Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Информационно-аналитический обзор 13
1.1. Основные положения государственной политики Российской Федерации в области здорового питания населения 13
1.2. Функциональные продукты питания и их значение 18
1.3. Дрожжи - биорациональное сырье для получения белка и биологически активных веществ 1.3.1. Систематическое положение и основные свойства дрожжей 30
1.3.2. Особенности химического состава дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Kluyveromyces marxianus 38
1.3.3. Биотехнологические методы переработки молочной сыворотки с использованием дрожжей 45
1.3.4. Теоретические основы культивирования хлебопекарных дрожжей Saccharomyces cerevisiae 55
1.3.5. Фермент инулиназа: продуценты, свойства и применение... 63
1.4. Биотехнологический потенциал сои, амаранта, топинамбура,
грибов вешенка VI
1.4.1. Соя - источник белка и биологически активных веществ 71
1.4.1.1. Особенности химического состава сои 71
1.4.1.2. Антиалиментарные вещества сои 75
1.4.1.3. Основные направления использования сои в пищевой промышленности 80
1.4.1.4. Лечебно-профилактические свойства соевых продуктов..
1.4.2. Амарант - источник антиоксидантных соединений для получения функциональных продуктов питания 90
1.4.3. Топинамбур - источник пищевых волокон 96
1.4.4. Особенности химического состава и лечебные свойства
грибов вешенка обыкновенная (Pleurotus ostreatus) 102
Глава 2. Объекты и методы исследований
Глава 3. Получение, изучение и применение штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Kluyveromyces marxianus 120
3.1. Получение новых штаммов Saccharomyces cerevisiae 121
3.1.1. Высокопродуктивный штамм Saccharomyces cerevisiae ZS \2\
3.1.2. Штамм Saccharomyces cerevisiae G с инулиназной активностью 128
3.2. Молекулярно-генетическое изучение экспрессии генов Р" фрук тозидаз дрожжей Saccharomyces cerevisiae G и Kluyveromyces marxianus Y-l 148 с помощью ПЦР 134
3.3. Использование топинамбура для получения биомассы дрожжей
Saccharomyces cerevisiae G и Kluyveromyces marxianus Y-1148 142
3.3.1. Исследование влияния инулина на дрожжи Saccharomyces cerevisiae G ж Kluyveromyces marxianus Y-l 148 142
3.3.2. Разработка способа получения биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae G выращиванием на соке топинамбура 152
3.4. Разработка технологии дрожже-сывороточного концентрата биомодификацией молочной сыворотки 157
Глава 4. Разработка технологий функциональных напитков с использованием листьев амаранта 169
4.1. Изучение антиоксидантных свойств листьев амаранта (Amarantus paniculatus) 170
4.2. Определение оптимальных условий получения экстрактов листьев амаранта с высокой антиоксидантной активностью 170
4.3. Применение метода цветометрии для изучения антиоксидантной активности экстрактов листьев амаранта 176
4.4. Биотехнология функционального сывороточного напитка с экстрактом амаранта 181
4.5. Разработка технологии пивного напитка с использованием листьев амаранта 190
Глава 5. Разработка технологий функциональных продуктов питания на основе сои и грибов вешенка 197
5.1. Изучение химического состава и антипитательных свойств сортов сои в условиях ЦЧР 197
5.1.1. Изучение генетического полиморфизма сортов сои с помощью метода RAPD-imp 206
5.1.2. Изучение способов инактивации антипитательных вещества семян сои и соевых продуктов 210
5.2. Разработка безотходной технологии переработки сои для получения функциональных продуктов 215
5.2.1. Исследование микробиологических процессов в сквашенных соевых и молочных продуктах 215
5.2.2. Разработка технологий функциональных напитков на основе соевого молока 221
5.2.3. Разработка способа получения синбиотической добавки биомодификацией соевой окары 225
5.3. Разработка технологий функциональных пищевых продуктов с
использованием грибов вешенка обыкновенная (Pleurotus ostreatus) 230
Заключение 242
Перечень сокращений и обозначений, принятых в работе 246
Список литературы
- Биотехнологические методы переработки молочной сыворотки с использованием дрожжей
- Штамм Saccharomyces cerevisiae G с инулиназной активностью
- Определение оптимальных условий получения экстрактов листьев амаранта с высокой антиоксидантной активностью
- Разработка безотходной технологии переработки сои для получения функциональных продуктов
Введение к работе
Актуальность проблемы. В современных условиях население России испытывает влияние комплекса неблагоприятных факторов, таких как экологическое неблагополучие, неполноценное питание, возрастание стрессовых воздействий, что ведет к снижению продолжительности жизни и рождаемости, иммунитета и устойчивости к заболеваниям и неблагоприятным факторам окружающей среды. Несмотря на положительные тенденции в питании населения РФ, смертность от хронических болезней, развитие которых связано с алиментарным фактором, остается высокой. В соответствии с концепцией государственной политики в области здорового питания основные направления решения этой проблемы предусматривают расширение отечественного производства основных видов продовольственного сырья, отвечающего современным требованиям качества и безопасности, создание функциональных продуктов питания, обладающих высокой биологической ценностью и физиолого-метаболическими свойствами, повышающими адаптационные способности человека в условиях «экологического риска».
