Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Анализ проблемы повышения качества алкогольных и безалкогольных напитков на основе солодов и экстрактов 20
1.1 Методология создания и повышения эффективности интенсивных наукоемких технологий напитков 20
1.2 Характеристика зерновых культур для производства напитков 22
1.3 Зерновые биоресурсы с заданными свойствами для получения напитков и экстрактов на основе солодов 30
1.4 Растительное сырье как источник биологически активных веществ для производства напитков 33
1.5 Современное состояние и тенденции развития технологий напитков 37
1.6 Практические приемы для улучшения технологических свойств полупродуктов и напитков 43
1.7 Характеристика наукоемких технологий напитков с позиций химии пищи: оценка функциональных свойств 47
1.8 Основные принципы оценки качества и проектирования напитков 51
Глава 2 Организация эксперимента, объекты и методы исследований 55
2.1 Характеристика объектов исследования 55
2.2 Условия выполнения экспериментальных исследований 56
2.3 Методы исследований 57
2.4 Математические методы обработки экспериментальных данных 65
Глава 3 Разработка режимов производства экстрактов
3.1 Разработка режимов процесса получения экстрактов древесины 66
3.1.1 Исследование влияния ультразвуковой обработки на показатели экстрактов 71
3.1.2 Разработка экспериментального метода определения диффузионных характеристик древесины дуба Q. robur, вишни P. cerasus и сливы P. nigra 74
3.2 Разработка режимов процесса получения ПСЭ и ППЭ 86
3.2.1 Оптимизация технологических режимов получения гречишного солода 86 3.2.2 Разработка режимов затирания 89
3.2.3 Оптимизация режимов распылительной сушки ПСЭ и ППЭ 93
3.2.4 Исследование ПСЭ и ППЭ с помощью рентгеноструктурного анализа 101
Глава 4 Разработка режимов производства напитков на основе солодов и экстрактов 108
4.1 Разработка режимов производства спиртных напитков на основе зерновых дистиллятов 108
4.1.1 Оптимизация технологических режимов получения специальных солодов для приготовления сусла 109
4.1.2 Биотехнология зернового сусла 114
4.1.3 Изучение перспектив применения различных видов микроорганизмов для получения сброженного сусла 118
4.2 Разработка режимов производства безалкогольных напитков с применением ПСЭ и ППЭ 127
4.2.1 Исследование перспектив применения бифидобактерий в технологии квасов 132
4.2.2 Оценка интенсивности биосинтетических процессов в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae 140
Глава 5 Исследование закономерностей при оценке функциональных свойств экстрактов 147
5.1 Кардиомониторинг волонтеров для установления влияния напитков с ПСЭ на уровень физического и психоэмоционального состояния 147
5.2 Оценка антимутагенных свойств ПСЭ и ППЭ с использованием микроядерного теста в буккальном эпителии человека 158
5.3 Оценка безопасности ПСЭ и ППЭ 168
5.4 Исследование биологически активных компонентов экстрактов 169
5.5 Обоснование характеристик ПСЭ и ППЭ как ингредиентов функциональных продуктов 181
Глава 6 Прогнозирование качества и проектирование напит ков сбалансированного состава с заданными потребительскими и медико-биологическими требованиями 183
6.1 Прогнозирование качества и проектирование спиртных напитков 183
6.2 Проектирование безалкогольных напитков с применением ПСЭ и ППЭ 196
6.2.1 Разработка методики проектирования безалкогольных напитков с учетом сбалансированности состава 197
6.2.2 Проектирование функциональных напитков для диетического, лечебно-профилактического, реабилитационного рационов питания
6.3 Практическое применение основных результатов работы 219
6.3.1 Практическое использование методологии и результатов проектирования для разработки спиртных напитков 219
6.3.2 Практическое использование методологии и результатов проектирования при разработке безалкогольных напитков для диетического, лечебно-профилактического, реабилитационного рационов питания 222
Глава 7 Оценка экономической эффективности разработанных технологий 233
Заключение 247
Список сокращений и условных обозначений 250
Список литературы
- Растительное сырье как источник биологически активных веществ для производства напитков
- Условия выполнения экспериментальных исследований
- Разработка экспериментального метода определения диффузионных характеристик древесины дуба Q. robur, вишни P. cerasus и сливы P. nigra
- Исследование перспектив применения бифидобактерий в технологии квасов
Введение к работе
Актуальность работы. Разработка наукоемких технологий пищевых продуктов отечественного производства, отвечающих современным требованиям качества и безопасности, является одной из приоритетных задач государственной политики, положенных в основу стратегии развития пищевой промышленности.
Перспективна разработка технологий и рецептур качественных алкогольных напитков из зернового сырья, в составе которых отсутствуют синтетические пищевые добавки, с применением натуральных ингредиентов рецептур. Не теряет актуальности проектирование безалкогольных напитков массового и функционального назначения на основе солодовых и полисолодовых экстрактов, которые показаны к применению в различных рационах питания с учетом медико-биологических требований и сбалансированности компонентного состава.
Для контроля постоянного уровня безопасности и качества
новых групп напитков необходима система прогнозирования ка
чества и проектирования рецептур, отражающая в аналитическом
виде функциональные связи между технологическими, экономи
ческими параметрами ингредиентов, характеристиками готовых
изделий и ограничениями требований нормативной
документации.
Значительный вклад в развитие теории и практики разработки алкогольных и безалкогольных напитков с применением экстрактов из растительного сырья внесли Л. А. Оганесянц, Э. М. Соболев, И. М. Скурихин, С. В. Востриков, J. Piggott; К. А. Калунянц, Н. А. Емельянова, В. Е. Балашов, В. А. Домарец-кий, В. А. Помозова, Т. Ф. Киселева, D. Goode.
