖК.
Связь работы с научными проектами. Исследования по данной работе нашли поддержку в следующих грантах и программах: АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы» 2013 г. по теме «Исследование метаболизма холестерина пробиотическими микроорганизмами и антиоксидантной активности природных ПНЖК» № 01201254058; конкурсы грантов Молодых ученых ВСГУТУ по темам: «Разработка микронанотранспортных систем биологически активных веществ с антиоксидантной активностью» 2013 года, «Разработка капсулированной формы концентрата ПНЖК» 2014 года, «Нанокапсулирование биологически активных липидов» 2015 года; Гос. Задание Минобрнауки РФ 2017 г. по теме
«Антиоксидантный статус организма в условиях стрессовых нагрузок и разработка способов нутритивной адаптации» № АААА-А17-117112320054-3.
Практическая значимость работы. Новизна технических решений подтверждена патентом на изобретение № 2589285 «Способ получения средства, обладающего липидкорригирующим действием» от 20.05.2015 г. Разработана рецептура хлеба пшеничного, обогащенного ПНЖК в липосомальной форме. Разработан проект технической документации на хлеб пшеничный, обогащенный ПНЖК в липосомальной форме. Доказана функциональность данного продукта, который рекомендуется для профилактики сердечно-сосудистых заболеваний, связанных с нарушением обмена холестерина.
По разработанной рецептуре и технологической инструкции произведена выработка опытной партии пшеничного хлеба, обогащенного ПНЖК в липосомальной форме, в пекарне ООО «Хлебушек» г. Улан-Удэ. Материалы исследований по разработке технологии получения липосомального средства на основе эссенциальных ПНЖК внедрены в учебный процесс кафедры «Биотехнология» ФГБОУ ВО ВСГУТУ.
Основные положения, выносимые на защиту:
получение концентрата полиненасыщенных жирных кислот из жира байкальской нерпы Phoca sibirica;
способ получения липосомальной формы полиненасыщенных жирных кислот;
липидкорригирущие свойства полиненасыщенных жирных кислот в липосомальной форме;
принципы обогащения хлебобулочных изделий, как функциональных продуктов, полиненасыщенными жирными кислотами в липосомальной форме.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались, обсуждались и одобрены на международных и российских научных конференциях и конгрессах: III Всероссийской конференции с международным участием «Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и Дальнего Востока» (г. Улан-Удэ, 2014), Международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в ветеринарии и биотехнологии» (г. Иркутск, 2014), II Всероссийской научной Интернет -конференции с международным участием «Липидология - наука XXI века» (2014), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты биотехнологии» (г. Иркутск, 2015), IX Международной конференции «БИОАНТИОКСИДАНТ» (г. Москва, 2015), XV международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (г. Казань, 2016), V, Всероссийском конгрессе молодых ученых (г. Санкт-Петербург, 2016), VI Всероссийском конгрессе молодых ученых (г. Санкт-Петербург, 2017).
Публикации. Результаты проведенных исследований опубликованы в 16 печатных работах, в том числе 4 - в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, и 3 - в журналах базы Scopus, получен 1 патент РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, списка литературы и приложений. Основное содержание работы изложено на 129 страницах печатного текста, содержит 28 таблиц, 28 рисунков и 5 приложений. Список литературы содержит 188 источников, из них 47 в зарубежных изданиях.
Липиды водных биологических ресурсов как перспективные источники функциональных пищевых ингредиентов
Водные биологические ресурсы (ВБР) отличаются необычайным разнообразием по видовому составу. Поэтому сырье и БАВ, выделенные из них, обладают различными технологическими свойствами [14]. Морепродукты или сырье из ВБР на сегодняшний день очень востребованы во многих сферах деятельности человека, прежде всего, в пищевой промышленности.