Большой вклад в развитие теоретических и практических основ технологии функциональных продуктов внесли отечественные ученые А.А. Покровский, В.А. Тутельян, В.Б. Спиричев, В.М. Позняковский, Л.Н. Шатнюк, Б.П. Суханов, А.Г. Храмцов, И.А. Рогов, Л.А. Забодалова, Т.В. Меледина, З.С. Зобкова и другие.
Актуальным направлением на современном этапе является поиск новых сырьевых источников белка и биологически активных веществ, разработка и совершенствование биотехнологических способов для создания функциональных пищевых продуктов, включающих нутриенты растительного происхождения. Введение в состав пищевых продуктов нетрадиционных растительных культур дает возможность не только создавать биологически активные аминокислотные комплексы, но и оказывать существенное влияние на органолепти-ческие показатели, структурно-механические свойства готовой продукции, ход реакций ферментации и цветообразования. Получение функциональных продуктов питания на основе сои, амаранта, топинамбура, грибов вешенка, содержащих биологически активные вещества, обладающие антиоксидантными, гепатопротекторными, пребиотическими и иммуностимулирующими свойствами, будет способствовать решению основных вопросов рационального питания и ликвидации дефицита белка и микронутриентов в пищевых продуктах.
К настоящему времени в России подавляющее большинство пищевых ингредиентов импортируется, в связи с чем организация их производства является актуальной, социально востребованной задачей. Эффективность решения этой проблемы во многом определяется применением продуктов микробиологического синтеза и биомассы одноклеточных организмов. Поэтому получение и использование новых высокопродуктивных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Kluyveromyces marxianus, обладающих высокой ферментативной активностью, поиск новых субстратов для получения экологически безопасной биомассы дрожжей с высоким содержанием биологически активных веществ являются актуальными.
В связи с этим исследования, посвященные селекции и изучению перспективных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Kluyveromyces marxianus, и разработке технологий функциональных продуктов питания на основе растительных культур амаранта, топинамбура, сои, грибов вешенка, являются актуальными.
Работа выполнена в 2000-2014 гг. в соответствии с отраслевыми научными программами в рамках Российской научно-технической программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации по теме: «Проведение научных исследований и развитие экологически безвредных, высокотехнологичных методов комплексной переработки продукции сельского хозяйства».
Цель работы - исследование и обоснование технологических параметров биомодификации пищевого сырья, получение и изучение штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Kluyveromyces marxianus для использования в процессах биомодификации, разработка технологий функциональных низкокалорийных продуктов питания.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
осуществить селекционные исследования по получению новых штаммов дрожжей S. cerevisiae с высокой продуктивностью и ферментативной активностью, позволяющих расширить спектр субстратов для производства дрожжевой биомассы;
провести молекулярно-генетические исследования регуляции экспрессии генов Р-фруктозидаз дрожжей S. cerevisiae и К. marxianus с помощью ПЦР;
исследовать влияние инулина на дрожжи S. cerevisiae G и К. marxianus Y-1148 и разработать способ получения биомассы дрожжей выращиванием на соке топинамбура;
разработать технологию дрожже-сывороточного концентрата биомодификацией молочной сыворотки дрожжами К. marxianus Y-1148;
обосновать оптимальные условия получения экстрактов листьев амаранта A. paniculatus, обладающих высокой антиоксидантной активностью; разработать рецептуры и технологии функциональных напитков с их содержанием;
изучить химический состав и антипитательные свойства сортов сои в условиях Центрально-Черноземного региона (ЦЧР) и методы их инактивации; разработать биотехнологии функциональных напитков на основе соевого молока;
разработать рецептуры и технологии низкокалорийных функциональных пищевых продуктов с использованием грибов вешенка (Pleurotus ostreatus);
разработать техническую документацию на полученные функциональные продукты питания и провести производственную апробацию.
Научная новизна работы. Получен новый штамм дрожжей S. cerevisiae ZS, отличающийся высокой продуктивностью и ферментативной активностью. Штамм депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов ИБФМ РАН, регистрационный номер ВКМ Y-2902D (Патент № 2209828).
Получен новый штамм дрожжей S. cerevisiae G, отличающийся способностью к ферментации инулина и росту на средах, содержащих инулин в качестве единственного источника углерода.
Научно обоснована эффективность использования штамма S. cerevisiae G для получения биомассы на соке топинамбура без предварительного гидролиза инулина, что позволяет объединять процессы его осахаривания и ферментации.
Проведены молекулярно-генетические исследования регуляции экспрессии генов Р-фруктозидаз дрожжей S. cerevisiae G и К. marxiamis Y-1148. Определена экзон-интронная структура генов, кодирующих ферменты Р-фруктофуранозидазу и инулиназу дрожжей S. cerevisiae G и К. marxiamis Y-1148, и осуществлен подбор праймеров для проведения количественной ПЦР. Выявлена зависимость показателя экспрессии генов Р-фруктозидаз дрожжей 5. cerevisiae G и К. marxiamis Y-1148 от источника углерода. Для S. cerevisiae G - синтез инулиназы конститутивный и не регулируется катаболитной репрессией, для К. marxiamis Y-1148 — индуцибельный и подвержен катаболитной репрессии.