Работа выполнена в рамках прикладных научных исследований и экспериментальных разработок (НИР № 3017) базовой части государственного задания № 2014/22 в сфере научной деятельности; приоритетного направления развития НОЦ «»Живые системы» ВГУИТ «Живые системы в технологиях переработки сельхозсырья и обеспечении здорового питания»; плана госбюджетной научно-исследовательской работы кафедры «Технология бродильных и сахаристых производств» по теме «Совершенствование технологических процессов бродильных и сахаристых производств с использованием физико-химических, ресурсосберега-
ющих, биохимических методов воздействия и нетрадиционного сырья» (№ государственной регистрации 114121670054).
Цель работы. Разработка напитков на основе солодов и экстрактов с применением интенсивных технологий, отвечающих современным требованиям качества и безопасности, для увеличения доли использования российского зернового сырья и импорто-замещения.
Для достижения поставленной цели в работе были сформулированы задачи:
обосновать выбор биоисточников из растительного сырья с рекомендуемым составом ферментативного комплекса и биологически активных компонентов;
разработать режимы получения водно-спиртовых экстрактов древесины дуба, вишни, сливы со сбалансированным составом с применением рационального способа обработки древесины и интенсификацией процесса экстрагирования;
разработать экспериментальный метод определения диффузионных характеристик древесины дуба Q. robur, вишни P. cerasus и сливы P. nigra с исследованием кинетики процесса экстрагирования;
научно обосновать рациональные и оптимальные параметры процессов производства солодов, солодовых и полисолодовых экстрактов с применением математического моделирования процесса распылительной сушки, рентгенодифракционного исследования;
разработать оптимальные режимы процесса солодора-щения, рациональные режимы затирания при получении сусла для производства зерновых дистиллятов, исследовать возможность биологического подкисления дрожжевого сусла с применением МКБ;
исследовать биосинтетические свойства, морфологические и биохимические особенности различных видов микроорганизмов в технологии квасов на основе ПСЭ и ППЭ;
провести оценку функциональных свойств ПСЭ и ППЭ по содержанию витаминов, микроэлементов, биофлавоноидов, глютена в сравнении с величиной РСП, с применением показателей кардиомониторинга, с помощью микроядерного теста в бук-кальном эпителии;
систематизировать результаты исследований состава зерновых дистиллятов и водно-спиртовых экстрактов, разработать метод оценки и прогнозирования качества спиртных напитков, рассчитать соотношения экстрактов древесины дуба, вишни, сливы в рецептурах;
разработать метод проектирования безалкогольных функциональных напитков на основе ПСЭ и ППЭ с получением рецептур напитков с учетом сбалансированности состава для рационов диетического, лечебно-профилактического, реабилитационного питания;
разработать интенсивные технологии алкогольных и безалкогольных напитков на основе солодов и экстрактов из растительного сырья, провести апробацию технических решений в опытно-производственных условиях; разработать техническую документацию для производства спектра новых продуктов; рассчитать экономическую эффективность технологических решений.
Научная концепция работы
Научное обоснование совокупности биотехнологических приемов для производства сбалансированных многокомпонентных алкогольных и функциональных безалкогольных напитков на основе экстрактов из растительного сырья и зерновых биоресурсов с разработкой методов прогнозирования качества и проектирования.
Научные положения, выносимые на защиту:
оптимальные параметры процессов получения солодов из пшеницы, ячменя, ржи, гречихи с аппроксимацией значений активности ферментативного комплекса;
метод определения диффузионных характеристик древесины дуба Q. robur, вишни P. cerasus и сливы P. nigra с расчетом продолжительности цикла получения экстрактов древесины в колонне с рециркуляцией экстрагента и неподвижным слоем щепы;
- математические модели для оптимизации процессов по
лучения экстрактов древесины с помощью ультразвука; для оцен
ки и прогнозирования качества спиртных напитков с расчетом
критерия качества по методике QFD и построением матрицы
«Дом качества»; для оптимизации параметров процесса сушки
солодовых и полисолодовых экстрактов;
- результаты оценки функциональных свойств ПСЭ и ППЭ
с научным обоснованием перспектив их применения в техноло
гии безалкогольных напитков;
- метод проектирования безалкогольных функциональных
напитков на основе ПСЭ и ППЭ с учетом сбалансированности
состава и заданными медико-биологическими свойствами.
Научная новизна
Разработана математическая модель для оптимизации режимов ультразвуковой обработки при экстрагировании древесины, а также экспериментальный метод определения диффузионных характеристик древесины дуба Q. robur, вишни P. cerasus и сливы P. nigra с расчетом продолжительности цикла получения экстрактов.
Разработана физико-математическая модель распылитель
ной сушки солодовых и полисолодовых экстрактов с воспроизве
дением основных механических, тепло- и влагообменных процес
сов в результате компьютерных экспериментов и оптимизацией
параметров процесса сушки. Впервые методом рентгенострук-
турного анализа проведено сравнительное исследование струк
турно-механических свойств ПСЭ и ППЭ с оценкой
растворимости.
Научно обоснованы функциональные свойства ПСЭ и ППЭ с применением показателей кардиомониторинга, изучением антимутагенных свойств, исследованием адаптогенной активности и состава биологически активных компонентов.
Получены закономерности развития микроорганизмов при варьировании состава среды и сбраживании сусла в производстве напитков на основе солодов и экстрактов с изучением влияния рецептурных компонентов на продолжительность процесса брожения.
