Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 11
1.1 Основные сведения по распространению водной растительности Северного Каспия и авандельты реки Волги 11
1.2 Биологически активные вещества высших водных растений 16
1.3 Пути использования макрофитов в разных отраслях промышленности 25
1.4 Технологии получения экстрактов, обогащенных биологически активными веществами 28
ГЛАВА 2. Объекты, материалы и методы исследования 36
2.1 Объекты исследований 36
2.2 Структура проведенных исследований 36
2.3 Методика проведения водно-спиртового экстрагирования БАВ из высших водных растений 39
2.4 Методы исследования растительного сырья и экстрактов 40
2.5 Выбор технологической схемы производства, подбор технологического оборудования и контроль основных процессов 52
2.6 Статистические методы исследования 52
ГЛАВА 3. Состав, свойства и биологическая активность растительного сырья 53
3.1 Определение органолептических, физико-химических и микробиологических показателей высших водных растений 53
3.2 Изучение общего химического и углеводного составов зостеры малой и рдеста пронзеннолистного 55
3.3 Компонентный состав эфирных масел P. perfoliatus L. и Z. noltii 57
ГЛАВА 4. Качественная и количественная характеристика водно-спиртовых экстрактов водных растений, обогащенных бав 74
4.1 Результаты анализа исследуемых экстрактов: спектрофотометрия и тонкослойная хроматография 74
4.2 Результаты определения адсорбирующей способности растительного сырья и экстрактов 80
4.3 Результаты исследования антиоксидантных свойств экстрактов исследуемых растений 83
4.4 Определение антибактериальной активности растительных экстрактов 86
4.5 Изучение органолептических и микробиологических показателей экстрактов водных растений 88
ГЛАВА 5. Технология получения экстрактов, обогащенных биологически активными веществами 90
5.1 Обоснование выбора растительного сырья 90
5.2. Выбор и обоснование технологических параметров экстрагирования БАВ 90
5.3 Описание технологической схемы производства экстрактов водных растений 95
5.4 Подбор технологического оборудования для получения растительных экстрактов 100
5.5 Направления применения продуктов переработки зостеры малой и рдеста пронзеннолистного 104
5.6 Основные технико-экономические показатели производства экстрактов растений Z. noltii и P. perfoliatus L. 106
Заключение 108
Выводы 109
Практические рекомендации 111
Список сокращений и условных обозначений 112
Список литературы 113
- Биологически активные вещества высших водных растений
- Методика проведения водно-спиртового экстрагирования БАВ из высших водных растений
- Изучение общего химического и углеводного составов зостеры малой и рдеста пронзеннолистного
- Определение антибактериальной активности растительных экстрактов
Введение к работе
Актуальность темы исследования.
Согласно концепции развития рыбного хозяйства Российской Федерации на период до 2020 года недостаточность сырьевой базы в настоящее время не позволяет наращивать объемы производства очень ценных пищевых и кормовых продуктов, медицинских и лечебно-профилактических препаратов, источником которых, как известно, являются многие организмы водного происхождения, как животные, так и растения (Концепция, 2003).
На сегодняшний день воздействие человека на Каспий приобрело многообразный характер, включая загрязнение, инвазию, гидротехническое строительство и другие факторы, влияющие на биотические формы жизни (Катунин и др., 2003).
В тоже время наблюдается тенденция к зарастаемости Волго-Каспийского бассейна прибрежной и водной растительностью, что приводит к заболачиваемости акватории дельты Волги, снижению кормовой базы в местах нагула осетровых и частиковых видов рыб, затруднению прохода рыбы на нерестилища, ухудшению гидрологического режима (Громов, 2009; Садчиков и др., 2005; Чавычалова и др., 2008).
В связи с наличием данных проблем возникает необходимость изъятия части водных растений без нарушения экологического равновесия реки Волги и Северного Каспия, которые могут быть рационально переработаны с целью получения новых продуктов различного назначения.
С другой стороны, уникальный состав и комплекс биологически активных веществ (БАВ) прибрежных и водных растений Волго-Каспийского бассейна определяет широкий спектр их применения и вызывает особый интерес ученых (Мукатова и др., 2005; Курашов и др., 2014; Астафьева и др., 2011; Сухенко, 2006, 2010).
