Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Проблемы и перспективы современного производства этанола с применением мультиэнзимного комплекса 13
1.1 Характеристика сырья, применяемого при производстве этанола 13
1.1.1 Химический состав ячменя 13
1.1.2 Структура крахмала ячменя 15
1.1.3 Целлюлоза зерна ячменя 17
1.1.4 Гемицеллюлозы зерна ячменя 19
1.2 Характеристика ферментов, применяемых в спиртовом производстве для конверсии биополимеров зерна 21
1.2.1 Амилолитические ферменты 21
1.2.2 Протеолитические ферменты 24
1.2.3 Ксиланаза 25
1.2.4 р-глюканаза 27
1.2.5 Фитазы 29
1.3 Характеристика дрожжей, применяемых в спиртовом производстве 32
Глава 2 Организация экспериментов, объекты и методы исследований 36
2.1 Схема экспериментальных исследований 36
2.2 Характеристика объектов исследования 37
2.3 Методы исследования 38
2.3.1 Определение ксиланазной активности 38
2.3.2 Определение Р-глюканазной активности 39
2.3.3 Определение глюкоамилазной активности 39
2.3.4 Определение амилолитической активности 39
2.3.5 Определение протеолитической активности 39
2.3.6 Определение фитазной активности 40
2.3.7 Анализ спиртовых дрожжей 40
2.3.8 Определение крахмалистости методом Эверса 42
2.3.9 Определение Р-глюкана в зерне 43
2.3.10 Определение пентозанов 43
2.3.11 Определение влажности 43
2.3.12 Приготовление и анализ замеса, сусла и бражки 43
2.3.13 Определение вязкости ячменных замесов 44
2.3.14 Определение содержания аминного азота в сусле 44
2.3.15 Определение содержания редуцирующих Сахаров 44
2.3.16 Определение содержания глюкозы 45
2.3.17 Определение содержания растворимых несброженных углеводов и нерастворенного крахмала в бражке 45
2.3.18 Определение титруемой кислотности 45
2.3.19 Определение содержания спирта в бражке 45
2.3.20 Газохроматографический метод определения содержания летучих органических примесей в бражке 46
2.3.21 Математическая обработка экспериментальных данных 46
Глава 3 Применение мультиэнзимной композиции (МЭК) на стадии водно-тепловой обработки (ВТО) при переработке проблемного сырья 47
3.1 Изучение реологических характеристик зерновых замесов 47
3.2 Изменение вязкости ячменного замеса на стадии водно-тепловой подготовки 50
3.3 Изменение массовой доли сухих и редуцирующих веществ в замесе на стадии водно-тепловой подготовки 57
3.4 Оптимизация процесса водно-тепловой обработки сырья 63
Глава 4 Исследование влияния мультиэнзимной композиции (МЭК) на процесс осахаривания разваренной массы 71
4.1 Изучение влияния МЭК на процесс осахаривания 71
4.1.1 Изучение влияния основных технологических факторов на процесс осахаривания 71
4.1.2 Кинетика гидролиза крахмала 75
4.1.3 Оптимизация процесса осахаривания 78
Глава 5 Исследование влияния мультиэнзимной композиции (МЭК) на процессы культивирования дрожжей и брожения 88
5.1 Исследование влияния сбалансированного состава сусла на процесс биосинтеза спиртовых дрожжей 88
5.1.1 Изучение влияния аминного азота на процесс биосинтеза спиртовых дрожжей 88
5.1.2 Изучение влияния неорганического азота на процесс биосинтеза спиртовых дрожжей 90
5.1.3 Изучение влияния ионов фосфора на процесс биосинтеза спиртовых дрожжей 91
5.1.4 Изучение влияния комплекса ферментов на физиологические свойства спиртовых дрожжей в процессе культивирования 93
5.2 Изучение влияния МЭК на процесс брожения ячменного сусла 99
5.2.1 Кинетика процесса брожения 99
5.2.2 Показатели зрелой бражки 104
5.2.3 Накопление примесей в зрелой бражке 105
5.2.4 Изучение влияния рН сусла на накопление побочных продуктов брожения в бражке 106
Основные выводы и результаты 111
Список используемых источников 113
Приложения 131
- Гемицеллюлозы зерна ячменя
- Изменение вязкости ячменного замеса на стадии водно-тепловой подготовки
- Оптимизация процесса осахаривания
- Изучение влияния рН сусла на накопление побочных продуктов брожения в бражке
Гемицеллюлозы зерна ячменя
Гемицеллюлозы делятся на гексозаны (–глюканы, маннаны, галактаны, галактоманнаны) и пентозаны (арабаны, ксиланы). По химической структуре встречаются гомо- и гетерополисахариды.