Разработана система оценки, прогнозирования качества и проектирования спиртных напитков с расчетом критерия качества методом QFD и построением матрицы «Дом качества».
Разработан математический метод проектирования безалкогольных функциональных напитков с учетом сбалансированности состава по макронутриентам, незаменимым аминокислотам, макроэлементам для создания рационов питания.
Практическая значимость работы
Модифицирована технология спиртных напитков с применением экстрактов древесины дуба, вишни, сливы на основе зерновых дистиллятов из солодов и несоложеного сырья. Разработаны рецептуры и технологические режимы для производства спиртных напитков с оптимальным соотношением водно-спиртовых экстрактов и прогнозированием качественных показателей.
Разработаны технологические режимы для производства
ПСЭ и ППЭ на основе солодов гречихи, кукурузы, гороха, ячменя
и безалкогольных напитков. Разработан метод проектирования
напитков с заданными медико-биологическими характеристика
ми на основе комбинаций ПСЭ и ППЭ. Разработаны практиче
ские рекомендации к составлению рецептур и карт проектирова
ния функциональных напитков со сбалансированным составом
ингредиентов для рационов диетического, лечебно-
профилактического, реабилитационного питания.
Новизна технических решений и практическая значимость работы подтверждена 7 патентами РФ.
Разработаны проекты технической документации на экстракты и напитки: ТУ 8240-365-02068108-2015 «Напиток спиртной из зернового сырья «Солодовый», ТУ 8433-367-02068108-2015 «Экстракты солодовые», ТУ 8515-368-02068108-2015 «Квасы «Богатырские», ТУ 8510-366-02068108-2015 «Концентраты напитков в потребительской таре».
Апробированы рецептуры и технологии водно-спиртовых экстрактов и алкогольных напитков; порошкообразных солодовых и полисолодовых экстрактов, квасов, концентратов для безалкогольных напитков в потребительской таре на основе ПСЭ и ППЭ в опытно-производственных условиях ООО «Партнер», г. Воронеж; ООО ЛВЗ «Кристалл-Лефортово», г. Саранск; ЗАО «Родник», Калужская область; ООО «Концентрат», г. Рязань; ООО «Криница», г. Воронеж; ООО «Управляющая Компания «Трапеза», г. Новосибирск.
Основные финансово-экономические показатели выполненных разработок доказывают экономическую целесообразность внедрения разработанных технологий в производственную деятельность. Расчетный экономический эффект от реализации предлагаемых технических решений составляет 769,0 тыс. р. на
1000 дал выпускаемого спиртного напитка из зернового сырья, получаемого методом дистилляции, при годовой выручке 497,8 млн р.; на 1 т сухих концентратов напитков – 133,3 тыс. р. при годовой выручке 6,7 млн р.; на 1000 дал квасов – 57,8 тыс. р. при годовой выручке 350,9 млн р.; на 1 т ПСЭ и ППЭ – 51,5 тыс. р. при годовой выручке 9,1 млн р.
Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе, включены в лекционные курсы и практику научных исследований при реализации дисциплин «Физико-химические и биохимические основы бродильных и сахаристых производств», «Биотехнология продуктов бродильных производств», «Интенсификация технологических процессов бродильных производств» для подготовки бакалавров по направлению подготовки 19.03.02 – «Продукты питания из растительного сырья» и магистров по направлению подготовки 19.04.02 – «Продукты питания из растительного сырья» (магистерская программа «Биотехнология алкогольных, слабоалкогольных и безалкогольных напитков»), а также при разработке учебных планов и программ обучения дополнительного профессионального образования и повышения квалификации специалистов.
Практическая значимость работы подтверждена Департаментом Аграрной политики Воронежской области, разработки рекомендованы к реализации в рамках программы «Стратегии социально-экономического развития Воронежской области на период до 2020 года».
Соответствие темы диссертации паспорту научной специальности. Тема и содержание диссертационной работы соответствует пп. 3, 10, 12 паспорта специальности 05.18.07 – «Биотехнология пищевых продуктов и биологических активных веществ».
Степень достоверности и апробация результатов
Степень достоверности результатов проведенных исследований подтверждается проработкой информационно-патентных данных в соответствии с тематикой диссертационной работы, постановкой экспериментов, применением современных методов анализа, математической обработкой результатов исследований, публикацией основных положений работы в научных изданиях.
Основные положения и результаты работы доложены и обсуждены на ежегодных научных сессиях в ФГБОУ ВО «ВГУИТ»;
на международных и всероссийских научно-практических конференциях и форумах: «Пищевые технологии» (Казань, 2008); «Renewable Wood and Plant Resources: Chemistry, Technology, Pharmacology, Medicine» (Saint-Petersburg, 2011); «Биотехнологические системы в производстве пищевого сырья и продуктов: инновационный потенциал и перспективы развития» (Воронеж, 2011); «Современные методы аналитического контроля качества и безопасности продовольственного сырья и продуктов питания» (Москва, 2012); «European Applied Sciences: modern approaches in scientific researches» (Stuttgart, 2013); «Новое в технологии и технике функциональных продуктов питания на основе медико-биологических воззрений» (Воронеж, 2013-2014); «Science and Education in Australia, America and Eurasia: Fundamental and Applied Science. The 1st International Academic Conference» (Melbourne, 2014); «Zbior raportov naukovich «Wspolczesne tendencje w nauce I educacji» (Warszava, 2014); «Системный анализ и моделирование процессов управления качеством в инновационном развитии агропромышленного комплекса» (Воронеж, 2015).
