Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы .11
1.1 Виды сырья растительного и микробного происхождения .11
1.1.1 Растительное сырье .11
1.1.2 Биотехнологические особенности переработки растительного сырья
1.1.2.1 Переработка зерна .13
1.1.2.2 Переработка плодово-ягодного сырья 15
1.1.3. Микробное сырье .16
1.1.3.1 Особенности строения клетки мицелиальных грибов .17
1.1.3.2 Биотехнологические особенности переработки грибного мицелия 17
1.1.3.3 Особенноси строения дрожжевой клетки .19
1.1.3.4 Биотехнологические особенности переработки дрожжевой биомассы 19
1.2 Перспективы применения ферментов для деструкции растительного и микробного сырья 20
1.2.1 Источники ферментов, гидролизующих полимеры растительного и микробного сырья .20
1.3 Способы повышения продуктивности штаммов 29
1.3.1 Структура генетического материала мицелиальных грибов 29
1.3.2 Понятие о гене как о единице функции .30
1.3.3 Регуляция генной активности .31
1.4 Селекция и мутагенез 34
1.4.1 Методы селекции .34
1.4.2 Мутагенез 36
1.4.3 Генная инженерия
ГЛАВА 2. Методология проведения исследований 45
2.1 Организация исследований и структурно-методологическая схема их проведения .45
2.2 Объекты исследований .45
2.3 Материалы и методы исследований 45
ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение .52
Селекция и мутагенез A. foetidus 379К .52
3.1 Химический мутагенез (1 ступень) 52
3.2 Физический мутагенез. УФ-облучение (2 ступень) 54
3.3 Разработка условий глубинного культивирования мутантного штамма Aspergillus foetidus 379K-5-1 .58
3.3.1 Подбор источников неорганического азота 59
3.3.2 Подбор оптимального состава питательной среды для глубинного культивирования .60
3.3.3 Влияние интенсивноси аэрирования при культивировании A. foetidus 379K-5-1 на синтез гидролитических ферментов 64
3.4 Подбор условий глубинного культивирования 65
3.4.1 Изучение влияния температуры культивирования штамма А. foetidus 379K-5-1 на синтез гемицеллюлаз и полигалактуроназы 65
3.4.2 Изучение влияния исходного значения рН среды на синтез гемицеллюлаз и полигалактуроназы культурой гриба А. foetidus 379K-5-1...68 3.5 Получение комплексного ферментного препарата Глюканофоетидин...69
3.5.1 Условия получения ферментного препарата Глюканофоетидин и его биохимическая характеристика 69
3.5.2 Изучение фракционного состава ФП Глюканофоетидин Г20Х, полученного на основе нового мутантного штамма Aspergillus foetidus 379К-5-1...70
3.5.3 Изучение оптимума действия препарата Глюканофоетидин 77
3.5.4 Изучение рН- и термостабильности препарата полученного на основе штамма Aspergillus foetidus 379K-5-1 78
3.6 Исследование перспективных направлений использования ФП Глюканофоетидин для деструкции полимеров растительного и микробного сырья 81
3.6.1 Исследование эффективности действия препарата Глюканофоетидин в процессе деструкции ягодного сырья 81
3.6.2 Исследование гидролитической способности ферментного препарата Глюканофоетидин при биоконверсии зернового сырья 83
3.6.3 Исследование гидролитической способности комплексного ферментного препарата на основе Aspergillus foetidus 379K-5-1 в отношении полимеров микробного сырья .85
Заключение 92
Основные результаты и выводы 95
Список использованной литературы
- Переработка плодово-ягодного сырья
- Материалы и методы исследований
- Разработка условий глубинного культивирования мутантного штамма Aspergillus foetidus 379K-5-1
- Исследование гидролитической способности ферментного препарата Глюканофоетидин при биоконверсии зернового сырья
Переработка плодово-ягодного сырья
С появлением и развитием пищевой биотехнологии основу производств нашей страны составляли производство спирта, пива, безалкогольных напитков и кормов [11]. На сегодняшний день биотехнологии внедряются повсеместно и уже широко используются в хлебопекарной, кондитерской, масложировой, мясной и молочной промышленности [11].