Гемицеллюлозы наряду с целлюлозой присутствуют почти во всех клеточных стенках растений [62]. В отличии от целлюлозы, имеющей кристаллическую прочную и устойчивой к гидролизу структуру, гемицеллюлозы имеют произвольную, аморфную структуру с низкой прочностью. Они легко гидролизуются разбавленной кислотой или основанием, а также ферментами.
Гемицеллюлозы содержат большое разнообразие различных углеводных мономеров, в то время как целлюлоза содержит только безводную глюкозу. Например, помимо глюкозы, в гемицеллюлозах могут содержаться ксилоза, арабиноза, манноза и галактоза. Гемицеллюлозы содержат большую часть D-пентозанов, и иногда небольшое количество L-сахаров. В составе гемицеллюлоз также встречаются глюкуроновая и галактуроновая кислоты.
Ксиланы – это в основном легкогидролизуемые гомополисахариды, состоящие из остатков D – ксилопиранозы, соединенных между собой 1,4– гликозидными связями. Арабаны – все легкогидролизуемые полисахариды.
Маннаны – это полимерная цепь остатков маннозы, связанных 1.4-связью с определенными ветвями 1.6-связи; содержит 200-400 остатков маннозы в молекуле. Являются частью водорослей, хвойных пород дерева. Гетерополимеры маннозы и галактозы – галатроманнаны. Галактоманнан – это резервный полисахарид клеточных стенок, который потребляется при проращивании семян для нужд энергетического обмена. В семени он выполняет водоудерживающие и защитные функции. Галактоманнан имеет основную цепь, состоящую из остатков D-маннозы, связанных 1.4-связями. Боковые ветви представлены простыми остатками галактозы, прикрепленными к остаткам манноза 1,6-гликозидным связями.
-Глюкан представляет собой линейный гомополисахарид, состоящий из -D-глюкопиранозы, связанной с -1.3-1.4-гликозидными связями.
При температуре до 40–50С –глюкан способен поглощать воду и образовывать вязкие растворы [118].
Количество пентозанов в зерне ячменя достигает 7–11 %. Среди гемицеллюлоз в клеточных стенках тканей ячменя основном преобладают – глюканы.
Ячмень и овс обладают наибольшим содержанием р-глюкана, среди выращиваемых зерновых культур. Значение этого показателя качества пшеницы, ячменя, овса и ржи составляет 0,6; 4,2; 3,9; 2,5%, соответственно, в эндосперме – 0,3; 4,1; 1,8; 1,7% по сухой биомассе [125].
Разделение гемицеллюлозы и гумми-веществ на две группы определяется растворимостью в воде. Гемицеллюлоза растворима в разбавленных щелочах, но не растворима в горячей воде Гумми-вещества растворяются в воде при температуре выше 40С. [62].
Ячмень содержит гораздо больше некрахмальных полисахаридов, чем пшеница. Так, пшеница содержит -глюкана в среднем до 0,06%; гемицеллюлозы – до 3,1–4,4; гумми-веществ – от 1,1 до 1,8; целлюлозы до 3,0. Ячмень в свою очередь содержит –глюкана до 0,18 % [125, 118].
Изменение вязкости ячменного замеса на стадии водно-тепловой подготовки
Дня изучения изменения вязкости ячменного замеса использовали ячмень с крахмалистостью 52 %, влажностью 14.0 %. степенью измельчения: 75-80% и 95-100%.