Результаты работы демонстрировались на межрегиональ
ных выставках, форумах и конкурсах: 25-я Межрегиональная
специализированная выставка Продторг (Воронеж, 2008), VII
Межрегиональный экономический форум «Воронежская область
– наш партнер» (Воронеж, 2010), VI Воронежский Агропромыш
ленный форум, 11-я Межрегиональная специализированная вы
ставка «Урожай» (Воронеж, 2014), 31-я Межрегиональная специ
ализированная выставка «Пищевая индустрия» (Воронеж, 2014);
конкурс «Инженерные технологии XXI века» (ВГУИТ, 2012); Ев
ропейский конкурс инновационных пищевых продуктов
«Ecotrophelia Europe 2013» (Волгоград, 2013); конкурсы по про
грамме «У.М.Н.И.К» в 2014, 2015 гг.; межвузовский конкурс ин
новационных проектов «Кубок инноваций» (Воронеж, 2015).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 87 научных работ, в т. ч. 29 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 47 статей по материалам докладов на всероссийских и международных конференциях, 2 монографии, 1 учебное пособие с грифом УМО ТПП, 7 патентов РФ, 1 программа для ЭВМ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена в двух томах. Первый том состоит из введения, 7 глав, основных выводов и результатов, списка литературы из 328 источников, в том числе 47 – на иностранных языках, объемом 290 страниц машинописного текста, содержит 90 рисунков, 65 таблиц. Второй том состоит из 14 приложений, объемом 160 страниц.
Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации состоит в выборе направления исследований, проведении анализа литературных и патентных источников по проблеме диссертационного исследования, в постановке и выполнении основной части экспериментальных исследований по разработке рациональных и оптимальных режимов производства экстрактов и напитков; прогнозировании качества и проектировании алкогольных и безалкогольных напитков на основе экстрактов с заданным соотношением компонентов, технологическими и медико-биологическими свойствами с оценкой качества напитков в лабораторных и производственных условиях, в анализе и обобщении результатов исследований, их статистической и математической обработке, написании рукописи диссертации и автореферата.
Автором разработаны проекты технической документации на новые виды продуктов с применением солодов и экстрактов из растительного сырья, проведено патентование разработок, апробация разработанных технологий в опытно-производственных условиях.
Растительное сырье как источник биологически активных веществ для производства напитков
Для создания новых пищевых продуктов чрезвычайно важным аспектом являются вопросы, связанные с функциями питательных веществ пищевого сырья, их метаболизмом, потребностью, состоянием недостатка и избытка, влиянием на здоровье человека [28].
Основные питательные вещества сырья и продуктов, которые требуются для поддержания жизни – органические и неорганические соединения, которые можно объединить в пределах пяти категорий основных питательных компонентов: белки, углеводы, жиры, витамины, минеральные вещества, рассматриваемых в химии пищи в величинах рекомендуемых допусков [156, 47].
Можно выделить основные функции компонентов основных питательных веществ, выполняемые в организме человека: белок необходим в качестве источника незаменимых аминокислот для осуществления метаболизма, роста и восстановления тканей; углеводы – энергетические субстраты, ответственны за накопление и выработку энергии, обезвреживание и удаление из организма нежелательных веществ, регулирование жирового и белкового об 23 мена; жиры – запасники энергии, обеспечивают функцию сохранения и образования энергии, обеспечение поступления незаменимых жирных кислот, жирорастворимых витаминов, построение клеточных мембран, синтез гормонов, перенос липидных предшественников [28, 29, 30, 31].
К компонентам растительного сырья с наличием биологически активных свойств относятся терпены, полифенольные соединения, алкалоиды, гликозиды, фитогормоны, а также некоторые аминокислоты, белки, микроэлементы, витамины и др. [29, 32]. В технологиях напитков часто применяют злаковые культуры, в которых важна сбалансированность состава вышеперечисленных компонентов: ячмень, пшеница, рожь, кукуруза, также альтернативные сырьевые источники – гречиха, с возможностью ее применения в качестве безглютенового сырья; горох – как источник белковых веществ [27, 44]. Ниже рассмотрены перспективы применения злаковых культур и гороха в технологии напитков и экстрактов для получения солодов [41, 42, 43, 44, 45, 72, 73, 186].
Важнейшие технологические и биохимические характеристики зерновых культур для получения напитков и экстрактов
Основным источником сырья для производства солодовых экстрактов, а также зерновых дистиллятов являются несоложёное зерно и солода из соответствующих злаковых культур. Традиционными зерновыми культурами, из которых готовят солод для производства солодовых экстрактов, зерновых дистиллятов и напитков на их основе, являются рожь, ячмень, кукуруза, пшеница. Гречиха и горох рассматриваются как альтернативные сырьевые источники [59].
В производстве зерновых дистиллятов характеристики сырья определяются в основном, исходя из технологических требований к параметрам процессов осахаривания, сбраживания, а также к качеству получаемого дистиллята [22, 35, 36, 37, 38, 39, 46]. Основное требование к качеству зерновых культур, применяемых для производства солодов, - способность к накоплению потенциала внеклеточных и внутриклеточных ферментных систем. Ферменты злаковых культур, представляющие интерес для технологии напитков на основе зерновых дистиллятов, - карбогидразы, катализирующие гидролиз углеводов, крахмала и гемицеллюлоз.