Каждая отрасль, перерабатывающая растительное сырье сталкивается с рядом проблем, которые тем или иным образом отражаются на выходах и качестве готового продукта. Современные технологии, предусматривающие использование ферментных препаратов в процессах переработки сырья в большинстве случаев позволяют решить эти проблемы и даже поспособствовать повышению качества производимых продуктов [33, 37, 64].
В среднем зерно содержит 86 % сухих веществ, из них 84% относятся к органическим и 2% к минеральным веществам. Основной составной частью зерновых культур является крахмал. Его содержание, в зависимости от вида зерна, колеблется в пределах от 34 до 70% (в среднем составляет 52%). Также в зерне содержаться: сахара-3%, клетчатка-6%, пентозаны и пектиновые вещества-9%, азотные вещества-11% и жир-3% [4, 70].
Производство спирта
Для переработки на спирт используется любое зерно. Ежегодный объем переработки составляет (%): пшеницы 50 (преимущественно дефектной), ячменя 20, ржи 12, кукурузы 8, проса 5, овса 2 и прочих культур (гречихи, гороха, риса и др.) [59]. Для приготовления солода употребляют кондиционное высококачественное зерно [33, 65, 86].
Наиболее приемлемой культурой для производства спирта считается кукуруза, т. к. ее урожайность превышает урожайность других зерновых культур в 2-3 раза.
Актуальной проблемой технологии производства спирта на данный момент является низкая рентабельность спиртовых заводов, что неразрывно связано с проблемой эффективного использования зерна. Переработка зерна на спирт требует большой материалоемкости и во многом зависит от сырьевой базы. Использование ферментных препаратов в данном случае позволяет интенсифицировать процессы брожения, повысить выход и качество спирта, а также сэкономить энергоресурсы спиртзаводов.
Наряду с ферментнымими препаратами амилолитического действия, которые широко используются в нашей стране и за рубежом для осахаривания крахмала, немалое значение в производстве спирта имеют также ферменты протеолитического и целлюлолитического компелекса. Внесение в сусло протеолитических ферментов ускоряет биохимические процессы брожения за счет повышения концентрации растворимого азота, который является неотъемлемым источником питания дрожжей.
Высокое содержание некрахмальных полисахаридов, пентозанов и гумми-веществ в нетрадиционных видах сырья (рожь, тритикале) приводит к повышенной вязкости сусла и бражки. Улучшить реологические свойства бражек, а также повысить выход этанола возможно за счет добавления ферментов целлюлолитического комплекса на стадии осахаривания или сбраживания.
Ферментные препараты могут использоваться для выпуска спирта как по традиционной схеме разваривания под давлением, так и по схеме механико-ферментативной обработки зернового сырья [20].
Стандартом на пиво допускается использование несоложеного ячменя, рисовой сечки, пшеницы, обезжиренной кукурузной муки [70]. Использование при производстве пива гидролитических ферментных препаратов микробного происхождения целесообразно, т. к. они компенсируют недостаточную ферментативную активность солода низкого качества или при частичной замене солода на более дешевое, несоложеное сырье. При использовании свыше 20 % несоложеного ячменя применение ферментных препаратов является обязательньным [33, 41, 70].
Самыми часто встречающимися проблемами при производстве пива являются проблемы качества осахаривания затора и сусла, низкая степень сбраживания, плохая фильтруемость и коллоидная стабильность. -глюканы и арабиноксиланы зерна, определяют вязкость сусла и показатели фильтрации пива и формируют барьер для гидролитических ферментов, атакующих крахмал и белок в пределах стенок клетки. Соответственно, низкое содержание -глюкана в зерне или его расщепление во время солодования - решающие факторы для пивоварения [71]. Кроме того, -глюкан, присутствующий в готовом пиве может быть причиной помутнений.