Некоторые прибрежные и водные растения имеют сбалансированный макро- и микроэлементный состав и являются ценным сырьем для получения значимых биологически активных веществ: альгиновой кислоты, маннита, витаминов, фенольных и терпеновых соединений, полисахаридов, главным образом пектиновых веществ (зостерин, рдестин, ламинарин и т.д.), природных антиоксидантов – пигментных веществ (хлорофиллы, каротиноиды, антоцианы), кислот, спиртов и т.д. (Артюхова и др., 2001; Подкорытова, 2005; Митрукова, 2015; Kawasaki et al., 1998; Блинова, 1974; Донченко и др., 2007; Шелеметьева и др., 2009).
Степень разработанности темы.
Весьма актуальным и перспективным направлением является
получение водно-спиртовых экстрактов растений, обогащенных
биологически активными веществами, с антиоксидантными и
антибактериальными свойствами, высокой адсорбирующей способностью.
Существенный вклад в изучение проблемы переработки водных
растений внесли многие авторы:, Подкорытова А.В., Блинова Е.И., Донченко Л.В., Лоенко Ю.Н., Мукатова М.Д. и др. Однако, анализ компонентного состава и возможность комплексного использования макрофитов Волго-Каспийского бассейна с целью получения экстрактов, обогащенных БАВ, а также изучение биологической активности экстрактов высших водных растений до настоящего времени изучены не были. Не выявлены направления применения водно-этанольных экстрактов водных растений Zostera noltii и Potamogeton perfoliatus L. в фармацевтической, химической и других отраслях промышленности.
Цель исследований: получение водно-спиртовых экстрактов высших водных растений Zostera noltii и Potamogeton perfoliatus L., а также изучение их состава, биологической активности и возможности их дальнейшего применения.
Задачи исследований:
-Установить содержание примесей, изучить органолептические и санитарно-гигиенические показатели качества растительного сырья, определить содержание тяжелых металлов в макрофитах;
-Исследовать компонентный состав воздушно-сухих растений Zostera noltii и Potamogeton perfoliatus L. с целью использования их в качестве сырья для получения биологически активных веществ;
-Выбрать рациональный способ извлечения биологически активных веществ из макрофитов и установить параметры водно-спиртовой экстракции растений;
-Определить адсорбирующую способность, антиоксидантную и противомикробную активность водно-этанольных экстрактов Zostera noltii и Potamogeton perfoliatus L., изучить органолептические и микробиологические показатели готовой продукции;
-Апробировать технологию получения водно-спиртовых экстрактов на основе морских и пресноводных трав, обогащенных БАВ, и определить экономическую эффективность технологии переработки растений;
-Установить возможность применения экстрактов в качестве компонентов с антимикробными свойствами и натурального красителя при добавлении в пищевую добавку «экстракт солодки «ГЛИЦИРФИТ» (производство ООО НПП «Глицирфит») и в средство для мытья посуды «АСТ» (производство НПП ООО «Асткосметикс»);
-Разработать проект технической документации на водно-спиртовый экстракт зостеры малой Zostera noltii (ТУ и ТИ к ним).
Научная новизна работы.
Обоснована и экспериментально подтверждена целесообразность использования высших водных растений Волго-Каспийского бассейна (зостеры малой и рдеста пронзеннолистного) в качестве нетрадиционного малоизученного сырья с высоким содержанием БАВ для дальнейшей переработки с целью получения продуктов различного назначения.
Проведены исследования и получены результаты по изучению компонентного состава ВВР Северного Каспия и дельты реки Волги методами хроматографического анализа. Определено присутствие в Zostera noltii и Potamogeton perfoliatus L. биологически активных веществ (флавоноиды, соединения терпенового ряда, эфирные масла, пигменты и др.). Определена адсорбирующая способность растений и экстрактов.
Водно-спиртовым экстрагированием БАВ из морских и пресноводных трав Zostera noltii и Potamogeton perfoliatus L. получены продукты – многокомпонентные препараты растительного происхождения, обладающие биологической активностью.