Опыт производства алкогольных напитков-аналогов на основе зерновых дистиллятов показывает, что по технологическим характеристикам и способности к осахариванию выделяют группу ячменя, которая объединяет ячмень, рожь, пшеницу, с получением солодов с высокой а- и /?-амилолитической активностью [33, 34]. Из кукурузы получают солод со слабой величиной у#-амилолитической, значительной величиной декстринолити-ческой активности. Пшеницу, с наличием ферментов а- и -амилазы (в активной форме) применяют для производства некоторых видов спиртных напитков в США, в том числе, в составе зерновых композиций для виски, часто взамен кукурузы [22].
Различия в химическом составе зерновых культур предопределяют особенности технологии солодов и их последующего применения в производстве напитков [56, 57, 58].
Особенности физико-химического состава и технологические свойства зерна кукурузы, пшеницы, ржи, ячменя Кукурузу в основном применяют в качестве несоложеного сырья в производстве зерновых дистиллятов, а также в пивоварении.
Содержание крахмала в кукурузе в среднем составляет около 68 % от общего количества сухих веществ. Размер крахмальных гранул кукурузы составляет примерно 10 - 15 мкм, что предопределяет сравнительно высокий температурный интервал клейстеризации кукурузного крахмала (около 70 -80 С), у некоторых подвидов - 60 -70 С, при соотношении фракций амилозы и амилопектина в среднем 20/80 [67]. Некрахмалистые полисахариды кукурузы представлены целлюлозой, гемицеллюлозами, пентозанами и -глюканом, суммарное содержание некрахмалистых полисахаридов в кукурузе снижено, по сравнению с ячменем. Содержание клетчатки составляет от 0,7 до 2,2 %, пентозанов – от 4,2 до 6,2 %; водорастворимый -глюкан содержится в количестве 0,06 – 1,13 % от общего количества сухих веществ эндосперма.
Общее количество белковых компонентов в кукурузе находится в интервале 8,0 – 12,0 % от общего количества СВ. Белки кукурузы малорастворимы, в основном представлены проламинами и глютелинами, количество проламинов достаточно велико и составляет 56,0 %, что необходимо учитывать при разработке продуктов с пониженным содержанием глютена. Особенность фракционного состава белковых веществ кукурузы – низкое содержание фракций альбуминов и глобулинов (содержание глобулинов в зерне кукурузы в среднем в 3 раза снижено, по сравнению с зерном ячменя).
Перечисленные особенности фракционного состава белковых веществ зерна кукурузы свидетельствуют о возможности применения в качестве несоложеного материала наряду с ячменем, например, при разработке зерновых композиций в производстве зерновых дистиллятов – полупродуктов технологии спиртных напитков.
Количество аминокислот, содержащих серу, в частности, пролина в кукурузе незначительно ниже, чем в ячмене, содержание фенилаланина и вали-на примерно одинаково, ограничено содержание незаменимых аминокислот, лизина и триптофана. По сравнению с другими злаками кукуруза содержит меньше минеральных соединений.
Можно отметить, что применение кукурузы, содержащей высокий процент крахмала, в качестве источника углеводов целесообразно в технологии солодовых экстрактов. В зерне кукурузы содержатся ценные для питания вещества, которые являются органическими регуляторами обмена веществ – фитогормонами: влияющие на деление клеток ауксины, а также андрогены и эстрогены [59].
Условия выполнения экспериментальных исследований
Исследование состава полупродуктов и напитков проводили в научно-исследовательских лабораториях и Центрах ФГБОУ ВО «ВГУИТ»: на кафедрах ТБиСП, биохимии и биотехнологии, ТХКМиЗП; в ЦКП «Индустрия наносистем»; на базе исследовательской лаборатории Орехово-Зуевского филиала ФГУ «Менделеевский центр стандартизации, метрологии и сертификации», г. Воронеж; в испытательной лаборатории АНО «НТЦ» Комбикорм», г. Воронеж; в лаборатории «Молекулярной генетики и клеточной биологии» кафедры генетики, цитологии и биоинженерии ФГБОУ ВПО «ВГУ»; в лаборатории биотехнологии Орловского Биотехнологического центра сельскохозяйственных растений, г. Орел; в производственном центре ООО «Партнер», г. Воронеж; в Учебно-научно-методическом центре фармакологии, токсикологии и экологии ФВМ Воронежского ГАУ им. императора Петра I; в лаборатории рентгеноструктурного анализа на оборудовании кафедры материаловедения и физики металлов ФГБОУ ВПО «ВГТУ»; на оборудовании ГБОУ ВПО «ВГМА им. Н.Н. Бурденко»; в ООО «Компания Стайлаб», г. Москва.
Опытно-производственную и опытно-лабораторную апробацию проводили в условиях лаборатории и производства: ООО «Партнер», г. Воронеж; ООО ЛВЗ «Кристалл-Лефортово», г. Саранск; ЗАО «Родник», Калужская область; ООО «Концентрат», г. Рязань; ООО «Криница», г. Воронеж; ООО «Управляющая Компания «Трапеза», г. Новосибирск (приложение М).
Методы исследований Методы исследований при разработке спиртных напитков Оценку качества несоложеных материалов проводили по органолепти ческим показателям (ГОСТ10967-90), засоренности (ГОСТ 30483-97), натур ной массе зерна (ГОСТ 10840-64), относительной влажности (ГОСТ13586.5-93), крахмалистости (методом Эверса по ГОСТ 10845-98), со держанию белка (методом Кьельдаля по ГОСТ 10846-91), способности про растания (для зерна, поступающего на производство солода по ГОСТ 10968-88) [157]. Анализировали основные физико-химические показатели полученных солодов по ГОСТ 29294-92, 52061-2003. В осахаренном сусле контролировали содержание углеводов йодомет-рическим методом, аминного азота – «медным способом» [157]
В водно-спиртовых экстрактах древесины содержание углеводов контролировали методом тонкослойной хроматографии на пластинках «Silufol» (Новикова И.В., 2003).