Установлено стимулирующее действие инулина и сока топинамбура на накопление биомассы дрожжей S. cerevisiae G и К. marxiamis Y-1148 при ферментации солодового сусла и молочной сыворотки.
Научно обоснованы и экспериментально подтверждены параметры биомодификации молочной сыворотки дрожжами К. marxiamis Y-1148 для получения дрожже-сывороточного концентрата, изучен его аминокислотный состав и установлена высокая биологическая ценность.
Научно обоснованы и экспериментально подтверждены оптимальные условия получения экстрактов амаранта с высокой антиоксидантной активностью, разработаны новые функциональные напитки на их основе - сывороточный напиток с экстрактом амаранта и пивной напиток «Амарантный».
Установлено стимулирующее действие экстрактов листьев амаранта A. penicillatus на дрожжи S. cerevisiae при выращивании в молочной сыворотке и пивном сусле.
Методом компьютерной цветометрии определены значимые коэффициенты корреляции между значениями антиоксидантной активности и красной компонентой модели цветности экстрактов амаранта.
Получены новые функциональные продукты на основе соевого молока и грибов вешенка, сбалансированные по аминокислотному составу, с высокой биологической ценностью и низкой калорийностью.
Практическая значимость работы. Получены новые штаммы дрожжей S. cerevisiae, отличающиеся высокой продуктивностью. Штамм дрожжей S. cerevisiae ZS внедрен в производство ЗАО «Воронежские дрожжи». Это позволило увеличить на 18% выработку дрожжей с хорошими хлебопекарными свойствами.
Разработан способ выращивания инулиназоактивных дрожжей S. cerevisiae на соке топинамбура, позволяющий увеличить выход биомассы дрожжей на 24% по сравнению с выходом при выращивании на питательной среде, приготовленной из мелассы. Получено положительное решение на заявку «Способ выращивания хлебопекарных дрожжей» (Заявка № 2014143297 от 27.10.2014 г.)
Биомодификацией молочной сыворотки дрожжами К. marxiamis Y-1148 получен дрожже-сывороточный концентрат, который по содержанию белка соответствует обезжиренному молоку, по содержанию лейцина, тирозина, суммы метионина и цистина превосходит белок молока соответственно в 1,5; 2,0
и 1,5 раза, по органолептическим свойствам напоминает молоко, что позволяет рекомендовать его к применению в производстве молочных продуктов.
Разработаны технологии и рецептуры новых функциональных продуктов питания на основе соевого молока, грибов вешенка, листьев амаранта, сбалансированные по аминокислотному составу, обладающие высокой пищевой ценностью и низкой калорийностью, потребление которых будет способствовать улучшению структуры питания населения (патенты №2367158, № 2367158, №2370041).
Разработана технология пивного напитка «Амарантный», содержащего экстракт листьев амаранта. Технология апробирована в производственных условиях пивоваренных предприятий ООО «Райт» и ООО «ЧП Артель» г. Воронежа.
Разработан проект технической документации на производство функциональных продуктов питания (ТУ и ТИ): №9232-016-00492894-2015 «Напиток сывороточный с экстрактом амаранта»; №9146-017-00492894-2015 «Напиток соевый сквашенный»; №9146-018-00492894-2015 «Напиток соевый десертный», технологическая инструкция по производству пивного напитка «Амарантный» ГОСТ 55292-2012 ПА-ТИ №03-12-2014.
Результаты исследований используются в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторно-практических работ студентов, обучающихся по направлению ЗБ.03.07 «Технология производства и переработки сельскохозяйственной продукции».
Научная новизна и практическая значимость работы подтверждена получением шести патентов РФ.
Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на международных и региональных научных, научно-практических конференциях и съездах: I, II, V съездах Общества биотехнологов России (Москва, 2004, 2005, 2008); Всероссийской научно-технической конференции-выставке «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва, 2004); «Пищевые технологии» (Казань, 2004); «Экология безопасности человека: концепция факторов риска, экологической безопасности и управления рисками» (Пенза, 2006); «Актуальные проблемы развития технологии производства продуктов питания» (Воронеж, 2008); «Современные технологии производства продуктов питания: состояние, проблемы и перспективы развития» (Воронеж, 2010); «Биология - наука XXI века» (Москва, 2012); «Глинковские чтения» (Воронеж, 2013); «Производство и переработка с/х продукции: менеджмент качества и безопасности» (Воронеж, 2013); «Агротехнологии XXI века: концепции устойчивого развития» (Воронеж, 2014); «Биотехнология: реальность и перспективы» (Саратов, 2014).
Публикации. Автор имеет 79 научных работ, по материалам исследований опубликовано 50 печатных работ, в том числе 21 - в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК России, из них - 6 патентов РФ.
Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена постановка задач, моделирование изучаемых процессов, научное обоснование и обобщение результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосред-
ственном участии на всех этапах исследования и обсуждения результатов в научных публикациях и докладах.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, перечня сокращений и обозначений, принятых в работе, списка литературы и приложений. Материалы диссертационной работы изложены на 293 страницах компьютерного текста и включают 46 рисунков, 52 таблицы, 12 приложений. Список цитируемой литературы содержит 312 наименований, в том числе 77 - иностранных.
Биотехнологические методы переработки молочной сыворотки с использованием дрожжей
Исследования последних лет свидетельствуют о существенном изменении структуры питания современного человека. Согласно научно обоснованной концепции оптимального питания, разработанной В.А. Тутельяном [109], питание населения экономически развитых стран, в том числе и населения России, можно охарактеризовать как кризисное в связи с существующим дефицитом в обеспеченности микронутриентами (витаминами, минеральными и биологически активными веществами). Научно-технический прогресс привел к повсеместной автоматизации и компьютеризации производства, внедрению разнообразной бытовой техники в повседневную жизнь. Это привело к существенному снижению энергозатрат людей и в настоящее время они составляют в среднем около 2000-2300 ккал/сут. При этом произошло снижение объема потребляемой человеком пищи и ее ассортимента, в результате чего обеспеченность человека микронутриентами и биологически активными веществами также изменилась. Поэтому современный человек не может с рационом из обычных натуральных продуктов питания, обеспечивающих энергозатраты, удовлетворить на достаточном уровне потребности организма всеми необходимыми для поддержания его жизнедеятельности микронутриентами за счет традиционного питания, поскольку пищевые продукты содержат витамины, микроэлементы и биологически активные вещества в обычных количествах.
Рацион питания россиян в настоящее время характеризуется избыточным потреблением жиров животного происхождения и легкоусвояемых углеводов, дефицитен микронутриентами природного происхождения. Вместе с тем отмечается дефицит в отношении полноценного белка, минеральных веществ (железо, кальций, фосфор и др.), пищевых волокон (пектин, камеди, целлюлоза и др.), витаминов, полиненасыщенных жирных кислот (омега-3 и омега-6), микроэлементов (йод, селен, цинк, медь и др.), а также минорных компонентов, участвующих в регуляции метаболизма. Недостаточное содержание этих пищевых веществ и биологически активных соединений в рационе приводит к формированию иммунодефицитных состояний, к снижению резистентности организма к инфекционным агентам и неблагоприятным факторам окружающей среды, снижению рождаемости и продолжительности жизни.
В последние годы в результате научных исследований в области нут-рициологии была установлена биологическая роль многих микронутриентов, доказано их участие в метаболических процессах и необходимость наличия в рационе питания [41]. Установлены факторы пищи, приводящие к укреплению здоровья и снижению риска развития многих заболеваний, повышению качества жизни. Ведутся исследования по изучению физиологической роли и молекулярных механизмов их действия на организм человека.
Исследованиями последних лет установлена роль для человека биологически активных веществ, таких как изофлавоны, изотиоционаты, полиф-руктаны, инулин, хлорофилл, кофеин, органические кислоты (яблочная, янтарная, и др.), глюкозамины, хитозан, глюкоманнаны и многие другие. Определены многообразные функции различных групп флаваноидов (флаванолы и их гликозиды - кверцетин, рутин и др.; флавоны - лютеолин, апигенин и др.; флавононы - нарингенин, гесперидин и др.; дигидрофлаванолы, проатоциа-нидины, катехины и др.), фенольных соединений (гидроксикоричные кислоты, гидрохинон и др.), индолов. Эти соединения играют важную роль для снижения риска развития многих заболеваний, установлена их протекторная роль в отношении различных форм онкологических заболеваний. Все указанные природные вещества и соединения характерны для традиционных пищевых продуктов животного и растительного происхождения. Однако их содержание довольно низкое, и увеличение поступления в организм этих веществ невозможно реализовать путем увеличения употребления традиционных пищевых продуктов. Поэтому необходимы альтернативные источники таких веществ и соединений, в которых их содержание на порядки больше. Такими источниками являются продукты микробного синтеза, грибы, лекарственные растения продукты моря, и др. Это обуславливает целесообразность их регулярного употребления в дополнение к основному рациону в составе специализированных видов пищи.
В основе современных представлений о здоровом питании лежит концепция оптимального питания, согласно которой необходимо обеспечивать потребности организма не только в энергии, эссенциальных макро- и микро-нутриентах, но и в необходимых минорных компонентах путем оптимизации структуры питания за счет введения в рацион специализированных продуктов питания. Которыми являются функциональные продукты питания. Отличием этих продуктов от традиционных продуктов питания является то, что они не только обладают определенными питательными свойствами, но и оказывают целенаправленное действие на функциональную активность организма. Функциональные пищевые продукты - это продукты, созданные человеком с целью придания ему определенных свойств, направленных на сохранение и улучшение здоровья.
Согласно ГОСТ Р 52349-2005, функциональный пищевой продукт {functional food) предназначен для систематического употребления в составе пищевых рационов всеми возрастными группами здорового населения, обладающий научно обоснованными и подтвержденными свойствами, снижающий риск развития заболеваний, связанных с питанием, восполняющий имеющийся в организме человека дефицит питательных веществ, сохраняющий и улучшающий здоровье за счет наличия в его составе функциональных пищевых ингредиентов [102, 28].
