Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Аспекты биотехнологии кисломолочных продуктов и препаратов с пробиотическими свойствами 18
1.1. Современные тенденции производства кисломолочных продуктов и препаратов с пробиотическими свойствами и их значение в оздоровлении населения 18
1.2. Роль микроорганизмов в биотехнологии кисломолочных продуктов и препаратов 36
1.3. Влияние факторов на стабильность биотехнологических процессов .43
1.4. Целевой подбор штаммов микроорганизмов, пути создания бактериальных заквасок для кисломолочных продуктов и консорциумов бактерий для комплексных препаратов 57
1.5.3аключение 80
Глава 2. Концепция биотехнологии кисломолочных продуктов и препаратов со стабильными показателями качества
Глава 3. Организация, объекты и методы исследований 87
3.2. Методы исследований
3.2.1 Микробиологические методы 91
3.2.2. Генетические методы .98
3.2.3. Биохимические методы 102
3.2.4. Математические методы
Глава 4. Исследование причин нарушения биотехнологических процессов кисломолочных продуктов 106
4.1.Изучение проблемы бактериофагии на предприятиях молочной промышленности
4.1.1.Выявление причин нарушений биотехнологических процессов, мониторинг бактериофагов, выделение и изучение их свойств 106
4.1.2. По лучение фагоустойчивых штаммов мезофильных молочнокислых бактерий 127
4.2.Исследование изменений свойств у культур молочнокислых бактерий 138
4.2.1. Изучение плазмидного профиля у штаммов молочнокислых бактерий
4.2.2.Изучение взаимосвязи производственно-ценных свойств и плазмидного профиля у культур лактококков 144
Глава 5. Изучение детерминации производственно-ценных свойств у штаммов лактококков 156
5.1. Изучение детерминации метаболизма лактозы 156
5.2.Исследование детерминации фагоустойчивости 161
5.3. Изучение детерминации ароматообразования 180
5.4. Разработка метода отбора генетически устойчивых штаммов молочнокислых бактерий
Глава 6. Научное и экспериментальное обоснование принципов подбора культур микроорганизмов для продуктов и препаратов с пробиотическими свойствами 195
6.1.Идентификация микроорганизмов, применяемых в биотехнологических процессах 195
6.1.1.Морфологические и физиолого-биохимические свойства молочнокислых бактерий и бифидобактерий 196
6.1.2. Молекулярно-генетическая характеристика бактерий 203
6.2.Изучение производственно-ценных свойств молочнокислых бактерий и бифидобактерий 210
6.3.Изучение свойств молочнокислых бактерий и бифидобактерий, обуславливающих пробиотические свойства продуктов и препаратов 214
6.3.1.Исследование антагонистической активности штаммов молочнокислых палочек и бифидобактерий 214
6.3.2.Изучение природной устойчивости культур микроорганизмов
6.3.3.Изучение способности штаммов молочнокислых палочек кобразованию различных форм молочной кислоты 222
6.3.4.Изучение лактозосбраживающей способности у культур термофильного молочнокислого стрептококка 224
Глава 7. Экспериментальное обоснование методологии получения бактериальных заквасок со стабильными свойствами 230
7.1.Изучение взаимодействия культур с одинаковой оптимальной температурой развития 231
7.2. Изучение взаимодействия культур термофильного стрептококка с другими видами бактерий 245
7.3. Исследование совместного использования молочнокислых бактерий и бифидобактерий 253
7.4.Разработка методологии получения заквасок со стабильным комплексом свойств 258
Глава 8. Разработка технологии кисломолочных продуктов и препаратов пробиотического действия, изучение их свойств и опытно-промышленная проверка результатов исследований 265
8.1 .Разработка технологии кисломолочного напитка «Утро» 266
8.2. Разработка технологии кисломолочного продукта «Бимол» 272
8.3. Разработка технологии биопрепарата «Бифацид» 277
8.4. Технология пробиотика «Бифацидобактерин» для животных .281
8.5. Исследование биологической ценности кисломолочных продуктов «Утро» и «Бимол» 284