Поскольку среда обитания морских организмов является более агрессивной из-за пониженной температуры, они продуцируют вещества с огромным спектром биологической активности, включая антикоагулянтную, иммуномодулулирующую, антиопухолевую, антибактериальную, антигрибковую и антивирусную, противовоспалительную, иммуномодулирующую, липидкорригирующую и т.д. [14, 19, 22, 23, 74, 106, 117, 149, 167]. Многие соединения, полученные из гидробионтов, являются структурно уникальными, а некоторые выделенные из них активные вещества отсутствуют у наземных организмов [62, 106]. Кроме того, биологически активные вещества морского и океанического происхождения оказывают более существенный эффект, чем известные БАВ из растений и животных, обитающих на суше [149].
БАД из тканей водных биологичеких ресурсов (водорослей, беспозвоночных, рыб, морских млекопитающих) все шире завоевывают рынок за счет своих уникальных биоэффективных свойств, доступности сырья, высокого содержания полезных пищевых веществ, дешевизны и практического отсутствия побочных эффектов по сравнению с синтетическими медицинскими препаратами. Насущной проблемой становится комплексная и безотходная переработка гидробионтов, выработка БАВ и БАД из отходов (голов, кожи, костей и т.д.), а также более широкое и целесообразное использование нерыбных объектов лова (водорослей, беспозвоночных, ракообразных и т.д.), направлять которые целесообразно на производство диетической, лечебно-профилактической и другой биологически активной продукции [87]. Особое внимание специалисты рыбной отрасли уделяют разработке малоотходных и безотходных комплексных технологий переработки водных биологических ресурсов (ВБР), ранее использовавшихся нерационально. Одним из таких видов ВБР являются ластоногие млекопитающие (тюлени). В то же время морские млекопитающие (китообразные, ластоногие) являются одним из перспективных и биологически ценных объектов промысла, при этом недоиспользование данного ресурса приводит к нарушению равновесия морских экосистем [13, 92].
Установлено, что морские организмы богаты особо ценными жирами, которые отличаются от жиров наземных животных. Рыбные жиры обладают свойством оставаться жидкими при низких температурах, чем приближаются к жирам человека, а значит, лучше усваиваются организмом [130]. Известно, что жиры водных биологических ресурсов являются источниками -3 ПНЖК.
В России центром изучения морских организмов по праву можно считать Дальний Восток, так как здесь находятся и ресурсы Приморского края, и их центры изучения (Национальный научный центр морской биологии ДВО РАН, Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "ТИНРО-Центр", Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Дальневосточный федеральный университет»). Во Владивостоке биомедицинскими исследованиями БАВ из гидробионтов занимается ряд научно исследовательских и лечебных учреждений (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова СО РАН, Тихоокеанский государственный медицинский университет, Дальневосточный государственный медицинский университет, Медицинское объединение ДВО РАН и др.). Так, в институте биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН ученые исследуют 1–O–алкил глицериновые эфиры, выделенные из липидов печени командорского кальмара.
Известные фармаколгические свойства этих соединений позволяют использовать их для профилактики и лечения целого ряда заболеваний. Полученный на их основе препарат зарегистрирован в качестве БАД к пище «Липидомарин» [136]. В Медицинском объединении ДВО РАН г. Владивосток ученые активно исследуют биологическую активность гонад морских ежей и их метаболитов. Показан их антиоксидантный, противовоспалительный, противоопухолевый и антибактериальные эффекты [74].
Артюковым А.А. c коллегами (2012) было установлено, что полигидроксинафтохинон эхинохрома А (ЭХА), выделенный из плоского морского ежа Scaphechinus mirabilis, обладая высокой антиоксидантной активностью, уменьшает накопление в ишемичной мышечной ткани токсических пероксидов, стабилизирует мембраны эритроцитов, обладает антиагрегатными свойствами, снижает уровень холестерина в крови [135]. Кривошапко О.Н. с коллегами (2009) была изучена способность корригировать углеводный и липидный обмен липидами, выделенными из морских макрофитов (Ulva fenestrate, Sargassumn pallidum, Zostera marina). При исследовании полярных липидов методом газожидкостной хроматографии было обнаружено, что молярное соотношение ПНЖК семейств -6 и -3 указанных морских макрофитов соответственно составило 1,3/1; 3/1; 5/1. Фармакологические исследования показали важную роль приведенных соотношений в корригирующей активности исследуемых смесей липидов [73].