Применение ферментных препаратов в пивоварении, гидролизующих крахмальные и некрахмальные полисахариды позволяет снизить вязкость сусла и пива и, тем самым, улучшить их фильтруемость, повысить выход экстракта в варочном отделении, а также предотвратить появление вторичных помутнений. Их легко дозировать и они не оказывают влияния на вкусовые качества пива [41]. При этом время брожения сокращается на 10-20 часов, а выход спирта увеличивается на 1-4 % [20].
Использование комплексных ферментных препаратов дает возможность оперативно запустить производство после профилактических или незапланированных остановок. Солод как нестандартный компонент может быть полностью исключен из технологического процесса. А это значит, что исчезает потребность в таких позициях на производстве, как солодовое зерно на стадии осахаривания, сами солодовни, и персонал с трудоемкой стадии выращивания солода.
Материалы и методы исследований
Для выращивания посевного материала использовали агаризованную среду, содержащую солодовое сусло 7Б, водопроводную воду и агар-агар – 3%, рН среды 5,0-5,5. Посевной материал выращивали в течение 10 суток при температуре 30С. Селекционные среды. Для селекции штамма A. foetidus 379K использовались минимальные агаризованные среды содержащие крахмал, ксилан и мальтозу в количестве 1,0%, с добавлением 3,0% агара. Источником минерального питания служили соли (NH4)2SO4 – 1,0%, K2HРO4 – 0,5%, MgSO4 -0,5%.
Для глубинного культивирования штамма в колбах Эрленмейера использовалась среда следующего состава: солодовые ростки – 2,0%, пшеничные отруби – 3,0%, (NH4)2SO4 – 1,0%, K2HРO4 – 0,5%, MgSO4 -0,5%. Методы определения активностей ферментов Определение –глюканазной активности Определение -глюканазной активности основано на измерении скорости образования восстанавливающих сахаров методом Шомоди-Нельсона при гидролизе -глюкана [12]. В качестве субстрата использовали 1% раствор -глюкана в 0,1 М ацетатном буфере, рН 5,0, время инкубации – 10 минут.
За единицу -глюканазной активности принимали такое количество фермента, которое за 1 минуту в условиях опыта (50оС, рН 5,0) гидролизует -глюкан с образованием восстанавливающих сахаров, эквивалентных 1 мкмолю глюкозы.
Определение активности эндо-полигалактуроназы
Метод основан на гидролизе пектина или пектовой кислоты исследуемым ферментным препаратом с последующим контролем степени расщепления по снижению вязкости.
Эндополигалактуроназная активность характеризует способность фермента снижать вязкость 1% -ного раствора пектина.
За единицу эндополигалактуроназной активности принято такое количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 г пектина со снижением вязкости раствора на 30% за 1 мин. при 300С [16].
Определение ксиланолитической активности
Определение ксиланолитической активности основано на измерении скорости образования восстанавливающих сахаров методом Шомоди-Нельсона при гидролизе [17]. В качестве субстата использовали 1% раствор березового ксилана в 0,1 М ацетатном буфере, рН 5,0, время инкубации – 10 минут.
За единицу ксиланазной активности принимали такое количество фермента, которое за 1 минуту в условиях опыта (50оС, рН 5,0) гидролизует ксилан с образованием восстанавливающих сахаров, эквивалентных 1 мкмолю глюкозы. Определение целлюлазной активности Определение целлюлазной активности основано на измерении скорости образования восстанавливающих сахаров методом Шомоди-Нельсона при гидролизе карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) [15]. В качестве субстрата использовали 1% раствор натриевой соли КМЦ в 0,1 М ацетатном буфере, рН 5,0, время инкубации – 5 минут.
За единицу целлюлазной активности принимали такое количество фермента, которое за 1 минуту в условиях опыта (50оС, рН 5,0) гидролизует КМЦ с образованием восстанавливающих сахаров, эквивалентных 1 мкмолю глюкозы. Определение хитиназной активности Определение хитиназной активности основано на измерении скорости образования восстанавливающих сахаров методом Шомоди – Нельсона при гидролизе коллоидного хитина (Синицын А.П., Черноглазов В.М. и др., 1993). В качестве субстрата использовали 1% раствор коллоидного хитина в 0,1М ацетатном буфере, рН 5,0, время инкубации 5 минут.