Впервые получены данные по антиоксидантной и противомикробной активности экстрактов зостеры малой и рдеста пронзеннолистного Волго-Каспийского бассейна. Выявлены направления применения водно-этанольных экстрактов Zostera noltii и Potamogeton perfoliatus L. в качестве компонентов с антибактериальными свойствами и натурального красителя в промышленных условиях.
Результаты проведенных исследований расширяют современные
представления о качественном и количественном составе высших водных
растений Zostera noltii и Potamogeton perfoliatus L., содержании БАВ
различной природы, обладающих биологической активностью, и
возможных путях их теоретического и практического использования.
Теоретическая и практическая значимость работы.
На основании результатов проведенных исследований разработан проект технической документации (ТУ 9284-002-99737027-2013 «Экстракт зостеры малой Альгофит» и ТИ к ним).
Проведением испытаний в производственных условиях на ООО НПП
«Глицирфит» и ООО НПП «Асткосметикс» по внедрению водно-этанольных
экстрактов растений в качестве компонентов с антибактериальными свойствами и
натурального красителя в пищевую добавку «экстракт солодки
«ГЛИЦИРФИТ» и в рецептуру средств для мытья посуды «Аст» доказана возможность использования исследуемых водных растений в качестве источника биологически активных веществ с различными свойствами.
Выделенные биологически активные компоненты согласно
предложенной технологической схеме могут быть получены в
промышленных масштабах для различных отраслей народного хозяйства.
Полученные данные по изучению компонентного состава и
определению биологической активности БАВ экстрактов макрофитов
Волго-Каспийского бассейна, а также предложенная комплексная
технология переработки водных растений используются для разработки
лекционных курсов «Общая биотехнология», «Биотехнологическое
оборудование», «Биотехнология и органический синтез», «Биотехнология белка и БАВ» бакалаврам по направлению «Биология», профиль «Биотехнология и биоинженерия» и магистрантам по направлению «Биология», профиль «Биотехнология».
Методология и методы исследования.
Для выполнения задач была разработана схема экспериментальных исследований, согласно которой получены результаты по определению состава, свойств и биологической активности высших водных растений Zostera noltii и Potamogeton perfoliatus L. и экстрактов на их основе. Объекты исследования оценивали по органолептическим, физико-химическим, биохимическим и микробиологическим показателям. Компонентный состав и биологическую активность растений и водно-спиртовых экстрактов определяли хроматографическими (ТСХ, хромато-масс-спектрометрия), спектрофотометрическим и фотометрическим методами. Определение тяжелых металлов проводили методом атомно-абсорбционной спектрометрии. Методы анализа растительного сырья и экстрактов представлены в таблице 1.
Основные положения, выносимые на защиту:
Перспективное нетрадиционное и малоизученное сырье (высшие водные растения Zostera noltii и Potamogeton perfoliatus L.) для получения комплекса биологически активных веществ в виде водно-этанольных экстрактов.
Качественный и количественный состав водных растений (Zostera noltii и Potamogeton perfoliatus L.), экстрагирование биологически активных веществ из них и изучение свойств полученной продукции.
Технология получения многокомпонентных экстрактов и перспективы применения продуктов переработки высших водных растений Zostera noltii и Potamogeton perfoliatus L. в фармацевтической, химической, пищевой и кормовой промышленностях.
Степень достоверности и апробация работы.
Достоверность данных, полученных в результате исследований,
основывается на строгих доказательствах и использовании математических
методов. Научные положения, выводы и рекомендации, представленные в
диссертационной работе, обоснованы и подтверждены
экспериментальными исследованиями.
Апробация результатов исследований.
Степень достоверности результатов проведенных исследований подтверждается глубокой проработкой литературных источников по теме диссертации; постановкой экспериментов, выполненных на современном методическом уровне; применением современных инструментальных методов анализа. Для математической обработки результатов исследований использованы прикладные компьютерные программы. Достоверность полученных результатов обусловлена докладами (апробацией) основных положений диссертации на научных конференциях и заседаниях кафедры.