По окончании брожения в зрелой бражке определяли объемную долю спирта, содержание несброженных сахаров, концентрацию сухих веществ, титруемую кислотность по методикам, принятым в спиртовом производстве («Инструкция по технохимическому и микробиологическому контролю спиртового производства», 1986; СанПиН 2.3.4.704-98).
Содержание микропримесей в образцах дистиллятов контролировали с помощью ГХ по ГОСТ Р 51762-2001, ГОСТ 30536-2013, ГОСТ 32039-2013.
Содержание флавоноидов в экстрактах древесины определяли с помощью ТСХ в системе «этилацетат - уксусная кислота - вода (5:1:1)» [23].
Обнаружение оксикоричных и фенолкарбоновых кислот проводили методом ТСХ в системе «хлороформ – метанол - вода (62:32:7)». Детектирование зон оксикоричных и фенолкарбоновых кислот проводили также по собственной флюоресценции в УФ-свете и после обработки хромогенными реактивами (пары аммиака, 3 %-ный спиртовой раствор треххлористого железа, раствор диазотированной сульфаниловой кислоты) [23].
Обнаружение кумаринов проводили в хлороформной фракции методом ТСХ в системах «этилацетат - бензол (1:2)» Детектирование осуществляли в УФ-свете до и после обработки обрабатывали 10 %-ным спиртовым раствором гидроксида калия, хроматограммы высушивали и прогревали при температуре 110-120 С (2-3 мин), после чего опрыскивали свежеприготовленным диазореактивом. Кумарины обнаруживали по ярко-голубой флюоресценции в УФ-свете до обработки хромогенными реактивами, а после обработки пятна приобретали флюоресценцию от кирпично-красного до сине-фиолетового цвета. Затем наиболее интенсивные зоны элюировали 96 %-ным этиловым спиртом с хроматографическим контролем фракций и идентификацией спектральными методами [23].
Идентификацию ароматических альдегидов и фенольных кислот проводили методом ВЭЖХ, с прибором, дающим возможность смешивания 2 растворителей, устройством для введения образца, спектрофотометрическим детектором (с изменяемой длиной волны) по ГОСТ 32195-2013.
Оптическую плотность экстрактов древесины контролировали с помощью спектрофотометра СФ-46. Для анализа производных галловой кислоты и ванилина в водно-спиртовых экстрактах и напитках использовали метод микроколоночной ВЭЖХ (Новикова, 2003). Анализ осуществляли на хроматографе Милихром-4 с колонкой u-Bondapak Сi8 (2x120 мм), размер частиц 10 мкм.
Общее содержание дубильных веществ в экстрактах древесины контролировали перманганатометрическим методом (Государственная Фармакопея. Методы исследования лекарственного растительного сырья, 1987). Для определения содержания таннинов содержащих фенольные -ОН группы в орто-положении, в пересчете кверцетин, применяли кондуктометрический метод (Новикова И.В., 2003).
Контроль антиоксидантной активности экстрактов древесины проводили на анализаторе антиоксидантной активности «ЦветЯуза-01-АА» [213].
Максимальный выход экстрактивных веществ из древесины, определяли извлечением веществ из щепы древесины вишни и сливы в аппарате Соксле-та с последующим взвешиванием сухого остатка. Для определения диффузионных характеристик древесины вишни, сливы использовали экспериментальную установку (рисунок 2.1) (Новикова И.В., Корниенко Т.С., 2012).
Разработка экспериментального метода определения диффузионных характеристик древесины дуба Q. robur, вишни P. cerasus и сливы P. nigra
Анализ полученных зависимостей показывает, что значения интегральных функций выделения диоксида углерода отличаются незначительно, различие составляет не более 6,6 %. В дальнейших исследованиях применяли оценку эффективности применения спиртовых и пивных дрожжей по основным технологическим параметрам: по величине объемной доли этанола в образцах сброженного сусла, по содержанию несброженных углеводов.
Максимальное содержание этанола наблюдали в образцах сброженного сусла, приготовленном с применением ферментных препаратов и спиртовых дрожжей – 9,4 % об. При применении пивных дрожжей объемная доля этанола достигла значения 8,9 % об. В образцах сброженного сусла, приготовленных настойным способом при применении спиртовых дрожжей содержание этанола составило 9,1 %, что на 3,2 % ниже, чем в сусле с использованием кукурузы. При применении пивных дрожжей содержание этанола в сброженном сусле было снижено и достигло значения 8,7 % об.
Сравнительные физико-химические показатели сброженного сусла, приготовленного на основе зерновых композиций (образцы 6 – ячменный и ржаной солод, 7 – ячменный, ржаной солод, кукуруза) с использованием спиртовых дрожжей представлены в таблице 4.4.
В результате исследований определена рациональная продолжитель ность этапа сбраживания комбинированного зернового сусла из ячменного, ржаного солодов, кукурузы с применением спиртовых дрожжей Sacch. cerevisiae, Fermiol, расы DY 7221 при температуре 30 оС. Исследование процесса биологического подкисления сусла с применением МКБ
Спиртовое и молочнокислое брожение – основной этап в производстве напитков на основе зернового сырья, вторичные и побочные продукты брожения оказывают большое влияние на их качество. Так высшие спирты обладают характерным запахом, образуют сложные эфиры, которые имеют приятные, смягченные ароматы. Сложные эфиры продуцируются дрожжами в ходе брожения при реакции взаимодействия образованных дрожжами спиртов с молекулами ацетил КоА. Основным продуктом взаимодействия является сложный эфир этилацетат. Важную роль в формировании вкуса и аромата также играют карбонильные соединения [33, 46].