Штамм Saccharomyces cerevisiae G с инулиназной активностью
Для получения экспериментальных данных в процессе диссертационного исследования проводили комплекс физико-химических, микробиологических и молекулярно-генетических исследований.
Материалом для проведения микробиологических исследований служили штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae-JIB, Saccharomyces cerevisiae-ZS, Kluyveromyces marxianus Y-1148, пробиотические бациллы Bacillus cereus 1147, молочнокислые бактерии родов Bifidumbacterium и Lactobacterium, штаммы Escherichia coli, полученные главным образом из Всероссийской коллекции микроорганизмов (г. Пущино).
Объектами растительного происхождения служили семена сои и амаранта, полученные из коллекции кафедры растениеводства ВГАУ. Исследовали семена сои сортов, занесенных в государственный реестр и допущенных к использованию в ЦЧР: Аннушка, Воронежская 31, Россь, Ясельда, Белгородская 48, Воронежская 6 урожая 2010-2012 гг. Растительные образцы амаранта A. paniculatus L. были выращены в ботаническом саду ВГУ в 2009-2012 гг. Сбор растений проводили в фазы бутонизация, начало цветения (распускание первых сережек); конец цветения (менее чем у половины цветков тычинки производят пыльцу).
Клубни топинамбура сорта «Интерес» выращены в Семилукском районе Воронежской области урожая 2009, 2010, 2011 гг.
Объектами животного происхождения были творожная молочная сыворотка, продукции ВМК «Вкуснотеево» и тушки перепелов продукции ООО «Интерптица» Новоусманског района Воронежской области.
Соевое молоко получали водной экстракцией из замоченных семян сои. Сухие соевые бобы тщательно промывали в 2-3-х водах и замачивали в воде (1:4) в течение 8-10 ч при температуре 18-23С. После набухания семена очищали от оболочек и измельчали. К полученной массе добавляли профильтрованную водопроводную воду (при гидромодуле 1:6) и при постоянном по помешивании смесь нагревали в течение 15 мин и еще 20 минут кипятили. После чего разделяли твердую и жидкую фазу отжимом и фильтровали молоко через мешочные фильтры. Стерилизовали соевое молоко автоклавиро-ванием 20 мин при 121С [142]. Состав соевого молока: массовая доля сухих веществ - 8,5%, белок - 3,4%; жир - 1,2; углеводы - 2,6; рН - 6,7.
Для получения экстрактов использовали свежесобранные, сушеные и замороженные листья. Удаление влаги из листьев проводили методом естественной сушки и замораживанием при температуре -18С. Для получения экстрактов листья амаранта измельчали до частиц размером 2,5-5 мм. Водно-спиртовые экстракты отобранных образцов растений готовили настаиванием при температуре 8С в течение 14 суток в растворах с объемной долей этилового спирта 40%.
Водные экстракты из листьев амаранта получали по ГОСТ 1938-85 «Чай. Методы анализа» [39] путем заваривания их кипящей дистиллированной водой и настаивания в течение 15 минут (в соотношении 1:10 для свежих и замороженных листьев и 1:20 для сухих листьев). По методу получения экстрактов согласно методике получения настоев по ГФ XI [45] измельченные листья заливали дистиллированной водой и нагревали на кипящей водяной бане в течение 15 мин и охлаждали при комнатной температуре 60 мин. После охлаждения проводили фильтрование и пастеризацию экстрактов.
Анализ параметров цветности изображений проводился в режиме offline с использованием программ интегрального анализа цветности в среде пакета Mathcad 14 или MatLab 7. При расчете параметров калибровки автоматически формировался файл данных с коэффициентами регрессионных уравнений, парной корреляции R и величиной дисперсии S. Использовались цветовые модели RGB и Irgb [93].
Антиоксидантную активность (АОА) определяли вольтамперометриче-ским способом на анализаторе по методике Яшина Я.И. на приборе «ЯУЗА -01» [208, 235]. Методика предназначена для измерения содержания антиок-сидантов (СА) в водорастворимых, напитках (соках, чае, винах, пиве, квасах), экстрактах растений в диапазоне 0,2-4,0 мг кверцетина (стандарта)/дм . В случае если измеренная величина СА превышает 4,0 мг/дм , предусматривается разбавление пробы бидистиллатом до 1000 раз. Величина СА образцов определяется содержанием в них природных флавоноидов, в частности, кате-хинов (вещества группы флавана); кверцетина, рутина, дигидрокверцетина (вещества группы флавона); а также витаминов и других соединений, способных связывать свободные радикалы.