На ротационном вискозиметре «Реотест-2» изучены реологические характеристики ячменных замесов, что позволяет проследить превращение крахмала и других компонентов сырья в динамике.
Приготовление замеса осуществляли путем смешивания измельченного зерна с водой температурой 45—50С в соотношении 1:3. В качестве источника термолабильной а-амилазы использовали ферментный препарат Alphafemi 3500L дозировкой 0.5—1.0 ед. АС/г крахмала. В качестве источника протеаз-протеолитический ферментный препарат Prolyve BS Liquide в количестве 0.2 ед. ПС/г крахмала. BrewZyme BGX. Shearzyme 500L и ViscoStar 150L были использованы дня расщепления некрахмальных полисахаридов в зернах ячменя.
Ферментные препараты вводились в замес и инкубировались в течении 40 минут при тмператур 50С. Затем замес подогревали до температуры 95 С при скорости нагрева 1.0-1,5С7мин. В процессе нагревания при каждом повышении температуры на 5С фиксировали величину вязкости.
На вязкость замесов оказывают влияние степень измельчения зерна. гидромодуль (ш) и применяемые ферментные препараты. На рисунках 3.3 и 3.4 показано влияние с гидромодуля на вязкость ячменных замесов. Все графики носят экстремальный характер. Вязкость вначале падает, а затем резко возрастает и достигает максимума при температуре клейстеризации крахмала и далее вновь падает. Это связано с тем. что сначала образуется структурная крахмальная сетка, которая затем при повышении температуры разрушается.
Наибольшее значение вязкости для помола со степенью измельчения от 75 до 80 %, наблюдается при температуре 85С с гидромодулем 2,5– 23 Пас, для помола со степенью измельчения от 95 до 100 % – при температуре 80С с гидромодулем 2,5 и равна 29 Пас.
При использовании различных видов зернового сырья в производстве этанола необходимо учитывать не только содержание крахмала как основного компонента зерновых, но и белковых веществ и некрахмальных полисахаридов, присутствующих в них. Для повышения степени биоконверсии всех составных зерна необходимо выбрать специальные мультиэнизмные системы, использование которых позволит эффективно использовать все компоненты зернового сырья.
Отмечено, что вязкость замеса зависит от применяемого ферментного препарата. Максимальное значение вязкости соответствует контрольному образцу (без ферментов) и составляет около 25 Па с (t = 80С). Минимальная вязкость (14 Пахе) наблюдается в случае применения ферментного препарата ViscoStarl50L.
При ферментативном гидролизе препаратом ViscoStar 150L. происходит изменение состава полисахаридов в сторону повышения низкомолекулярных фракций, повышается подвижность замесов. Ферментные препараты Shearzyrne 500L и BrewZyme BGX менее эффективны для данного вида сырья. соответственно были проведены последующие исследования с использованием ViscoStar 150L.
По мере увеличения дозировки препарата ViscoStar 150L (рис. 3.6) вязкость смеси снижается. Для снижения расхода ферментного препарата в последующих исследованиях использовалась дозировка 0,02 -ГкС/г крахмала.
Продолжительность обработки замеса ферментным препаратом ViscoStar 150L влияет на его вязкость. С увеличением продолжительности обработки (рис. 3.8) вязкость замеса уменьшается. С целью экономии времени на приготовления замеса достаточна его обработка ферментным препаратом ViscoStar 150L в течение 40 мин, так как при дальнейшем увеличении продолжительности существенного снижения вязкости не наблюдается.
При обработке замеса ферментным препаратом ViscoStar 150L в течении 20 мин наблюдается увеличение вязкости замеса до 30 Пас при нагревании его до температуры 80С. Это возможно связано с гидролизом гемицеллюлоз и –глюкана до промежуточных продуктов, повышающих вязкость замеса. При более длительной обработке идет дальнейший гидролиз гемицеллюлоз и –глюкана до более низкомолекулярных веществ, что приводит к снижению вязкости замеса.