За единицу хитиназной активности принимали такое количество фермента, которое за 1 минуту в условиях опыта (500С, рН 5,0) гидролизует коллоидный хитин с образованием восстанавливающих сахаров, эквивалентных 1 мкмолю глюкозы. Определение маннаназной активности
Определение маннаназной активности основано на измерении скорости образования редуцирующих сахаров при гидролизе 1% раствора маннана в 0,1М ацетатном буфере при рН 5,0 и времени гидрлиза 5 минут. За единицу маннаназной активности принимали количество фермента, которое за 1 минуту при 50С и рН 5,0 гидролизует 1% раствор маннана с образованием восстанавливающих сахаров, эквивалентных 1 мкмолю глюкозы. Определение протеазной активности Протеолитическую активность ферментов определяли по степени гидролиза гемоглобина – животного белка до низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот [13]. За единицу общей протеолитической активности (ПС) принимают такое количество фермента, которое за 1 мин при 30С приводит гемоглобин в неосаждаемое ТХУ состояние в количестве, соответствующем 1 мкмолю тирозина (1 мкмоль тирозина равен 0,181 мг). Определение активности липазы Активность липазы определяли по степени гидролиза n-нитрофенил-ацетата с образованием n-нитро-фенола и уксусной кислоты. n-Нитрофенол детектируется переводом в окрашенный n-нитро-фенолят ион (повышением рН реакционной смеси до рН 7,3)
Разработка условий глубинного культивирования мутантного штамма Aspergillus foetidus 379K-5-1
Как видно из диаграммы наиболее высокий уровень синтеза -глюканазы отмечен при культивировании микромицета на среде содержащей солодовые ростки. При этом повышение активности полигалактуроназы наблюдалось на средах в состав которых входили свекловичный жом, клюквенный жмых, а также послеспиртовая барда, однако синтез –глюканазы был значительно ниже. Т. о. для глубинного культивирования мутантного штамма Aspergillus foetidus 379К-5-1 была подобрана среда включающая: солодовые ростки, пшеничные отруби, (NH4)2SO4, KH2PO4, MgSO47H2O.
На следующем этапе была проведена работа по выявлению оптимальных концентраций основных компонентов среды (солодовых ростков и пшеничных отрубей) которые детектировали по накоплению белка в культуральной жидкости (рис. 8), а также по активности основных ферментов -глюканазы (рис. 9 ) и полигалактуроназы (рис. 10 ). Рисунок 8 - Влияние различных концентрации солодовых ростков и пшеничных отрубей на накопление ферментного белка в культуральную жидкость A. foetidus 379K-5-1 Полученные данные подтвердили прямо пропорциональную зависимость повышения концентрации компонентов питательной среды и накопления белка в культуральной жидкости. Показано, что во всех вариантах, за исключением сред с 10% солодовых ростков, содержание белка растет при увеличении концентрации пшеничных отрубей. На средах содержащих 10% солодовых ростков и более 5% отрубей наблюдается снижение синтеза белка, что свидетельствует об ингибировании биосинтетической способности культуры вследствие избыточного количества субстрата в питательной среде.
На основании полученных экспериментальных данных по уровню активностей -глюканазы и полигалактуроназы, секретируемых в культуральную жидкость выявлено, что оптимальное соотношение компонентов питательной среды составило: 5% солодовых ростков и 10% пшеничных отрубей. При этом активность -глюканазы и полигалактуроназы по сравнению с исходным штаммом повышена на 289,6% и 230,6% соответственно. Все дальнейшие исследования проводились на оптимизированной питательной среде.
Таким образом, подобран оптимальный состав среды для глубинного культивирования Aspergillus foetidus 379К-5-1, включающий 5% солодовых ростков, 10% пшеничных отрубей и 1,1% (NH4)2SO4.