Специалистами НИИ Питания РАМН проводились исследования по влиянию жира тюленя и его смеси на сенсибилизацию и тяжесть проявления анафилаксии. Использование тюленьего жира как источника ПНЖК дало положительные результаты при использовании его в смеси с подсолнечным маслом в соотношении 1:2 [133].
Ученые Всероссийского научно-исследовательского института рыбного хозяйства и океанографии (г.Москва) активно ведут разработки различных технологий и исследуют новые перспективы рационального использования сырья водных биологических ресурсов в виде концентратов, биологически активных и пищевых добавок, лечебно-профилактических препаратов [9, 12].
Байкальский тюлень, или байкальская нерпа (лат. Pusa (Phoca) Sibirica (Gmelin, 1788) - эндемик и млекопитающее пресноводного озера Байкал, обитает на всей его акватории и замыкает трофическую пирамиду водоема, тем самым испытывает на себе любые проявления каких-либо изменений в закрытой экосистеме [99]. Современное состояние популяции нерпы по биологическим показателям ее функционирования можно оценить как довольно благополучное и не вызывающее серьезных опасений. Согласно расчетам, численность промыслового запаса байкальской нерпы в 2013 году составила - 108,2 тысяч голов, в 2014 году - 114,4 тысяч, в 2015 г. - 128,7 тысяч особей [108, 120]. Последний учет нерпы проводился в 2015 году и по данным Петерфельда В.А. (2017) численность приплода нерпы соответствует численности самок, принесших потомство, то есть численность рожавших самок (в возрасте 4+) в 2016 г. равна 25,4 тыс. особей и продолжает расти [108].
Промысел байкальской нерпы осуществляется в ледовый период и ориентирован в основном на добычу щенка-кумуткана. Добыча неполовозрелого молодого зверя оказывает на состояние популяции байкальской нерпы наименьшее воздействие, в отличие от промысла взрослых особей. Это происходит вследствие того, что молодняк не несет никакой репродуктивной нагрузки, то есть не участвует в размножении. По словам специалистов, рост популяции при ограниченной среде обитания может привести к запуску механизма саморегуляции. В этом случае нерпы перестанут размножаться или вовсе возможно возникновение эпизоотии, другими словами, «эпидемии внутри вида», сдерживающей рост популяции при её излишней плотности и слишком большой численности особей. Такое явление наблюдалось в 1987-88 гг. на Байкале, когда больные животные «усеяли» своими трупами берега озера [109].
Промышленный отлов байкальской нерпы Phoca Sibirica был запрещен с 1997 года, однако в 2017 году ситуация с перенаселением животных вновь повторилась - на побережье озера Байкал в октябре было обнаружено более 140 туш погибших животных. Общий допустимый улов байкальской нерпы на 2017 г. утвержден в объеме 3000 голов. Добыча такого количества (менее 3 % от общей численности) не может оказать заметного влияния на общее состояние популяции байкальской нерпы [108]. Однако, по мнению специалистов, для решения регулирования популяции нерпы необходимо возобновление промышленной добычи нерпы в количестве от 4 тыс. до 5 тыс. голов ежегодно [18]. Промысел животных в настоящее время ведется только при осуществлении традиционной хозяйственной деятельности местного населения и в научно-исследовательских целях [120]. При этом у животного ценится его мех, а остальную часть гидробионта (мясо, жир, составляющий около 60% массы туши, и внутренние органы) направляют на техническую переработку, либо выбрасывают. Однако местные жители, мясо и жир, применяют при заболеваниях легких (туберкулез), суставов, кожных болезнях (дерматит, аллергия), а также для укрепления иммунитета [99].