8.6. Исследование биологической ценности и результаты клинических испытаний биопрепарата «Бифацид» 287
8.7. Промышленная проверка фагоустойчивых заквасок для творога, сметаны и закваски для био-сметаны 296
Выводы 300
Литература
- Влияние факторов на стабильность биотехнологических процессов
- Генетические методы
- По лучение фагоустойчивых штаммов мезофильных молочнокислых бактерий
- Изучение детерминации ароматообразования
Влияние факторов на стабильность биотехнологических процессов
Здоровое питание - необходимое и важнейшее условие эволюции жизни на Земле. Реализация «Концепции государственной политики в области здорового питания населения России на период до 2005 года» на современном этапе развития общества обусловлена: ухудшением демографической ситуации в России из-за превышения смертности среди населения над рождаемостью в результате роста заболеваний, вызванных негативным воздействием окружающей среды, неправильным питанием, белковоэнергетической недостаточностью, а также настоятельной необходимостью принятия срочных мер по повышению уровня самообеспечения страны продуктами питания и продовольственной безопасности страны. Продукты здорового питания должны не только удовлетворять физиологические потребности человека в эссенциальных пищевых веществах, но и улучшать состояние здоровья населения [26, 27, 50, 85, 96, 116, 165, 180, 225, 229, 234, 237, 296, 314, 370, 420].
Изменения, происходящие в биосфере Земли, в результате развития человеческой деятельности как бы подготовили появление тенденции к ухудшению экологической ситуации. Одним из важнейших факторов, позволяющих ослабить нарастание этой тенденции, является увеличение потребления населением продуктов здорового питания, к которым на современном этапе относят кисломолочные продукты с пробиотическими свойствами [7, 169, 396,401].
Термин «probiosis» означает симбиоз, сообщество двух организмов, способствующее жизнедеятельности обоих партнеров. «РгоЫойс»-организм, участвующий в симбиозе и благоприятствующий жизни.
Впервые термин “пробиотик” был предложен Лилли и Стильбер в 1965 году как антоним антибиотика для обозначения микробных метаболитов, обладающих способностью стимулировать рост микроорганизмов [249, 252].
В начале 70-х годов применять термин «пробиотики» предложили финские ветеринарные врачи, которые в начале добавляли в корм курам определенные бактерии группы кишечных палочек. В результате куры развивались лучше и росли быстрее, чем это наблюдалось, когда курам давали традиционный корм [240].
Последующие достижения в области изучения микробной экологии человека позволили внести уточнения в первоначальное определение пробиотиков. По мнению многих современных исследователей, пробиотики - препараты из живых микроорганизмов или стимуляторов роста микробного, животного, растительного происхождения, оказывающие благотворное влияние на индиген-ную микрофлору. Попытку внести ещё большую определенность в толкование этого термина недавно предприняли английские учёные, предложившие называть пробиотиками только пищевые добавки микробного происхождения, проявляющие свои позитивные эффекты на организм хозяина через регуляцию кишечной микрофлоры. Учёные Европейского Института экологии жизни под термином «пробиотики» понимают живые микробиологические пищевые ингредиенты, которые полезны для организма человека [169]. На современном этапе в нашей стране учёные считают, что наиболее соответствущим современному уровню знаний является следующее определение “ пробиотики - это препараты и продукты питания, в состав которых входят вещества микробного происхождения, оказывающие при естественном способе введения благоприятные эффекты на физиологические функции и биохимические реакции организма хозяина через оптимизацию его микроэкологического статуса” [252].