Мицелиальные культуры относятся к аэробным микроорганизмам, на рост которых значительное влияние оказывает концентрация растворенного в среде кислорода. Т. к. концентрация кислорода в культуральной жидкости снижается в зависимости от объема питательной среды, возникает необходимость выбора оптимального объема среды для культивирования.
Аэрацию питательной среды осуществляли таким образом, чтобы концентрация растворенного кислорода составляла 5-15% от величины насыщения.
На рисунке 11 показано изменение накопления ферментов в культуральной жидкости штамма A. foetidus 379K-5-1 в зависимости от степени аэрирования. Степень аэрирования достигалась путем изменения объема питательной среды.
Полученные данные свидетельствуют о том, что продуктивность ксиланазы незначительно понижается с увеличением объема питательной среды, а синтез -глюканазы, полигалактуроназы и целлюлазы достигал 100% - ного уровня при объеме среды 100 см3 . Поэтому для дальнейших исследований был выбран объем питательной среды – 100 см3, обеспечивающий максимальное накопление глюканазы, полигалактуроназы и целлюлазы и 83% ксиланазной активности.
Изучение влияния температуры культивирования штамма А. foetidus 379K-5-1 на синтез гемицеллюлаз и полигалактуроназы
Важное значение для биосинтеза ферментов имеет выбор температуры культивирования продуцента. Известно, что в случае биосинтеза штаммом ферментного комплекса, температурный режим, зачастую, позволяет откорректировать величину активностей различных ферментов, в зависимости от целевого назначения ферментативного комплекса.
Для изучения влияние температуры культивирования на синтез гемицеллюлаз и полигалактуроназы, штамм А. foetidus 379K-5-1 культивировали в колбах Эрленмейера на микробиологической качалке (количество оборотов 220 об/мин) при температуре от 28 до 34С в течение 120 часов. На каждые сутки роста производили отбор культуральной жидкости и исследовали величину активностей ферментов: -глюканазы, ксиланазы, целлюлазы и полигалактуроназы (рис. 12).
Исследование гидролитической способности ферментного препарата Глюканофоетидин при биоконверсии зернового сырья
На рисунке 24 приведена технологическая схема установки для получения ферментного препарата Глюканофоетидин из глубинной культуры Aspergillus foetidus 379K-5-1.
Компоненты среды — солодовые ростки, пшеничные отруби и соли — смешивают с водой в сборнике 1. Насосом 8 среду подают в контактную головку 2, нагревают с 75—80С до 119—120С, выдерживают в трубчатом аппарате 3 в течение 40—50 мин и охлаждают до 30—32С в поверхностном теплообменнике 4.
Стерилизованная и охлажденная среда поступает в ферментатор 7 — вертикальный цилиндрический сосуд с лучевыми аэраторами или с двухъярусными турбинными мешалками и барботером для подвода воздуха.
В тех случаях, когда теплообменник отключают для профилактического осмотра или ремонта, горячую среду из выдерживателя по обходной коммуникации передают непосредственно в ферментатор. В процессе заполнения ферментатора в нем поддерживают избыточное давление 0,25 МПа паром, подаваемым по воздуховоду через аэрирующее устройство. Коэффициент заполнения ферментатора 0,75—0,85. После заполнения ферментатора всю систему освобождают от среды, прокачивают водой и стерилизуют острым паром. Питательную среду в ферментаторе охлаждают до 30—32С. В ферментаторе среду засевают культурой гриба из маточника 5. До засева из ферментатора отбирают пробы через пробоотборник для микробиологического контроля и биохимических анализов. Засев осуществляют по линии передавливания, предварительно стерилизованной от маточника до ферментатора острым паром в течение 1 ч. Для этого закрывают вентиль на выходной воздушной линии у маточника и поднимают в нем давление до 0,06—0,08 МПа, оставляя в ферментаторе давление 0,02—0,03 МПа, после чего открывают вентиль на линии передавливания у маточника и ферментатора и в связи с разностью давления посевную культуру из маточника передавливают в ферментатор. После этого закрывают вентили на линии передавливания, в ферментаторе приводят во вращение мешалку и начинают процесс выращивания культуры. Маточник представляет собой цилиндрический сосуд со сферическим днищем, оборудованный устройством для аэрации и перемешивания, патрубками для подачи питательной среды, спуска промывных вод, подачи пара, подвода и отвода воздуха. После передавливания всей посевной культуры из маточника выпускают воздух, открывают крышку и внутреннюю поверхность тщательно моют. Затем маточник стерилизуют и заполняют питательной средой для следующего цикла приготовления посевного материала.