В основе данной методики лежит амперометрический способ определения содержания антиоксидантов, заключающийся в измерении электрического тока, возникающего при окислении исследуемого вещества на поверхности рабочего электрода при определенном потенциале и сравнении полученного сигнала с сигналом стандарта (кверцетина), измеренного в тех же условиях. Возникающие электрические токи очень малы, в пределах 10 6 -10"9 А, эти аналоговые сигналы усиливаются, а затем, с помощью АЦП, преобразуются в цифровой сигнал, который регистрируется на дисплее компьютера. Проводят по 5 последовательных измерений сигналов (площади выходной кривой) стандартных растворов кверцетина. По полученным данным строят калибровочный график в координатах: X - сигнал кверцетина (площадь вы-ходной кривой); Y - концентрация кверцетина, мг/дм , описываемый уравнением: Y = аХ + Ь.
При изучении инулиназной активности дрожжи выращивали на синтетической среде (г/л водопроводной воды): 20,0 источника углерода; 5,0 (NH4)2S04; 0,85 КН2Р04; 0,15 К2НР04; 0,5 MgS04; 0,1 NaCl; 0,1 CaCl2, 2,0 дрожжевой экстракт, рН 5,0 [71]. Среду стерилизовали 20 мин при 121С и инокулировали суспензией дрожжей, полученной смывом с сусло-агара до концентрации 1x10 кл/мл среды. Дрожжи выращивали на термостатируемой качалке в колбах объемом 250 мл с 50 мл питательной среды при 30 С и 200 об/мин в течение 24 часов. Биомассу дрожжей отделяли от питательной среды путем центрифугирования при 2600 g в течение 10 мин при 2С и ее использовали для получения водного экстракта фермента, а надосадочную жидкость использовали для определения внеклеточного секретируемого фермента, который содержится в КЖ. Для экстрагирования фермента биомассу дрожжей промывали водой и осаждали центрифугированием, подсу 113
шивали до влажности 75%, затем растирали в ступке со стеклянным песком и дистиллированной водой в соотношении 1:10. Растертую биомассу выдерживали 20 мин при температуре 20С, после чего проводили центрифугирование для осаждения обломков разрушенных клеток и песка, а полученную надосадочную жидкость использовали для определения активности внутриклеточной инулиназы.
Определение оптимальных условий получения экстрактов листьев амаранта с высокой антиоксидантной активностью
Одним из путей решения существующего дефицита белка является использование микроорганизмов в качестве белковых сырьевых субстратов: бактерий, дрожжей, микромицетов, водорослей. Большое значение в выборе дрожжей как продуцентов белковой биомассы имеют их большая скорость роста, способность к росту в условиях глубинного культивирования, нетребовательность к условиям культивирования [60]. Дрожжевая биомасса представляет собой физиологически полноценный высокобелковый продукт благодаря высокому содержанию белка, оптимально сбалансированного по аминокислотному составу, полноценному комплексу витаминов, минеральных веществ и полисахаридов, что позволяет ее использовать в качестве биорационального сырья. Содержание лизина в дрожжах выше, чем в бактериях и водорослях, они содержат более низкие количества нуклеиновых кислот (6-12% от сухой массы). Белок дрожжей усваивается на 80-85% и занимает промежуточное положение между белками животного и растительного происхождения. Сегодня дрожжевую биомассу применяют в пищевой промышленности как белковый обогатитель, усилитель вкуса, для получения витаминов, биологически активных добавок и ферментов [236, 68, 232, 161].
Перспективными источниками пищевого белка являются дрожжи S. cerevisiae и К. marxianus. Они разрешены к использованию в пищевой промышленности [155], характеризуются высоким содержанием белка, высокой скоростью роста и ферментативной активностью. В связи с этим исследования по получению новых штаммов дрожжей S. cerevisiae с высокой продуктивностью и ферментативной активностью, а также разработка способов получения экологически чистой биомассы на их основе являются актуальными.
Актуальной проблемой дрожжевой промышленности является создание высокорентабельных, экологически чистых технологий. Одним из путей решения этой проблемы является создание и внедрение в производство новых продуктивных штаммов S. cerevisiae с высокой ферментативной активностью, применение которых позволит интенсифицировать производство, расширить спектр сырья для использования в качестве среды выращивания, улучшить качество выпускаемой продукции.
В биотехнологических производствах со временем происходит смена производственных рас дрожжей, одни заменяются другими, изменяются взгляды на выбор признаков, характеризующих активную производственную расу. Дрожжи хлебопекарных рас должны обладать свойствами, определяющими их пригодность для хлебопечения, показателями таких свойств является подъемная сила и мальтазная активность. Нами была поставлена задача: получить новый штамм дрожжей S. cerevisiae, обладающий комплексом признаков, ценных для хлебопекарных дрожжей, которыми являются высокая продуктивность и высокая активность ферментативного комплекса, широкий температурный оптимум, устойчивость к ингибиторам мелассы и хорошие хлебопекарные свойства. Эта задача была достигнута путем создания нового высокопродуктивного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Штамм был назван «Saccharomyces cerevisiae ZS», где «ZS» - начальные буквы фамилий первых двух авторов, выполненные буквами английской транслитерации («Z» - Земсков, «S» - Соколенко) [119]. Штамм депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов ИБФМ РАН, регистрационный номер ВКМ Y-2902D.