Учёными установлено, что между состоянием здоровья человека и составом микрофлоры его желудочно-кишечного тракта существует тесная взаимосвязь. При нормальном физиологическом состоянии взаимоотношения макроорганизма и микрофлоры носят симбиотический характер, сложившийся и закрепившийся в процессе эволюционного развития [22, 48, 66, 130, 135, 157, 249, 250, 338, 403, 424]. Нарушения нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека могут вызываться различными факторами: неблагоприятными воздействиями окружающей среды, стрессами, антибиотиками широкого спектра действия и другими терапевтическими средствами и т.п. В настоящее время установлено, что непосредственными причинами большинства болезней являются дисбактериозы - патологические нарушения состава микрофлоры кишечника человека. По последним данным Российской АМН распространение различных форм дисбактериоза в России достигло масштабов национальной катастрофы, затронув более 90% населения [169]. Изменение видового и количественного соотношения полезной микрофлоры приводят к подавлению нормофлоры слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта и бурному развитию условно-патогенных бактерий, которые выделяют токсичные вещества, вызывающие самоотравление организма. Условно-патогенные микроорганизмы в процессе жизнедеятельности вырабатывают большое количество индола, скатола, сероводорода, которые, попадая в кровь, увеличивают токсическую нагрузку на печень, оказывая отрицательное влияние на ее функцию, способствуют появлению или усилению симптомов интоксикации при различных заболеваниях. Некоторые штаммы Е.coli могут продуцировать нит-розамины из нитратов или нитритов и вторичных аминов, которые являются потенциальными канцерогенами [100, 158, 162, 207, 270].
Генетические методы
В этой связи большой научный и практический интерес представляют генетические исследования механизмов взаимодействия между бактериофагами и клетками бактерий, которые до сих пор полностью не щучены, Бактериофаги не всегда уничтожают своих хозяев, они могут находиться внутри клеток бактерий и не репродуцироваться (профаги). Бактерии, содержащие профаги, называют лизогенными. При этом клетки бактерий размножаются и обладают определенным иммунитетом к действию фагов, гомологичным к фагам, находящимся внутри них, но в то же время могут лизироваться другими фагами [32, 173], Лизогения клеток микроорганизмов является наследственным признаком, так как происходит передача информации потомству о строении нуклеиновых кислот фагов, находящихся в данной клеткеУчеными установлено, что при воздействии неблагоприятных факторов на клетку ( недостаток гоггательных веществ, действие низких и высоких температур, действие УФ-йЗлучения, митомицина С и других антибиотиков и химических веществ) фаги могут возобновить нормальный цикл развития и привести к лизису культур [34, 84, 281, 316]. Существуют штаммы, которые могут освобождаться от бактериофага самопроизвольно [32, 374]. Этим объясняется постоянное присутствие в культурах ЛйЗОгенных бактерий и свободных бактериофагов [89, 127, 142, 147, 173]. Иногда воспроизводство фагов приводит к появлению так называемых дефектных фагов, т.е. неспособных превращаться в инфекционный фаг- псевдолизогения и полилизогения, которые встречаются среди микроорганизмов различных систематических групп [89, 108, 173, 176, 177]. Многие исследователи считают, что большинство штаммов лактобактерий являются лизогенными культурами [89, 140, 325, 388, 390]. Но Лйзогенные штаммы не всегда удается выделить, что по -видимому, можно объяснить отсутствием соответствующих индикаторных (фагочувствйтельных) культур и определенных условий для выявления умеренного фага [190]. По мнению ряда ученых, вирулентные фаги, дизирую-щие одновременно несколько культур, можно отнести к мутантам умеренных [89, 309]. Об этом еввдетельетаует их близость морфологических и генетических нризнаков [372, 374, 454].
Эффективность взаимодействия фагов с соответствующими им бактериями-хозяевами в течение внутриклеточного цикла, выражается в длительности латентного периода и количества образующихся частиц фагов и зависит От условий Среды и физиологических свойств бактерий, В одной бактериальной клетке за 30 мин. образуется от 40 до 300 фаговых частиц. Репродукция фага осуществляется лишь тогда, когда уровень и характер обмена веществ в клетке бактерии обеспечивает возможность реализации биологических процессов, необходимых для образования новых частиц [47, 68]. Это лишь подтверждает, что сами клетки бактерий могут быть источником бактериофагов, но не раскрывает сущности данного явления. В литературе имеются малочисленные сведения о механизме фагоуетойчивости клеток бактерий к бактериофагам [254]. Для более полного изучения данной проблемы необходимо проводить дальнейшие исследования.