Проведенные исследования и полученные результаты работы представлены на Международной научной конференции «Инновационные технологии в управлении, образовании, промышленности АСТИНТЕХ-
2009» (Астрахань, 2009 г.); Международной конференции с элементами
научной школы для молодежи «Экокультура и фитобиотехнологии
улучшения качества жизни на Каспии» (Астрахань, 2010 г.);
Международной Пущинской международной школе-конференции молодых
ученых «Биология – наука XXI века» (Москва, 2011-2012 гг.); VI
Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и
перспективы развития» (Москва, 2011); II Региональной конференции
молодых ученых и инноваторов «ИННО-КАСПИЙ» (Астрахань, 2011 г.);
ХVI Международной экологической конференции «Экология России и
сопредельных территорий» (Новосибирск, 2011); Международной
Интернет-конференции «Биотехнология. Взгляд в будущее» (Казань, 2012); Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические и фармакологические аспекты изучения ценных биологически активных компонентов» (Астрахань, 2014 г.); XXVIII Зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2016 г.).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 14 научных работ, из которых 2 – в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Структура и объем диссертации.
Биологически активные вещества высших водных растений
В растительном сырье содержатся разнообразные по химическому составу вещества, как общие для всех высших растений (например, полисахариды, белки, соли), так и специфические для определенных растений (Тырков А.Г., 2013). Экспериментальные данные многих отечественных и зарубежных исследователей характеризуют водные растения как уникальный промышленный возобновляемый источник получения ряда значимых соединений (Исмагулов М.И.,1999; Материалы регионального совещания…,2002; Курашов Е.А. с соавт., 2013). Химический состав морских и пресноводных трав зависит от вида, стадии развития и условий произрастания (Быков В.П., 1999).
Биологически активные вещества (БАВ) – соединения, оказывающие специфическое лечебное действие на организм человека. Именно их наличие обуславливает ценность каждого вида растительного сырья (Минина С.А. с соавт., 2004; Георгиевский В.П. с соавт., 1990). К ним относят различные группы фенольных соединений, алкалоиды и гликозиды, кумарины, витамины, эфирные масла, некоторые углеводы (Белянин М.Л., 2010). Пектин и его свойства Особенностью химического состава морских и пресноводных трав, отличающей их от морских растений других классов, является присутствие в их тканях пектиноподобного вещества.
Пектиновые вещества, содержащиеся в растительных соках и плодах (Скурихин И.М. с соавт., 1987), представляют собой гетерополисахариды, построенные из остатков галактуроновой кислоты, соединенных -(1,4)-гликозидными связями. Карбоксильные группы галактуроновой кислоты в той или иной степени этерифицированы метиловым спиртом (рисунок 5) (Щербаков В. Г. с соавт., 1999; Филипцова Г. Г. с соавт., 2004; Schols H.A. et al., 2009). По органолептическим показателям пектин для пищевых продуктов – порошок без посторонних примесей от светло-серого до кремового цвета, имеет слабокислый вкус, без запаха (ГОСТ 29186-91).
Наиболее ценным и самым интересным ПВ является полисахарид – морской пектин зостерин. Пектин морских трав впервые был выделен в 1940 г. советским ученым Мирошниковым В.И., который назвал его зостерином. Позже, уже в середине 60-х гг. прошлого столетия впервые в составе пектина морских трав семейства Zosteraceae был обнаружен апиогалактуронан в качестве разветвленной области пектина (Артюхова С.А. с соавт., 2001).
Зостерин – это уникальный низкометоксилированный пектин, выделяемый из морских трав семейства Zosteraceae. Зостерин относится к пектиновым веществам, однако в отличие от пектинов наземных растений данный морской пектин имеет крайне низкую степень метоксилирования, высокую молекулярную массу и содержит в своем составе уникальный моносахарид апиозу (Лоенко Ю.Н. с соавт., 1997; Ovodova R.G. et al., 1968).