Исследование качественных показателей жира из покровного сала байкальской нерпы Phoca sibirica и получение из него концентрата ПНЖК
Для научного обоснования получения функциональной добавки необходимо было изучить основное сырье – жир, выделенный из покровного сала байкальской нерпы Phoca sibirica. Жир, использовавшийся в данной работе, был получен из подкожного сала неполовозрелых особей байкальской нерпы. По органолептическим показателям свежий жир имеет слабо выраженный специфический рыбный запах. Жир плавится при комнатной температуре, в расплавленном состоянии становится прозрачным. Для оценки качества жира изучены йодное число (ЙЧ), перекисное число (ПЧ) и кислотное число (КЧ) исходного сырья. Данные представлены в таблице 1.
Обнаруженное довольно высокое значение ЙЧ исследуемого образца жира свидетельствует о степени ненасыщенности углеводородных цепей исследуемого жира. Небольшие значения КЧ и ПЧ указывают на то, что жир до использования не подвергался окислению и, тем самым, имеет хорошее качество.
С целью оценки безопасности в Федеральном бюджетном учреждении здравоохранения «Центр гигиены и эпидемиологии Республики Бурятия» были проведены контрольные исследования жира на наличие наиболее распространенных экотоксикантов, таких как тяжёлые металлы и хлорорганические соединения (Приложение Д), содержание в жире которых регламентируется Техническим регламентом таможенного союза. Результаты представлены в таблице 2.
Данные таблиц 1 и 2 свидетельствуют о том, что жир байкальской нерпы Phoca sibirica соответствует гигиеническим требованиям безопасности по ТР ТС 021-2011 и ТР ЕАЭС 040/2016.
Методом ГХ МС определен жирнокислотный состав жира байкальской нерпы (таблица 3, рисунок 8).
В исследуемом жире идентифицировано 24 ЖК, из них в наибольшем количестве содержатся кислоты: олеиновая Cisi (ю-9) - 40,02±0,15%, пальмитолеиновая C16:i (со-7) - 20,68±0,96%, ЛК Ci8:2 (ю-6) - 5,78±0,85%, АРК С20:4 (ю-6) - 1,66±0,03. Также в жире обнаружены наиболее важные ПНЖК ю-3 ряда: АЛК Ci8:3 (ю-3) - 2,53±0,18%, ЭПК С20:5 (ю-3) - 1,60±0,02%, ДГК С22:б (ю-3) -3,59±0,83%. При сопоставлении данных, полученных нами и данных, полученных Авериной Е.С. совместно с исследователями из Норвегии (2009), в которых приводится жирнокислотный состав липидов разных видов тюленей, можно заключить, что жир, использовавшийся в данной работе, полученный из слоев подкожного сала неполовозрелых особей байкальской нерпы, отличается от жира взрослых особей, у которых содержание ю-3 ПНЖК более высокое (ЭПК С2о5(ю-3) - 4,0±1,0%, ДГК С22:6 (ю-3) - от 7,0±2,0 до 10,0±3,0, тогда как содержание в жире щенках байкальской нерпы ЭПК С2о:5(ю-3) - 3,0±0,8; ДГК С22:6 (ю-3) -4,0%±1,0. Содержание эйкозеновой кислоты (С20:1 (ю-9)) в жире байкальского тюленя Phoca sibirica составило 0,31±0,03%, что выгодно отличает его от жира кольчатого тюленя Phoca hispida, в котором содержание эйкозеновой кислоты составляло от 6,0±2,0 до 10,0±5,0% [130]. Известно, что присутствие этой ЖК в рационе может оказывать неблагоприятное воздействие на обменные процессы жизнедеятельности организма [116]. Полученные данные (таблица 4) подтверждают параметры жирнокислотного состава жира байкальской нерпы, ранее изученные Авериной Е.С. (2003), по данным которой на долю НЖК приходилось 12-19%, МНЖК - 46-63%, ПНЖК -25-35% [2].