Анализируя литературные данные, можно сделать заключение о сложнейшей проблеме бактериофагии, которая до настоящего времени на пред 54 приятиях молочной отрасли остается нерешенной. Все это требует проведения фундаментальных исследований по изучению механизма фагорезистент-ности; выделению бактериофагов, лизирующих молочнокислые бактерии, и изучению их свойств; получению фагоустойчивых штаммов молочнокислых бактерий, устойчиво сохраняющих это свойство; совершенствованию методов выявления бактериофагов и способов предотвращения фаголизисов, возникающих на предприятиях молочной промышленности.
Другим важным фактором, влияющим на ход процесса трансформации исходного сырья, является изменение свойств у применяемых культур и бактериальных заквасок.
В то же время ещё в 50-ые и 60-ые годы как зарубежным, так и отечественным ученым удавалось выделять культуры мезофильных молочнокислых бактерий, чувствительные и нечувствительные к сезонным изменениям качества молока. Исследования таких культур свидетельствовали о том, что сезонные изменения качества молока не оказывают заметного влияния на интенсивность обмена веществ у этих микроорганизмов [16, 72, 98, 300, 301, 303]. Исследования, проведенные отечественными учеными в середине 70-ых и 80-ых годов, показали, что наибольшей стабильностью обладают культуры с малой изменчивостью клеток в популяции. Популяции содержат биохимически активные и неактивные клетки, соотношение которых определяет потенциальную жизнеспособность культур и их резервную стойкость. Л.A. Банниковой и СБ. Задояна было установлено, что влияние периодических перевивок штаммов в обезжиренное молоко на соотношение активных и неактивных вариантов отдельных культур подвида «lactis» различно: периодические перевивки в течение весенне-летне-осеннего периода практически не меняют это соотношение у большинства культур с первоначально гомогенной популяцией клеток и смещают его в сторону увеличения неактивных вариантов у гетерогенных культур, чем и объясняли изменение свойств культур. На основании полученных результатов исследований во ВНИМИ был разработан метод отбора культур, устойчивых к сезонным изменениям химического состава молока, по составу популяции клеток [71]. Исследования изменчивости популяций термофильных молочнокислых стрептококков показали, что эти культуры в отличие от культур лактококков обладают более компактной популяцией клеток и способны обеспечивать нормальный процесс сквашивания молока в разные сезоны года [16,55,72]. Интересно, что культуры ацидофильных бактерий проявляют стабильные свойства в течение многих лет. С теоретических позиций изменения свойств у молочнокислых бактерий пока не объяснены.
По лучение фагоустойчивых штаммов мезофильных молочнокислых бактерий
Микроскопирование препаратов проводили в соответствии с ГОСТ 9225-84 и Инструкцией по микробиологическому контролю [80].
Количество клеток бифидобактерий определяли путем высева ряда последовательных разведений, приготовленных по ГОСТ 9225-84, по 1см3 в два параллельных ряда пробирок на плотную кукурузно - лактозную среду ВНИМИ. Посевы инкубировали в термостате при температуре (37±1)С в течение 2-3 суток с последующим подсчетом выросших колоний в каждом разведении. Количество клеток определяли путем умножения числа колоний на соответствующее разведение.
Учет количества бифидобактерий в смешанных с молочнокислыми бактериями культурах проводили в соответствии с инструкцией по микробиологическому контролю [80]. Для этого готовили стерильный раствор неомицина из расчета (0,5±0,01)г неомицина в (500±1)см3 стерильной дистиллированной воды. Водный раствор антибиотика в количестве 0,1см3 добавляли перед расплавлением в плотную КЛС (массовую долю агара увеличивали до (17±2)г на 1дм3 питательной среды), разлитую в пробирки по 20см3. Учет количества бифидобактерий проводили после термостатирования посевов в течение 3-5 суток.