Экспериментальные исследования многих отечественных и зарубежных ученых показали, что зостерин обладает широким спектром фармакологического действия: иммуномодулирующей, противовирусной, антибактериальной (Han Gil Choi et al., 2009; Hengrui et al., 2014), противоопухолевой (Хасина Э.И. с соавт., 2003), радиозащитной, противоязвенной (Khasina E.I. et al., 2004) и другими видами биологической активности (Зостерин: руководство для…, 1997; May C.D., 1990).
Специфической особенностью пектиновых веществ, имеющей важное практическое значение, является их комплексообразующая способность, основанная на взаимодействии молекулы пектина с ионами тяжелых и радиоактивных металлов (Титов А.Ф. с соавт., 2007). Это свойство дает основание рекомендовать пектин для включения в рацион питания лиц, находящихся в среде, загрязненной радионуклидами и имеющих контакт с тяжелыми металлами (Бобровник А.Д. с соавт., 1991, Сонина Л.Н. с соавт., 2007). Студнеобразующая способность пектина зависит от его молекулярной массы, степени этерификации (СЭ), содержания функциональных групп, рН среды. Известна прямая зависимость способности пектина к образованию прочного студня от его молекулярной массы. Для хорошего студнеобразования необходимо, чтобы пектиновая молекула имела молекулярную массу не менее 20 кДа (Гранатова В.П. с соавт., 2007).
Методика проведения водно-спиртового экстрагирования БАВ из высших водных растений
Полученные результаты свидетельствуют о том, что ВВР по микробиологическим показателям соответствуют требованиям СанПиН 2.3.2.1078-01 на водоросли сушеные (морская капуста). Микробиологические показатели рдеста пронзеннолистного, определенные для характеристики санитарного состояния пресноводных растений, показали, что микробная обсемененность растения, по сравнению с морской травой зостерой малой на порядок выше, но не превышает установленных норм 5 104.
Для изучения химического и углеводного составов высушенные водные растения были подвержены измельчению. Образцы измельчали в микромельнице IKA A11 basic для измельчения растительного сырья до размера частиц 1-2 мм. После чего были поставлены опыты по определению содержания воды, белка, жира и золы. После исследования химического состава исходного сырья были получены результаты по углеводному составу высших водных растений, определено содержание растворимых и легкогидролизуемых углеводов, пектиновых веществ и клетчатки. В таблицах 7 и 8 приведены химический и углеводный составы морских и пресноводных трав Волго-Каспийского бассейна.
Результаты исследований по определению общего химического состава показали, что содержание воды в воздушно-сухом растении Potamogeton perfoliatus L. составляет около 7,92 %, в Zostera noltii - около 10,4 %. Сухое вещество рдеста и взморника составляет 92,08 и 89,6 соответственно, и состоит из органических соединений: минеральных и азотистых веществ, растворимых и нерастворимых в воде углеводов. Содержание эфирорастворимых веществ в зостере выше и составляет порядка 3,1 %, общего азота в сухом веществе незначительно (6,9 %), но превышает таковое в рдесте (5,65%).
Результаты изучения углеводного состава воздушно-сухих растений свидетельствуют о том, что в составе рдеста пронзённолистного и зостеры малой содержится значительное количество углеводов, включающие в частности клетчатку – 23,2 и 16,5 %, пектиновые вещества – 14,4 и 18,7 %, а также легкогидролизуемые в количестве 11,87 % и 12,3 % соответственно.
Содержание растворимых углеводов в Z. noltii ниже, чем в P. perfoliatus L. и составляет 6,5 и 9,34 % соответственно.
Таким образом, высокий уровень углеводов, в том числе пектиновых и минеральных веществ в исследуемых растениях указывает на возможность их использования в качестве сырья для дальнейшей переработки с целью получения продуктов различного назначения.
Химический состав морских и пресноводных трав зависит от вида, стадии развития и условий произрастания. Поэтому большую роль при изучении макрофитов играет как количественный, так и качественный состав.
Для изучения компонентного состава ВВР были получены гексановые экстракты воздушно-сухих проб растений. При экстрагировании неполярными растворителями (гексан, петролейный эфир, бензол и др.) из растений извлекаются соединения, обладающие биологической активностью.