Таким образом, жир байкальской нерпы Phoca sibirica, как типичного представителя ВБР, обладает высокой степенью ненасыщенности жирнокислотных цепей и оптимальным для здоровья соотношением -6/-3 ПНЖК (0,93/1) [124]. Биологическая ценность жира байкальской нерпы обусловлена наличием в нем ПНЖК -3 ряда, в том числе наиболее важных (ЭПК – 1,6±0,02 и ДГК – 3,59±0,83%), витамина F (АЛК, ЛК и АРХ), а также пальмитолеиновой кислоты С16:1 (-7). Гиполипидемическое и противовоспалительное действие этой ЖК были клинически доказаны Adam M. Bernstein с коллегами (2014) [145], также выявлены ее противомикробное и антиоксидантное действия [12]. Все это позволяет отнести исследуемый жир к перспективному сырью для получения средств и продуктов с липидкорригирующей активностью.
Среди различных способов получения концентратов ПНЖК из жиров метод комплексообразования с мочевиной считается быстрым, эффективным и недорогим. При реализации данного метода сначала в результате переэтерефикации триглицеридов жира со спиртом образуются этиловые эфиры жирных кислот. Затем при добавлении минеральной кислоты выделяются СЖК, а остатки спирта выпариваются на роторном испарителе. Дальнейшее добавление мочевины приводит к тому, что насыщенные жирные кислоты с линейным строением углеродной цепи образуют комплексы с карбамидом, а ЖК с разветвленным строением отделяются при обычном фильтровании [186].
Концентрат ПНЖК из жира байкальской нерпы, полученный методом комплексообразования, описанным в пункте 2.4, представлял собой густую маслянистую жидкость темно-желтого цвета, без запаха, характеристики которого представлены в таблице 5.
Увеличенное значение ЙЧ в полученном концентрате по сравнению с нативным жиром указывало на повышение степени ненасыщенности ЖК, что в дальнейшем подтвердилось данными сравнительного анализа жирнокислотного состава жира и концентрата ПНЖК (таблица 6).
Изучение биологической активности липосом с концентратом ПНЖК, выделенного из жира байкальской нерпы Phoca sibirica
Для оценки эффективности липосомальных средств на основе концентрата ПНЖК была выбрана экспериментальная модель дислипидемии (ДЛ), разработанная Институтом питания РАМН [91].
Эксперимент по оценке биологичекой эффективности разрабатываемой добавки проводился на 4-х группах (n=10) лабораторных крыс линии Вистар:
I группа - интакт (животные получали стандартный рацион вивария и воду ad libitum);
II группа – контроль (животные находились на 21-дневной атерогенной диете);
III группа - опытная 1 (крысы после диеты получали перрорально липосомальную форму с добавлением покровного сала байкальской нерпы в дозе 0,02 г/кг массы тела животного в течение 2 недель);
IV группа - опытная 2 (животные, после диеты получали в течение 2 недель перорально липосомальную форму с добавлением концентрата ПНЖК в дозе 0,02 г/кг массы тела крысы).
На рисунке 14 представлены данные по определению общего холестерина сыворотки и индекса атерогенности сыворотки крови экспериментальных крыс. Как следует из приведенных данных, в результате 21 дневной атерогенной диеты у экспериментальных крыс (группа II) содержание холестерина в сыворотке крови повысилось на 1,05 ммоль/л (62,0%) по сравнению с группой I.
При введении в рацион лабораторным крысам липосомальной формы с жиром байкальского тюленя у животных III группы уровень ОХС в сыворотке крови уменьшился на 0,92 ммоль/л (33,3%) по сравнению с группой II. Тогда как при введении липосом с концентратом ПНЖК у животных IV группы ОХС в сыворотке крови понизился на 1,33 ммоль/л (48,0%) по сравнению с группой II, и на 0,41 ммоль/л (22,3%) по сравнению c III группой [58, 78].
Результаты эксперимента выявили холестеринснижающее действие липосомальных форм ПНЖК при экспериментальной гиперхолестеринимии, и при этом концентрат был более эффективен по сравнению с природным жиром.
На рисунке 15 показано изменение уровней атерогенных и антиатерогенных липопротеинов сыворотки крови лабораторных крыс.