Количество клеток лактококков определяли методом предельных разведений на стерильном обезжиренном молоке с выдержкой посевов в течение 3 суток при температуре (30±1)С с составлением числовой характеристики по ГОСТ 10444.11-91 [53]. В смешанных с бифидобактериями культурах учет количества лактококков проводили с помощью посева соответствующих разведений на чашки Петри под агар с гидролизованным молоком с последующим термостатированием посевов в течение 3 суток.
Определение устойчивости к антибиотикам проводили по методу серийных разведений в жидкой питательной среде. Устойчивость к антибиотикам бифидобактерий определяли на кукурузно-лактозной среде [80], а ацидофильных бактерий - на стерильном обезжиренном молоке. В среды вводили различные концентрации стерильных растворов антибиотиков и 16-часовые культуры бифидобактерий или ацидофильных бактерий в количестве 5%. Устойчивость к различным концентрациям антибиотиков определяли по изменению титруемой кислотности в образцах после 18 ч, 48 ч, и 7 суток инкубирования при температуре (38±1)С для штаммов бифидобактерий и после 6 ч, 18 ч ,48 ч инкубирования при той же температуре для штаммов ацидофильных бактерий.
Для культивирования молочнокислых бактерий применяли обезжиренное стерильное молоко, а также молоко, гидролизованное панкреатином в разведении 1:2, рН 7,0. При проведении исследований применяли среды из гидролизованного молока, разведенного водой в соотношении 1:2, из которого готовили плотную (1,5% агара); полужидкую (0,75% агара); жидкую (без агара) среды, а также среды с массовой долей цитрата натрия 0,5%; 1%; 2%; рН среды 7,0±0,1.
Выявление наличия бактериофагов в исследуемых образцах проводили модифицированным нами методом, заключающемся в следующем: образцы прогревали в водяной бане до температуры (48±1)С, охлаждали до температуры (20±1)С и устанавливали рН 4,0-4,6 для более полного осаждения белков, после чего фильтровали через бумажный фильтр. Затем пробы пропускали через мембранный фильтр №3. Полученные стерильные фильтраты переносили в стерильные пробирки и испытывали на наличие или отсутствие в них частиц фагов на плотной питательной среде однослойным методом. Для этого на чашки Петри с подсушенной питательной средой наносили 0,1см3 бульонной 6-часовой индикаторной (чувствительной) культуры, растирали на поверхности шпателем Дригальского и оставляли на 10-15 мин для впитывания влаги в агар. Затем на чашку под наклоном наносили каплю исследуемого материала так, чтобы капля стекала по поверхности чашки, затем ее закрывали крышкой и оставляли на 10-15 мин при комнатной температуре. После чего чашки переворачивали и термостатировали при температуре (32±1)С в течение 16-18ч.
Если после указанного времени термостатирования наблюдали зону угнетения роста в месте нанесения капли, то устанавливали перевиваемость литического агента.
Для этого в пробирку с 1см3 стерильного гидролизованного молока помещали кусочек агара, взятый из зоны лизиса, тщательно взбалтывали и оставляли на 30 мин для более полного выхода частиц фага из агара. Затем каплю суспензии из пробирки наносили на свежеприготовленный газон индикаторной культуры и термостатировали 16-18 ч. если негативная (прозрачная) зона появлялась вновь, то считали, что угнетение роста культуры вызвано действием бактериофага. Далее проводили накопление частиц бактериофага. Для этого в оставшуюся суспензию вносили Зсм3 гидролизованного молока и индикаторную культуру, термостатировали при температуре (32±1)С в течение 16-18 ч и получали лизат бактериофага путем центрифугирования культуральной жидкости в стерильных центрифужных стаканчиках при 6000 об/мин в течение 20 мин и пропускали через мембранный фильтр №3.