Питательная среда в маточник подается также насосом 8 через контактную головку 2 из смесителя 1. Охлажденную до 30-32С среду засевают спорами гриба, выращенного в колбах, через посевной лючок с соблюдением условий стерильности и при минимальном движением воздуха в цехе. Количество посевного материала — 2% к объему питательной среды. После засева открывают вентили для подачи и отвода воздуха. Расход воздуха 50—60 м3/(м3-ч), его температура 35—40С. Продолжительность культивирования 96 ч. При задержке передачи посевной культуры в ферментаторы ее расхолаживают в маточнике подачей воды в рубашку и сохраняют при обязательной аэрации.
Во время культивирования гриба в ферментаторе температура питательной среды 30—32С поддерживается автоматическим регулированием подачи воды в рубашку аппарата. Аэрацию и перемешивание мешалкой (частота вращения около 200 об/мин) проводят непрерывно с момента окончания засева и до конца ферментации. Количество подаваемого воздуха 15—20 м3/(м3-ч). Пробоотборник и нижняя сливная коммуникация находятся под паровой защитой. Продолжительность ферментации 96 ч. Воздух дополнительно очищается на индивидуальных фильтрах 6 у маточника и у ферментатора.
Отработавший воздух из ферментатора по патрубку в крышке поступает на очистку от спор и других взвешенных частиц и далее в атмосферу. Готовая культура насосом 9 подается на фильтр-пресс 13. Освободившийся ферментатор моют и стерилизуют при 120С в течение 2 ч.
В процессе ферментации для микробиологического и биохимического контроля развития культуры отбирают пробы (с соблюдением условий стерильности) вначале через 24 ч после засева, а затем через каждые 12 ч роста. Готовая культура должна иметь активность не менее: по -глюканазе 11-12 ед/см3 и по полигалактуроназе 14-15 ед/см3
С фильтр-пресса культуральная жидкость после отделения биомассы продуцента сливается в накопительную емкость 14. Емкость обычно снабжена уровнемером, термометром, герметичной крышкой, системой трубопроводов и термостатирующим устройством, позволяющим поддерживать температуру на необходимом уровне. Из накопительной емкости раствор ферментов питающим насосом 15 под рабочим давлением нагнетается в мембранные аппараты 16. Они могут быть соединены в несколько ступеней с уменьшением их числа на каждой ступени. Это делается для того, чтобы линейная скорость раствора над мембраной в каждом аппарате не снижалась по мере выделения из раствора пермеата – водного раствора солей и низкомолекулярных компонентов культуральной жидкости. Пермеат всех ступеней объединяется и подается в емкость пермеата 17, откуда он может поступать на дальнейшую переработку или в канализацию. Концентрат ферментов проходит через дроссель 18, где его давление снижается до атмосферного, и может либо выводиться из установки на сушку, либо возвращаться по циркуляционной линии 19 в накопительную емкость 14.
В распылительной сушилке концентрат ферментов подается в камеру 19 через форсунку 20. Сушильный агент движется параллельным током с материалом. Мелкие твердые частицы высушенного материала (размером до нескольких микрон) осаждаются на дно камеры и отводятся шнеком 21, далее на фасовку. Отработанный сушильный агент после очистки от пыли в циклоне 24 и рукавном фильтре 23 выбрасывается в атмосферу.