Из представленных данных видно, что в группе животных, получавших атерогенную диету, отмечалось снижение содержания антиатерогенной фракции ЛПВП в сыворотке крови на 0,53 ммоль/л (45,7%) в сравнении с соответствующим показателем интактной группы. Выявленно, что у крыс контрольной группы показатели проатерогенных фракций ЛПНП и ЛПОНП повысились относительно таковых в группе «интакт» на 0,16 (43,2%) и 0,20 ммоль/л (117,6%), соответственно. Содержание антиатерогенной фракции ХС (ЛПВП) у экспериментальных животных III и IV групп повысилось соответственно на 0,47 (90,0%) и 0,57 ммоль/л (74,6%) по сравнению с контрольными крысами и приблизились к показателям I группы. Уровень ЛПНП у экспериментальных крыс III и IV групп по сравнению с контрольной уменьшились на 0,16 (30,2%) и 0,31 ммоль/л (58,5%) соответственно, при этом показатель III группы стал равным с показателем ЛПНП I группы, а в IV группе уровень ЛПНП был достоверно ниже на 0,15 ммоль/л (40,5%) по сравнению III. Уровень ЛПОНП в крови животных III и IV групп снизился на 0,10 (27,0%) и 0,26 ммоль/л (70,3%) по сравнению с контрольными крысами. Коэффициент атерогенности (КА) у контрольной группы по сравнению с интактными животными повысился в 7,3 раза, превышение коэффициента более 3 усл.ед. говорит о потенциальной возможности поражении сосудов холестериновыми бляшками [108]. Благодаря изменениям в уровнях различных липопротеиновых фракций ХС произошел благоприятный сдвиг КА у опытных (III и IV) групп животных. Так, КА у крыс при введении липосом с жиром байкальского тюленя уменьшился в 6,2 раза в сравнении с контрольными крысами. При получении экспериментальными животными концентрата ПНЖК в липосомальной форме КА снизился еще больше (в 11,2 раза) по сравнению с контролем [58, 78, 153].
Таким образом, результаты исследований гиполипидемического эффекта липосомальных форм жира байкальского тюленя и концентрата ПНЖК свидетельствуют о снижении атерогенных фракций ХС (ЛПНП и ЛПОНП) и повышении фракции антиатерогенных липопротеидов (ЛПВП) в сыворотке крови опытных животных по сравнению с контролем [58, 78].
Показатели триглицеридов сыворотки крови экспериментальных животных представленo на рисунке 16.
Уровень ТГ у экспериментальных крыс контрольной группы повысился на 0,62 ммоль/л по сравнению с таковым показателем у интактных крыс. Уровень ТГ в сыворотке крови животных опытных групп достоверно снизился: у группы III на 0,33 ммоль/л, у IV группы на 0,55 ммоль/л соответственно по сравнению с контролем. Показатели ТГ в IV группе были достоверно ниже, чем в III опытной группе.
Для оценки степени липидокисляющих процессов в организме у экспериментальных животных было исследовано содержание МДА в плазме и печени экспериментальных животных. Результаты представлены в таблице 19.
Как следует из таблицы 19 содержание МДА в плазме крови животных контрольной группы достоверно увеличивалось на 60,37% по сравнению с интактными животными, в печени - на 28,03%. При добавлении в рацион питания лабораторным животным жира байкальского тюленя и концентрата ПНЖК в липосомальной форме наблюдалось уменьшение показателей МДА в плазме крови у опытной группы 1 на 21,47%, а у опытной группы 2 - на 35,00% по сравнению с контрольными крысами. Уровень МДА печени у опытной группы 1 снизился на 11,41%, у опытной группы 2 - на 20,39% по сравнению с контролем [57].