Штамм S. cerevisiae ZS получен методом естественной селекции путем отбора активных вариантов из культуры производственных дрожжей S. cerevisiae ЛВ-7 [118]. Родительский штамм S. cerevisiae ЛВ-7 имел следующие биотехнологические характеристики: мальтазная активность - 170-180 мин., подъемная сила 43-47 мин. Недостатком этого штамма были невысокая мальтазная активность и недостаточно высокая устойчивость к ингибиторам мелассных сред, что сказывается на выходе биомассы и качестве выпускаемой продукции. В проведенных исследованиях из посевов производственной культуры S. cerevisiae ЛВ-7 на селективной среде были отобраны 40 клонов. Скрининг высокоактивных клонов проводили по повышенной продуктивности и подъемной силе по методу Е. А. Плевако и О. А. Бакушинской [143]. Отобраны 4 клона с высокой скоростью подъема теста, из них налучшие результаты имел клон №4 (таблица 9).
Микроскопия отобранных 4 клонов показала, что клон № 4 наряду с наиболее высокой подъемной силой имел наиболее крупные клетки округлой и овальной формы. Этот клон послужил основой для получения чистой культуры штамма дрожжей S. cerevisiae ZS.
Морфологические свойства полученного штамма изучали микроскопи-рованием односуточной культуре на солодовом сусле плотностью 8-10% на СВ. Дрожжи штамма S. cerevisiae ZS имели форму клеток круглую и овальную, преобладающая форма - круглая, со средним диаметром 8,5 мкм. Средние размеры овальных клеток были 6,5-10,5 мкм. На основании полученных результатов размеры клеток штамма S. cerevisiae ZS можно характеризовать как крупные. Дрожжи этого штамма хорошо спорулируют на ацетатной среде, споры от 1 до 4 в аске, форма спор круглая, оболочка гладкая.
Культуральные признаки: на сусло агаре через двое суток дрожжи штамма S. cerevisiae ZS образуют круглые колонии, выпуклые, кремового цвета, блестящие пастообразные по консистенции, с ровными краями, диаметр колоний 4,5-5,0 мм. При выращивании в жидком сусле формируют плотный осадок, кольцо и пленку не образуют, сбраживают сусло с образованием пены. Отношение к температуре: минимальная - 8С, максимальная -40С. Важным свойством полученного штамма является его оптимальная температура роста - 37С. Устойчивость к повышенным температурам является положительным свойством производственных рас хлебопекарных дрожжей.
Штамм S. cerevisiae ZS сбраживает и ассимилирует глюкозу, сахарозу, мальтозу, рафинозу (1/3), не ферментирует лактозу, целлобиозу, мелибиозу, растворимый крахмал, не ассимилирует нитраты.
Дрожжи хлебопекарных рас должны обладать свойствами, определяющими их пригодность для хлебопечения, показателями таких свойств является подъемная сила и мальтазная активность. Мальтазная активность характеризует способность дрожжей гидролизовать мальтозу муки и зависит от присутствия в дрожжах фермента мальтазы. Установлено, что дрожжи штамма S. cerevisiae ZS имеют улучшенные технологические характеристики по сравнению с родительским штаммом: подъемную силу 40-42 мин (ЛВ-7 -170-180 мин), мальтазную активность 40 мин (ЛВ-7 - 43-47 мин), зимазную активность - 36 мин, являются осмоустойчивыми (осмоустойчивость - 8-10 мин). Полученный штамм характеризуется высокой продуктивностью и накапливает биомассу до 40 г/л на солодовом сусле и на мелассной среде -до 60 г/л с аэрацией в лабораторных условиях и до 110 г/л в условиях производства на стадии товарных дрожжей.
Важным свойством хлебопекарных рас дрожжей является их устойчивость к ингибиторам мелассы. Критериями устойчивости является количество пересевов, которые они могут выдерживать при выращивании на данной мелассе (5-6 пересевов - хорошие) [158]. Полученный нами штамм обладает высокой устойчивостью к ингибиторам мелассы и способностью конкурировать с посторонней микрофлорой мелассы. Дрожжи штамма выдерживали 6 пересевов при выращивании на мелассе.
Разработка безотходной технологии переработки сои для получения функциональных продуктов
Разработан пакет технической документации на сывороточный напиток с экстрактом амаранта: ТУ № 9232-016-00492894-2015 и ТИ № 9232-016-00492894 (приложения 3,4).
Проведены исследования по получению пробиотического сывороточного кваса, обогащенного витамином С. Творожная сыворотка по содержанию В1, В2 и ниацина соответствует требованиям, предъявляемым к функциональным продуктам, но содержится мало витамина С (4,7 мг%), который необходим для поддержания иммунитета и работоспособности, аскорбиновая кислота также обладает выраженными антиоксидантними свойствами [215]. При получении пробиотического сывороточного кваса сыворотку обогащали витамином С в количестве 15 мг%, что составляет 25% от суточной нормы. В качестве закваски была использована культура молочнокислых бактерий «Наринэ» совместно с хлебопекарными дрожжами S.cerevisiae. «Наринэ» представляет собой штамм молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus n.v. Ер 317/402, который обладает высокой приживаемостью в желудочно-кишечном тракте, витаминообразующей способностью, устойчивостью к антибиотикам, антагонизмом по отношению к патогенным микроорганизмам, способствует нормализации микрофлоры кишечника. Для получения закваски 5% кисломолочной закваски вносили в сыворотку и выращи-вали при температуре 35С сутки (концентрация 1x10 КОЕ/см ). Возбудителями спиртового брожения служили хлебопекарные дрожжи S.cerevisiae «Воронежские» (прессованные дрожжи и жидкая дрожжевая закваска, полученная из агаровой культуры). Определены оптимальные количества вносимой дрожжевой закваски - 5 %.Для придания напитку цвета, характерного квасу, вносили 1% колера (жженого сахара).