Препараты растительного происхождения представляют смесь биологически активных веществ, которые могут оказывать комплексное разнонаправленное действие. В связи с этим изучение полного компонентного состава идентифицированных ЛНОС в составе эфирного масла рдеста пронзеннолистного P. perfoliatus L. и зостеры малой Z. noltii является актуальным.
На рисунках 16 и 17, в качестве примера, приведен общий вид хроматограмм эфирного масла P. perfoliatus L. и Z. noltii.
В таблице 9 приведены наиболее значимые соединения эфирного масла рдеста пронзеннолистного, представляющие интерес с точки зрения их биологической активности. Таблица 9 – Некоторые соединения, входящих в состав эфирного масла Potamogeton perfoliatus L. (С – доля вещества в эфирном масле, %; Сср – концентрация вещества в сухом растении, мг/г) (PubChem – Open Chemistry Database)
Результаты исследования полного качественного состава и количественного содержания ЛНОС рдеста пронзеннолистного показали, что его эфирное масло содержит 169 компонентов, из которых идентифицировано 156 веществ (Приложение А).
Данные таблицы 9 свидетельствуют о том, что обнаруженные химические соединения широко используются в промышленности в качестве пищевых ароматизаторов (лимонен имеет цитрусовый запах (Jidong Sun., 2007), сафраналь – запах шафрана, ионон имеет запах фиалки, бензальдегид – аромат мендаля и др.), в качестве отдушки парфюмерно-косметических композиций (линалоол, бензальдегид, лимонен, терпинеол), компонентов ароматических масел (линалоол), компонентов медицинских препаратов (ментол, эвдесмол).
Данные соединения также могут использоваться для синтеза других ценных веществ (например, линалоол – для синтеза линалилацетата, бензойный альдегид – для получения амфитамина).
Среди выделенных веществ особое внимание заслуживают компоненты, обладающие антибактериальной, фунгицидной и противовирусной активностью: гексаналь (Komai I. et al., 2014), бензальдегид, -терпинеол (Carson C.F. et al., 1995), кауренол, эвгенол (содержится в гвоздичном масле), фитол, лимонен. Азарон и 65 циклоцитраль обладают альгицидной активностью. -Циклоцитраль ингибирует рост и развитие цианобактерий (Chang et al., 2011). Ментол (монотерпен) обладает слабыми местноанестизирующими свойствами, стимулирует холодовые рецепторы кожи и слизистых, является слабым антисептиком (Farco J.A. et al., 2013). Значительный интерес в составе синтезируемых пресноводными травами P. perfoliatus L. веществ представляет стероидное соединение – норметандрон (метилнортестостерон), относящееся к анаболическим стероидам и имеющее очень важное значение в медицине. Полный компонентный состав и применение некоторых идентифицированных ЛНОС в составе эфирного масла зостеры малой Zostera noltii представлен в Приложении Б. В таблице 10 приведены наиболее значимые для изучения низкомолекулярные органические соединения в составе эфирного масла взморника малого.
Изучение общего химического и углеводного составов зостеры малой и рдеста пронзеннолистного
Как и в случае с АОА высокую степень ингибирования свободно-радикальных процессов проявилась в исследуемых экстрактах ВВР. Однако наибольшей СИ обладает экстракт Zostera noltii (при 50 мл – 123 %, при 100 мл – 122 %), меньшей – экстракт Potamogeton perfoliatus L. (при 50 мл – 109 %, при 100 мл – 115 %).
Растворы лекарственных препаратов аскорбиновой кислоты и эмоксипина, которые были взяты для сравнения, по литературным данным обладают выраженной антиоксидантной активностью (Коленченко с соавт., 2005; Гринкевич Н.И. с соавт., 1983). Однако проведенные исследования показали низкую АОА и СИ по сравнению с водно-спиртовыми экстрактами ВВР. Это можно объяснить тем, что препараты лекарственного назначения имеют низкую концентрацию активного вещества (в 1 мл водно-солевого раствора содержится 50 мг аскорбиновой кислоты; в 1 мл раствора эмоксипина содержится 1 мг метилэтилпиридинола).