В результате проведенных анализов следует, что на фоне экспериментальной гиперхолестеринемии у крыс развивались окислительные процессы, о чем свидетельствовало достоверное повышение уровня МДА в плазме крови и печени животных. Введение липосомальных форм ПНЖК из липидов байкальской нерпы на фоне ДЛ оказывало подавляющее влияние исследуемых добавок на пероксидацию липидов, что определялось снижением содержания МДА в плазме крови и гомогенатах печени до уровня интактных животных [174].
Далее было определено состояние глутатионовой системы организма подопытных животных, так как известно, что эта низкомолекулярная компонента клетки играет немаловажную роль в антиоксидантной защите организма [76]. Результаты определения некоторых показателей глутатиона (GR и GSH) представлены в таблице 20.
Исследование биологической эффективности пшеничного хлеба «Кардионорм»
Были проведены исследования по влиянию хлеба пшеничного, обогащенного концентратом ПНЖК в липосомальной форме, на липидный профиль животных при экспериментальной гиперлипидемии.
Экспериментальных крыс разделили на 4 опытные группы (n=10):
1 группа - интактные (животные находились на стандартном рационе вивария);
2 группа – контроль (животные находились на 21-дневной высокожировой диете);
3 группа – опытная 1 (животные после высокожировой диеты получали ежедневно в течение 3 недель хлеб пшеничный, произведенный по стандартной рецептуре);
4 группа – опытная 2 (животные после высокожировой диеты ежедневно в течение 21 дня получали хлеб пшеничный «Кардионорм»).
На рисунке 24 показано влияние диет с хлебом пшеничным, изготовленным по стандартной рецептуре, и хлебом пшеничным «Кардионорм» на липидный профиль сыворотки крови животных при экспериментальной ДЛ.
Содержание ОХС в сыворотке крови животных, получавших атерогенную диету (контрольная группа), повысилось на 24,36% по сравнению с показателем интактной группы. При получении животными хлеба пшеничного, приготовленного по стандартной рецептуре, на фоне атерогенной диеты ОХС сыворотки крови увеличился на 29,38% по сравнению с таковым у интактной группы. Возможно, небольшое увеличение общего пула холестерина связано с увеличением доли синтезированного организмом крыс холестерина при добавлении в рацион хлеба. Тогда как у животных, получавших хлеб, обогащенный липосомальной формой концентрата ПНЖК, на фоне атерогенной диеты показатели ОХС снизились на 25,47% по сравнению с показателями контрольной группы, находящейся только на атерогенной диете. Введение в рацион животных пшеничного хлеба «Кардионорм» на фоне атерогенной диеты снижало содержание ОХС крови до показателей интактной группы.
Содержание ЛПНП и ЛПОНП в сыворотке крови животных контрольной группы, получавших атерогенную диету, повысилось на 62,35% и на 29,41% по сравнению с таковыми в интактной группе, соответственно. У животных, получавших хлеб без добавки, содержание ЛПНП уменьшилось на 7,59%, а содержание ЛПОНП повысилось на 24,45% по сравнению с соответствующими показателями контрольной группы. В группе животных, получавших хлеб, обогащенный -3 кислотами, содержание ЛПНП и ЛПОНП снизилось на 150% и 17,24%, соответственно, по сравнению с показателями контрольной группы. Содержание ТГ в сыворотке крови у животных контрольной группы повысилось на 41,50% по сравнению с интактными, при этом у животных, получавших хлеб без добавки, содержание повысилось недостоверно на 6,0% и уменьшилось на 8,0%, у животных, принимавших экспериментальный хлеб «Кардионорм» по сравнению со значениями контрольной группы. Содержание ЛПВП в сыворотке крови животных, получавших атерогенную диету (контрольная группа), понизилось на 19,23% по сравнению с соответствующим индикатором интактной группы. При получении животными хлеба пшеничного высшего сорта на фоне атерогенной диеты содержание ЛПВП повысилось на 10,34%, а в группе животных, получавших хлеб пшеничный, обогащенный -3 кислотами, содержание ЛПВП повысилось на 17,02% относительно показателей контрольной группы животных [182].