Ферментный препарат Alphaferm 3500L значительно снижает вязкость (рис. 3.9) на 48% и 68% при дозировке 0,5 и 1,0 АС/г крахмала соответственно. Кроме того, при применении этого фермента пик максимальной вязкости (рисунок 3.9) сдвигается в сторону меньших температур и соответствует 60С. Снижения вязкости замеса происходит за счет деструкции цепей крахмала а-амилазой до декстринов и небольшого количества Сахаров.
Комбинированное действие мультиферментативного комплекса снижает вязкость ячменного замеса на 82% по сравнению с контролем. вязкость увеличивается без резких скачков, плавно (рис. 3.10). Применение дополнительных ферментных препаратов ViscoStar 150L и Prolyve BS Liquide в ходе ВТО снижает расход а-амилазы с 1.0 до 0.5 единиц. AC/g крахмал. Это позволяет HaqjeBaib замес до высокой температуры и выдерживать его в течение времени, которое необходимо по технологическому режиму. перерабатывать высококонцентрированные замесы, снижать расход теплоэнергоресурсов. увеличить производительность предприятия.
Оптимизация процесса осахаривания
Оптимизацию процесса осахаривания разваренной массы была выполнена с применением метода полного факторного эксперимента 24 с использованием центрального композиционного ротатабельного униформпланирования эксперимента (ЦКРП).
В качестве контролируемых факторов были выбраны: Xi - дозировка ферментного препарата Biozim 800L, Х2- температура, Хз- рН, Х4 продолжптельностъ гидролиза.
Критерием оценки влияния различных факторов на процесс осахаривания разваренной массы выбрана массовая доля глюкозы (Y) в фильтрате сусла после осахаривания. Программа исследованігіі была включена в матрицу экспериментального планирования (таблица 4.5).
Статистическая обработка экспериментальных данных в программе STATISTICA 6.0 позволило получить следующее уравнение регрессии. которое описывает изменение массовой доли глюкозы в сусле под влиянием изучаемых факторов: У = 9,4 + 0,75X1 +0.12X2 +0.25X3 +0.86X4 -0.18X22 --0.14X32 -0.15X1 X4 +0.12X2X3 + 0.13 X1X2X3 -0.12 X 1 X 3 X (4.5)
Анализ уравнения регрессии позволяет лучше распределить факторы, влияющие на рассматриваемый процесс. Знаки "+" перед линейными членами уравнения указывают на то, что увеличение исследуемых факторов приводит к увеличению выходных параметров. Наибольшее влияние на процесс осахаривания оказывает дозировка ферментного препарата Biosim 800L и продолжительность процесса.
Значимость коэффициентов регрессии определялась критерием Стьюдента, адекватность уравнения регрессии критерием Фишера на уровне значимости 5% и сходимость параллельных определений по критерию Кохнера.
Получены данные о влиянии различных факторов на накопление глюкозы и построена математическая модель процесса, позволяющая рассчитать её массовую долю в сусле в выбранных диапазонах изменения.
На рисунках 4.5-4.11 показаны кривые равных значений массовой доли глюкозы в сусле и площади поверхности уровней отклика для межфакторного взаимодействия. Для построения поверхностей отклика уравнение регрессии было приведено к двум факторам последовательным уравнением при нулевом уровне двух других факторов. Поверхности получаются в виде "выпуклости". Кривые поверхности отклика имеют значение номограмм и представляют практический интерес. Зная значение параметров и используя полученные коэффициенты, можно рассчитать количество глюкозы в сусле до окончания процесса осахаривания
При выборе оптимальных параметров накопления глюкозы в сусле при осахаривании необходимо исходить из максимально допустимых значений: Х1 = 0,870, Х2 = 0,145, Х3 = 0,222, Х4 = 0,925 или, переходя от закодированных значений к натуральным, получим: дозировка ферментного препарата Biozim 800L, Х1 = 4,8 ед ГлС/г крахмала; температура Х2 = 60,2С; рН, Х3 = 4,55 ед; время осахаривания, Х4 = 2,05 ч.