Были получены 3 пробы напитка: № 1 - сбраживанием сыворотки дрожжами; № 2 - сбраживанием сыворотки дрожжами и Наринэ; № 3 -сбраживанием сыворотки, содержащей витамин С, дрожжами и Наринэ. При оопределениии интенсивности газообразования в пробах показано, что более активное выделение газа было в пробах, содержащих культуру Наринэ, что свидетельствует о ее стимулирующем действии на бродильную активность дрожжей. Напиток, содержащий витамин С, был более насыщен газом. Определена титруемая кислотность полученных напитков. Для пробы №1 она была 80Т, №2 - 95Т. Более высокая кислотность имела проба № 3 -100Т, что свидетельствует о стимулирующем действии витамина С на активность молочнокислых бактерий Наринэ. Посевом на специальную среду определен титр молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus в пробах №2 и №3. Показано, что концетрация пробиотической культуры Нарине в пробе №2 составила 4,3x109 КОЕ/см3, а в пробе кваса, содержащего витамин С она была в 3,5 раз выше - 1,5хЮ10 КОЕ/см3.
При определении органолептических свойств полученных напитков установлено, что проба № 1 имела выраженный вкус молочной сыворотки, проба № 2 имела вкус, характерный для кваса, но была слабо насыщена газом. Наилучшими вкусовыми свойствами обладал образец кваса, полученный сбраживанием сыворотки с добавлением аскорбиновой кислоты комбинированной закваской, содержащей дрожжи S. cerevisiae и культуру молочнокислых бактерий Наринэ. Он имел освежающий кисло-сладкий вкус, характерный для кваса [96].
В результате проведенных исследований разработана рецептура про-биотичекого напитка на основе молочной сыворотки (мас.%): творожная сыворотка - 90; комбинированная закваска - 5; сахарный песок - 4; колер - 1; аскорбиновая кислота- 15 мг%.
Готовый напиток по внешнему виду и консистенции - однородная жидкость светло-коричневого цвета с незначительным осадком, имеет кисло-сладкий вкус, освежающий, аромат, характерный квасу, хорошо насыщен газом и слегка напоминает шампанское. Содержание пробиотической культурой Наринэ и витамина С придает напитку функциональную направленность. Аскорбиновая кислота стимулирует развитие пробиотической культуры Нарине в 3,5 раза и усиливает профилактические свойства полученного напитка [105].
В настоящее время пивоваренная индустрия - одна из наиболее динамично развивающихся отраслей пищевой промышленности. Современной тенденцией пивоваренного производства является расширение ассортимента путем выпуска пивных напитков с использованием нетрадиционного растительного сырья с целью формирования новых органолептических, физиологических и физико-химических свойств напитков [205, 115, 114]. Обогащение напитков биологически активными веществами повышает их биологическую ценность, позволяют улучшить вкус и уменьшить отрицательное влияние этанола на организм [230].
Амарант во всех частях растения содержит большой набор биологически активных веществ, в том числе обладающих антиоксидантной активностью и является перспективным сырьем для получения пиваных напитков. К настоящему времени разработаны технологии комплексной переработки всей надземной части амаранта - семян и листьев. Г.И. Косминский с соавторами разработали рецептуру нового сорта пива с использованием 30% амаранта в виде муки из его семян для получения напитка с пониженным содержанием глютена [82]. Разработаны чайные продукты, обогащенные листовой массой амаранта [79]. Однако листья амаранта в пивоваренном производстве не применялись.
В связи с этим были произведены исследования по разработке технологии пивного напитка с использованием сушеных листьев амаранта, как источника антиоксидантных соединений. Листья амаранта A. paniculatus были собраны в фазу цветения, высушены и получен экстракт методом настоев по ГФ XI. Определена антиоксидантная активность экстракта амперометриче-ским методом, равная 241 мг/л (стандарт - кверцетин).
На первом этапе проведены исследования по влиянию экстракта амаранта на активность пивоваренных дрожжей. В лабораторных условиях был получен пивой напиток сбраживанием охмеленного сусла (12% СВ). Для брожения использовали пивные дрожжи расы S.cerevisiae W 34/70. В опытные образцы вносили различные количества водного экстракта амаранта из сухих листьев (0,5-5,0%). Сбраживание вели при 12С в течение 5 суток, дображивали 2 недели при 2С. В готовых образцах напитка определяли биомассу дрожжей и их физиологическое состояние. Результаты по определению влияния содержания экстракта амаранта в сусле на активность пивных дрожжей представлены на рисунке 35.