На основании полученных данных у подопытных животных был рассчитан коэффициент атерогенности. У крыс, получавших хлеб без добавки после атерогенной диеты, исследуемый показатель практически не изменялся по сравнению с контрольными. У животных, получавших хлеб с концентратом ПНЖК в липосомальной форме на фоне атерогенной диеты, КА снизился в 2,2 раза по сравнению с таковым в контрольной группе и приблизился к уровню соответствующего показателя в интактной группе (рисунок 25).
Алиментарная ДЛ у экспериментальных животных может сопровождаться усилением активности процессов ПОЛ в плазме крови, эритроцитах и печени крыс, поскольку образующиеся липидные радикалы, а также малоновый диальдегид и диеновые конъюгаты могут атаковать молекулы белков и нуклеиновых кислот. В свою очередь альдегидные группы вновь модифицированных соединений образуют межмолекулярные сшивки, что сопровождается нарушением структуры макромолекул и дезорганизацией их функционирования. Окисление липидов приводит к нарушению нормальной упаковки мембранного бислоя, что может вызвать повреждение и мембраносвязанных белков, осуществляющих антиоксилительные процессы в клетках и тканях [16].
На рисунке 26 представлен уровень первичных продуктов окисления экспериментальных животных.
Из данных рисунка 24 видно, что показатели ДК плазмы крови и печени контрольной группы повысились на 53,26% и 81,91% соответственно, по сравнению с интактными крысами. У животных, принимавших не обогащенный пшеничный хлеб высшего сорта, показатели ДК плазмы крови понизились на 28,78%, ДК печени повысились на 2,83% в сравнении с контрольными животными. В группе животных, получавших хлеб «Кардионорм», содержание ДК в плазме уменьшилось на 38,80%, в гомогенатах печени на 38,87% по сравнению соответствующими показателями контрольной группы [182].
На рисунке 27 представлены данные по содержанию вторичных продуктов окисления в плазме крови и в печени экспериментальных животных.
Как видно из диаграммы на рисунке 27, уровень МДА плазмы крови у животных 1 группы повысился на 53,30%, в гомогенатах печени - на 93,69% по сравнениюс показателями интактных животных. В группе животных, получавших не обогащенный пшеничный хлеб высшего сорта, показатели МДА уменьшились в плазме крови на 6,03%, в тканях печени на 7,16% по сравнению с контрольными крысами. Содержание МДА в плазме крови и печени экспериментальных крыс, которые получали хлеб «Кардионорм», уменьшилось на 23,85% и 28,50% соответственно, по сравнению с контрольными крысами [182].
Наряду с изучением процессов окисления липидов исследовалось и состояние антиоксидантной системы организма, в частности ССА в сыворотке крови и эритроцитах экспериментальных животных (рисунок 28).
Как видно из рисунка 28, ССА в сыворотке крови животных контрольной группы, получавших атерогенную диету, уменьшилось на 12,53% по сравнению с таковыми интактной группе животных. А у крыс, получавших хлеб, испеченный по традиционной рецептуре, ССА сыворотки почти не изменилось в сравнении с показателями животных в контрольной группы и уменьшилось на 13,55% по сравнению с таковыми в интактной. У животных, которые получали хлеб, обогащенный концентратом ПНЖК в липосомальной форме, на фоне атерогенной диеты ССА сыворотки крови увеличилось на 5,45% по сравнению с соответствующими показателями в контрольной группе. ССА эритроцитов крови у животных, которые получали хлеб пшеничный без добавки, было выше на 6,47% по сравнению с интактными животными и на 11,77% - по сравнению с контрольными крысами. Тогда как у животных, которые получали обогащенный хлеб, показатели ССА эритроцитов повысились на 33,04% в сравнении с интактной и на 36,83% в сравнении с контрольной группой животных.
Известно, что активность защитных механизмов при окислительном стрессе связана как с ферментами с антиоксидантным действием, так и с низкомолекулярными компонентами клеток, одним из которых является глутатион [76].
Показатели активности глутатионовой системы организма экспериментальных животных представлены в таблице 28.