Жизнедеятельность клеток микроорганизмов при функционировании зависит от наличия в питательной среде кислот. В частности, для создания оптимальных условий жизнедеятельности дрожжей в процессе сбраживания зернового сусла для производства спирта этилового ректификованного проводят подкисление среды до рН (4,8 – 5,0) добавлением серной или молочной кислоты, известны способы биологического подкисления сусла с помощью молочнокислых бактерий [46, 27].
Молочнокислые бактерии при бесконтрольном появлении в ходе технологического процесса (например, при инфицировании сусла и бражки в спиртовом производстве) ухудшают качество готовой продукции, снижают выход этилового спирта. С другой стороны, образующаяся при молочнокислом брожении молочная кислота стимулирует развитие засевных дрожжей и подавляет жизнедеятельность посторонних микроорганизмов [27].
Подкисление зернового сусла с помощью молочнокислых бактерий оказывает влияние на вкус и аромат дистиллятов и спиртных напитков. Метаболиты бактерий – неотъемлемая часть букета квасов и спиртных напитков [5, 46].
Для изучения технологических характеристик процесса дрожжегенери-рования и сбраживания, а также установления влияния микроорганизмов на накопление вкусо-ароматических соединений при сбраживании зернового сусла исследовали процесс биологического подкисления сусла с помощью молочнокислых бактерий на этапе приготовления засевных дрожжей.
Для приготовления солодового сусла применяли настойный способ затирания зернового сырья на основе ячменного солода.
Подготовку пробы (образец № 1) проводили с применением МКБ на стадии подкисления дрожжевого сусла. Готовили разводку МКБ на модельной среде с определенным составом: растворы глюкозы с концентрацией 5,0 % мас., солей аммония с концентрацией 10,0 % мас, лимонной кислоты с концентрацией 4,0 % мас. Температура в процессе разведения МКБ составляла 37 оС, титруемая кислотность в начале засева – 0,35 см3 0,1 моль/дм3 раствора NaOH в 1 см3 разводки, а к концу – 1,1 см3 0,1 моль/дм3 раствора NaOH в 1 см3.
После выращивания МКБ в пробирках и колбах на модельной среде содержимое емкостей с МКБ переносили в стерильную колбу вместимостью 500 см3 с солодовым суслом с температурой 52 – 54 оС. Размножение МКБ проводили при температуре 52 оС в течение 8 – 10 ч. При этом значение кислотности составило 1,7 – 1,9 о. Затем солодовое сусло с МКБ подвергали пастеризации при температуре 76 – 78 оС в течение 25 – 30 мин. Для получения зрелых засевных дрожжей пастеризованное сусло охлаждали до температуры 28 – 30 оС и вносили расчетное количество дрожжей Sacch. cerevisae (Fermiol), раса DY 722 [27].
Приготовление засевных дрожжей проводили в течение 18 – 20 ч при температуре 27– 30 оС. Массовая доля сухих веществ в дрожжевом сусле при культивировании микроорганизмов снижалась от 15 – 16 до 5–6 %, а концентрация этилового спирта возрастала до 4,5 – 5,0 %. Клетки зрелых дрожжей содержали до 5 % почкующихся клеток, не более 1 % мертвых клеток при полном отсутствии посторонних микроорганизмов.
При подготовке контрольного образца (образец № 2) дрожжевое сусло готовили при помощи подкисления раствором серной кислоты с концентрацией 0,1 моль/дм3. Начальная концентрация сухих веществ в сусле составляла 15 % мас., рН 6,3. До необходимого значения кислотности сусло подкисляли серной кислотой до рН 3,8 – 4,0, что соответствует 0,7 – 0,9 град. кислотности. Для приготовления засевных дрожжей в стерильную колбу переносили 200 см3 сусла, вносили дрожжи Sacch. cerevisae (Fermiol), раса DY 722. Разбраживание проводили в течение 18 – 20 ч при температуре 29 оС. Концентрация сусла при этом снижалась до 6 % мас от первоначальной. Колбу с разводкой переносили в стерильную колбу с общим объемом сусла и проводили сбраживание при температуре 18 – 22 оС первые 12 ч, после чего температуру повышали до 29 – 30 оС. Общее время сбраживания образцов сусла составляло 66 – 72 ч.
Осуществляли микрофотографирование препаратов солодового сусла по окончании сбраживания под микроскопом марки «Микромед-3» с увеличением в 640 раз. Для контроля эффективности применения биологического подкисления дрожжевого сусла, оценки его влияния на интенсивность сбра 124 живания солодового сусла проводили обработку фотографий проб среды, сделанных под микроскопом, с помощью программы Image J и специальных макросов.
Общее количество дрожжевых клеток возросло примерно в 3,5 раза, значения эффективной поверхности клеток увеличились с 30,9 до 45,6 мкм2, количество клеток с эквивалентным диаметром 7,5 – 8,5 мкм возросло с 45 до 200 шт., 11,5 – 12,5 мкм – с 60 до 100 шт. увеличилось количество почкующихся клеток (рисунки 4.8, 4.9).