Титр бактериофага определяли двухслойным методом. Для этого в пробирку с 3-3,5см3 расплавленного полужидкого агара, остуженного до 45С, вносили смесь индикаторной 6-часовой культуры и фага соответствующего разведения. Эту смесь выливали на поверхность застывшего и подсушенного плотного агара в чашки Петри. После застывания верхнего слоя чашки термостатировали при температуре (32±1)С в течение 16-18 ч. в результате на фоне сплошного бактериального роста появляются зоны лизиса. Титр бактериофага определяли путем подсчета числа стерильных зон и умножения этого числа на соответствующее разведение.
Изучение детерминации ароматообразования
Одним из важнейших путей предотвращения фаголизиса на производстве является использование фагоустойчивых культур и заквасок. В некоторых зарубежных странах применяют монокультуры, которые подбирают для каждого предприятия с учётом бактериофагов, выделенных с данного производства. Применение фагоустойчивых одноштаммовых заквасок возможно при высокой санитарно-гигиенической культуре производства, применении асептических линий, очистке воздуха от вирусов, а также постоянном контроле фагового фона и систематическом выделении фагов, циркулирующих на предприятии, с последующим подбором фагоустойчивых штаммов к этим фагам. В биотехнологии кисломолочных продуктов в нашей стране до настоящего времени все перечисленные выше условия пока не выполняются. Поэтому монокультуры у нас в стране практически нельзя применять и стоит задача получения фагоустойчивых заквасок на основе использования устойчивых к фагам штаммов бактерий. Создание коллекции фагов с широким спектром действия позволило провести отбор фагоустойчивых культур лактококков, выделенных из природных источников, из имеющейся коллекции микроорганизмов Центральной лаборатории микробиологии ГУ ВНИМИ.
Кроме того, в выполняемой работе были использованы следующие направления получения фагоустойчивых культур: -выделение штаммов из популяций культур или заквасок с производственно-ценными свойствами, но чувствительных к бактериофагам; -культивирование штаммов мезофильных молочнокислых бактерий совместно с бактериофагами и выделение фагоустойчивых культур.
Результаты проведенных исследований показали, что все пути получения фагоустойчивых штаммов, обладающих производственно -ценными свойствами, довольно длительны, требуют больших трудовых затрат. Количество отобранных штаммов во всех случаях составляло 10-17% от выделенных культур бактерий. В дальнейшей работе представляло интерес изучить, как будут сохраняться свойства у полученных штаммов лактококков. Всего было исследовано 55 штаммов Lactococcus lactis subsp. . lactis (Lcc. lactis), 72 - Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetilactis (Lcc. diacetilactis), 53- Lactococcus lactis subsp. cremoris (Lcc.cremoris). Наблюдения за свойствами штаммов проводили в течение года, при этом изучали следующие свойства: активность сквашивания молока, органолептические показатели, энергию кислотообразования, отношение к бактериофагам (индекс фагоустойчивости), развитие культур путём микроскопирования и способность к ароматообразованию -для Lcc. diacetilactis.
Исследуемые культуры Lactococcus lactis subsp. lactis сквашивали молоко в течение 4,5-24,0 ч; образовывали сгустки плотные, средней плотности и слабые; консистенция была различной: однородная, гомогенная или с мягкой крупкой; вкус чистый кисломолочный, иногда сливочный, а у некоторых штаммов отмечали посторонний вкус или горечь. Предел кислотообразования через 7 суток составлял (90-150) Т. При просмотре микроскопического препарата в поле зрения наблюдали преимущественно диплококки, иногда собранные в цепочки. Штаммы Lactococcus lactis subsp. lactis, которые имели активность сквашивания более 7 ч и пороки во вкусе, были отбракованы. Изучение индекса фагоустойчивости свидетельствовало об изменении этого показателя у многих культур (табл.4.2.). Условно все культуры разделили на три группы: - культуры, которые сохраняли индекс фагоустойчивости на уровне 90-100%,-устойчивые; - культуры, у которых в течение всех сезонов года индекс фагоустойчивости был на уровне (0-10)% -чувствительные; - культуры, у которых индекс фагоустойчивости сильно изменялся от 11% до 92% - колеблющиеся.