Показатели ячменного сусла, полученного в оптимальных условиях осахаривания разваренной массы, представлены в табл. 4.7.
Как видно из таблицы, экспериментальный вариант сусла лучше, чем контрольный вариант по всем показателям. Основным показателем является содержание глюкозы в сусле, которое на 40,5 % выше, чем в контрольном образце.
Изучение влияния рН сусла на накопление побочных продуктов брожения в бражке
Ионы водорода изменяют электрический заряд коллоидов в плазменной мембране клеток и, в зависимости от концентрации, могут увеличивать или уменьшать их проницаемость для отдельных веществ и ионов. Значение pH определяет скорость, с которой питательные вещества попадают в клетку, активность ферментов и образование витаминов. При изменении pH среды изменяется само направление ферментации [75].
Сусло подкисляли серной кислотой до pH 4.0; 4.5; 5.0 и 6.0 (контроль). Дрожжи инокулировали в количестве 10 % от объема сусла. Ферментацию сусла проводили с помощью Saccharomyces cerevisiae расы XII в течение трех дней при температуре 28-30С. В конце ферментации содержание глицерина в полученной среде определяли йодометрическим методом, летучих примесей - газохроматографическим методом.
На рис. 5.10 показано влияние рН на накопление глицерина в зрелой бражке.
Из рис. 5.10 видно, что с увеличением рН содержание глицерина увеличивается и достигает максимума в контроле при рН 6,0. Эта закономерность объясняется тем, что реакция «щелочного брожения», ведущая к образованию глицерина, признана той побочной реакцией, торможение которой обуславливает повышение спирта. Подкисляя сусло, воздействовали на реакцию «щелочного брожения». Это оказало тормозящие действие на реакцию образования глицерина в силу того, что исследуемая реакция подчиняется закону действующих масс, т. е. из-за установления ионного равновесия.
Возможно искусственное подавление реакции «щелочного брожения», путем воздействия на нее продуктом реакции, т. е. уксусной кислотой, в расчете на то, что избыток ионов уксусной кислоты в среде окажет более мощное тормозящее действие на реакцию образования глицерина. При внесении уксусной кислоты в сусло содержание глицерина в зрелой бражке снижается на 0,05 г./100 см3 и тем самым позволяет увеличить выход спирта [75].
Было установлено, что интенсивное образование глицерина наблюдается в первый период брожения возбраживания, когда наблюдается интенсивное размножение дрожжей. В дальнейшем, в процессе брожения образования глицерина практически не наблюдается. Это происходит в результате того, что образуется ацетальдегид, который оказывает тормозящие действие на реакцию образования глицерина.
По мере снижения рН сусла до 4,5 содержание альдегидов уменьшалось на 10–15 % (рис. 5.11), высших спиртов на 8–10 % (рис. 5.12), глицерина на 15–20 % (рис. 5.10), а также наблюдается небольшое снижение содержания кислот и эфиров.
Альдегиды являются промежуточными продуктами спиртового брожения, кроме того, образование альдегидов возможно в результате окисления спиртов кислородом воздуха, а также некоторых вторичных реакций. Образование альдегидов в зрелой бражке наблюдается на протяжении всего процесса брожения, только к окончанию процесса брожения наблюдается некоторое снижение содержание альдегидов, что возможно связано с взаимодействием их со спиртами.
Эфиры являются продуктами химического взаимодействия спиртов и кислот, содержащихся в бродящей массе, а также являются продуктами жизнедеятельности посторонней микрофлоры. Они накапливаются в бражке на протяжении всего процесса брожения.
Высшие спирты – побочные продукты спиртового брожения. Они формируются в анаэробных условиях вторично из кетокислот, образующихся в результате переаминирования аминокислот. Формирование спиртов связано с накоплением биомассы дрожжей в начале процесса брожения при возбраживании, в дальнейшем в процессе брожения накопления высших спиртов практически не наблюдается [75].