С другой стороны, исследуемые водные растения содержат в своем составе соединения, которые являются сильными природными антиоксидантами (ретинол, сквален, 2,4-ди-трет-бутилфенол, фитол и др.), что свидетельствует о перспективном использовании водно-этанольных экстрактов с антиоксидантными свойствами в различных отраслях промышленности.
Чувствительность микроорганизмов к БАВ и антибиотикам определяется их биологической активностью. Биологической активностью химических соединений называют его способность убивать либо тормозить рост и развитие микроорганизмов. Для определения антибактериальной активности водно-спиртовых экстрактов ВВР в качестве тест-культуры использовали условно-патогенные микроорганизмы St. aureus, E. coli и B. subtilis. Результаты исследования антибактериальных свойств экстрактов методом диффузии в агар с использованием лунок Антибактериальную активность экстрактов Zostera noltii и Potamogeton perfoliatus L., а также разведения исследуемых экстрактов (в воде в соотношении 1:1) относительно St. aureus, E. coli и B.subtilis высших водных растений исследовали комбинированным методом: диффузии в среду с использованием с использованием лунок (метод прямой диффузии) (Алешукина А.В., 2003; Нетрусов А.И. с соавт., 2005).
В качестве стандартных растворов при исследовании антибактериальной активности экстрактов исследуемых растений диско-диффузионным методом использовали стандартные индикаторные диски ДИ-ПЛС-50-01 с антибиотиками левомицитин, офлоксацин, ампициллин. В качестве контроля была приготовлена дистиллированная вода и 40 %-ный водный раствор этанола.
Для достоверности результатов и изучения влияния этанола на антибактериальную активность были приготовлены растворы разведенных в дистиллированной воде сухих водно-этанольных (1 мг конкрета / 1 мл дистиллированной воды). Сравнительные исследования антибактериальной активности водно-спиртовых экстрактов ВВР с различными концентрациями БАВ представлены в таблице 16. Таблица 16 – Сравнительные исследования антибактериальной активности водно-спиртовых экстрактов ВВР с различными концентрациями БАВ Результаты проведенных исследований показали, что наибольшей ингибирующей активностью в отношении тест-культур микроорганизмов E. coli, St. aureus, B. subtilis обладали антибиотики – левомицитин и офлоксацин. Ампициллин проявил антибактериальную активность только в отношении E. coli и St. aureus. Среди водных экстрактов ВВР экстракт Zostera noltii имеет большее антибактериальное действие, чем экстракт Potamogeton perfoliatus L.
Выраженную антибактериальную активность проявил водно-спиртовый экстракт Z. noltii в отношении микроорганизмов E. coli и St. aureus, а водно-спиртовый экстракт P. perfoliatus L. – в отношении B. subtilis. Дистиллированная вода и 40 %-ный раствор этанола противомикробной активностью не обладают. Важно отметить, что водно-этанольные экстракты показали более выраженную подавляющую рост бактерий активность, чем водные экстракты (примерно в 1,5 раза).
Это можно объяснить тем, что в результате экстракции этанолом извлекаются и образовываются помимо водорастворимых, еще спирторастворимые соединения, являющиеся БАВ и обладающие противомикробной активностью.
Определение антибактериальной активности растительных экстрактов
В лаборатории ООО НПП «Глицирфит» исследованию подвергались экстракты из стеблей и листьев Z. noltii и P. perfoliatus L., пищевой добавки «экстракт солодки «ГЛИЦИРФИТ» с внесением в нее экстрактов водных растений.
Для определения антибактериальной активности объектов исследования водных растений в качестве тест-культуры использовали условно-патогенные микроорганизмы St. aureus и B. subtilis (суспензия смеси).
Испытания по определению антибактериальной активности водно-спиртовых экстрактов водных растений Z. noltii и P. perfoliatus L. при внесении их в пищевую добавку «экстракт солодки «ГЛИЦИРФИТ» БАВ экстрактов растений показали, что набор биологически активных веществ экстракта Z. noltii обладает большей противомикробной активностью, чем другие исследуемые экстракты. Таким образом, качество пищевой добавки «экстракт солодки «ГЛИЦИРФИТ» усиливается повышением противомикробной активности экстракта морских трав в качестве консерванта.