Исследование перспектив применения бифидобактерий в технологии квасов
Для оценки антимутагенных (протекторных) свойств солодовых и полисолодовых экстрактов был использован микроядерный тест в буккальном эпителии человека. В качестве объектов исследования применяли вододис-пергируемые порошкообразные сухие смеси на основе ПСЭ и ППЭ в виде расфасованных в пакетики напитков массой 20 г для растворения в воде и одноразового приема.
Материалом для решения поставленных задач послужили результаты обследования 20 человек. В исследовании приняли участие условно здоровые добровольцы, студенты 5-го курса с состоянием здоровья без выраженных патологий, нарушений метаболических процессов в организме. Возраст волонтеров составлял 20 – 23 года, 10 – женщин, 10 – мужчин.
Исследование проводили в 3 этапа. На первом этапе осуществлялось взятие проб и первичная оценка исследуемых показателей, на втором этапе исследование осуществляли после систематического приема напитков, в тех же условиях. На третьем этапе пробы отбирали после десятидневного перерыва в приеме напитков. Все волонтеры подписали информированное добровольное согласие на проведение диагностических манипуляций в виде взятия мазков из ротовой полости в условиях медицинского пункта ФГБОУ ВО «ВГУИТ», а также на систематический прием напитков.
Проводили анкетирование добровольцев, критериями включения клинически здоровых лиц являлись: возраст, пол. Критериями исключения клинически здоровых лиц являлись: наличие острых или хронических заболеваний. Анкеты и информированное добровольное согласие приведены в первичных материалах исследований.
Обработка результатов была проведена в лаборатории «Молекулярной генетики и клеточной биологии» кафедры генетики, цитологии и биоинженерии ФГБОУ ВПО «ВГУ».
Вододиспергируемые порошкообразные сухие смеси на основе солодовых и полисолодовых экстрактов разводили в 200 см3 питьевой воды с температурой 25–30 оС, тщательно перемешивали перед употреблением, и выдавали в виде инстантированных напитков добровольцам ежедневно в течение 14 дней с учетом суточной потребности организма в биологически активных и питательных компонентах. Для приготовления смесей составляли композиции солодовых и полисолодовых экстрактов в следующих соотношениях: содержание экстрактов ППЭ-1 – 30,0 ± 5,0 %, ППЭ-2 – 40,0 ± 5,0 %, ПГрСЭ – 25,0 ± 5,0 %, ПГСЭ – 5,0 ±1 %. Сухие смеси готовили к употреблению ежедневно в одно и то же время.
Физико-химические показатели ПСЭ и ППЭ приведены в главе 3. Показатели биологической ценности ПСЭ и ППЭ указаны в таблице 5.4 [59].
Сбор материала и изготовление препаратов буккального эпителия осуществляли по методике (Калаев, 2014) до употребления препарата (1 проба), через неделю, в течение которой испытуемые употребляли напитки на основе сухих порошкообразных смесей (2 проба), и спустя неделю после окончания употребления (3 проба).
На каждом препарате просматривали не менее 1000 клеток, среди которых определяли количество клеток с микроядрами, перинуклеарными вакуолями, насечками, протрузиями, двумя ядрами, кариопикнозом, кариолизисом, кариорексисом.
Причины образования данных нарушений различны. Микроядра представляют собой ацентрические хромосомные фрагменты и отдельные целые хромосомы, потерянные во время митоза. Протрузии, подобно микроядрам, могут быть образованы фрагментами хромосом или отставшими при нарушении веретена деления целыми хромосомами, ядерная оболочка вокруг которых соединена с оболочкой основного ядра. Данное нарушение относят к признакам ранней деструкции ядра. Ядра с круговой насечкой имеют цен 161 тральную или частично смещенную к одному из полюсов борозду, как бы перетягивающую ядро [310].
Двуядерная клетка – клетка с двумя отдельно лежащими ядрами. Для деления двуядерных клеток характерны нарушения митоза. Данные нарушения являются показателем нарушения пролиферации. Перинуклеарная вакуоль является «впячиванием» кариолеммы (ядерной оболочки) и образованием округлой зоны обесцвеченной цитоплазмы и кариоплазмы в окрашенных клетках, появляется в результате образования вакуоли в перинуклеарном пространстве [311].
Апоптоз – это основной механизм элиминации клеток с генетическими повреждениями. На ранних стадиях апоптоз проявляется как кариопикноз и кариорексис. Кариопикноз – дегенеративное изменение ядра, сопровождающееся уменьшением его размера не менее чем в 2 раза, уплотнением, гомогенным и интенсивным окрашиванием. Кариорексис – дегенеративное изменение ядра в клетке, сопровождающееся распадом его на отдельные интенсивно окрашенные части с гомогенной структурой, которые после лизиса ка-риолеммы попадают в цитоплазму и подвергаются рассасыванию. Кариоли-зис – дегенеративное изменение ядра в клетке, сопровождающееся потерей способности к окрашиванию хроматина с последующим полным его исчезновением. В свою очередь, кариолизис и вакуолизация ядра являются индикаторами исключительно токсического воздействия на клетку. Наблюдаемые нарушения морфологии ядер у здоровых лиц можно связать со старением и естественной гибелью эпителиальных клеток ротовой полости [313] .
Для каждого обследуемого вычисляли частоту встречаемости клеток с микроядрами, перинуклеарными вакуолями, насечками, протрузиями, двумя ядрами, кариопикнозом, кариолизисом, кариорексисом как отношение числа клеток с той или иной аберрацией к общему числу проанализированных клеток ( ), частоту аберраций всех типов - как отношение суммы клеток с перечисленными нарушениями к общему числу проанализированных клеток ().