В средство для мытья посуды «АСТ» (производитель ООО НПП «Асткосметикс», г. Астрахань) был внесен водно-этанольный экстракт Z. noltii. По органолептическим и физико-химическим показателям приемлемыми дозами для внесения препарата были установлены дозы 0,4-0,8 %. Средство прозрачное, вязкой консистенции зеленого цвета, имело приятный запах применяемой отдушки.
Физико-химические показатели соответствуют ГОСТ Р 51022-97 «Товары бытовой химии. Методы определения анионного поверхностно-активного вещества» и ГОСТ Р 51018-97 «Товары бытовой химии. Метод определения неионогенного поверхностно-активного вещества». Токсикологические показатели соответствуют требованиям нормативной документации. Основные технико-экономические показатели производства экстрактов растений Z. noltii и P. perfoliatus L. Основой безопасности нашей страны, в том числе продовольственной безопасности является импортозамещение и необходимость развивать собственные производства. Создание предприятия на основе комплексного использования высших водных растений дельты реки Волги и Северного Каспия по малоотходной технологии соответствует Комплексной программе развития биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020, и позволит в едином технологическом процессе из природного практически неиспользуемого сырья получить ряд высокоценной продукции.
Наличие растущего спроса на БАВ, обладающие противомикробной и антиоксидантной активностью и возможность установления (ввиду низкой себестоимости, недорогостоящего оборудования и экстрагента) привлекательной цены на этот продукт, широко применяемый в пищевой, косметической и кормовой промышленностях, позволяет предположить постоянный сбыт данной продукции.
Основным ассортиментом продукции, выпускаемой на проектируемом предприятии в Астраханской области, являются экстракты Zostera noltii и Potamogeton perfoliatus L., полученные в результате экстрагирования БАВ этиловым спиртом.
Экономическая и политическая целесообразность строительства нового объекта по производству водно-этанольных экстрактов ВВР обусловлена следующим: - необходимостью импортозамещения наиболее важных для обеспечения безопасности страны видов продукции; - необходимостью развития регионов и создания рабочих мест; - экономической выгодой от производства и продажи экстрактов. Технико-экономические расчёты производства экстрактов по комплексной переработке высших водных растений Zostera noltii и Potamogeton perfoliatus L. мощностью 143 т/год с получением продукта пищевого назначения представлены в таблице 20.
Проведенные промышленные испытания и расчет ожидаемого экономического эффекта позволяют сделать вывод о технологической целесообразности и экономической эффективности переработки высших водных растений Волго-Каспийкого бассейна Zostera noltii и Potamogeton perfoliatus L. с целью получения водно-этанольных экстрактов, обогащенных БАВ.
Основное внимание ученых, в том числе технологов, уделялось изучению традиционных технологий переработки наземных растений (Захаров В.П. с соавт., 1980; Сухенко Л.Т., 2006). Современные тенденции развития биотехнологий требуют расширения сырьевой базы (Пилипенко В.Н., 1997).
Увеличение потребностей медицинской, пищевой и кормовой промышленностей в биологически активных веществах заставляет уделять внимание новым нетрадиционным источникам возобновляемого сырья. С этой точки зрения высшие водные растения Zostera noltii и Potamogeton perfoliatus L. можно рассматривать как перспективный объект благодаря высокому содержанию в них уникальных веществ различного спектра действия. Запасы высших водных растений дельты реки Волги и Северного Каспия достаточны для производства экстрактов с заданными свойствами.
В составе летучих низкомолекулярных органических соединений морских и пресноводных трав обнаружено большое количество БАВ, относящихся к разным группам соединений. Нами получены результаты выраженной противомикробной и антиоксидантной активности, высокой адсорбирующей способности высших водных растений и их водно-спиртовых экстрактов.
Полученные материалы создают основу для продолжения исследований по идентификации, выделению и изучению свойств природных биологически активных веществ с целью производства препаратов, оказывающие выраженное антимикробное и антиоксидантное действия.