Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Информационно-аналитический обзор 16
1.1. Биоконверсия отходов растительного происхождения в биологически активные компоненты и полезные продукты пищевого и кормового назначения 16
1.1.1. Способы переработки сельскохозяйственных отходов и интенсификации микробной биоконверсии для получения кормовых добавок и пищевых премиксов 19
1.1.1.1. Ускоренная биоферментация соломы гречихи с целью получения кормовых продуктов. 21
1.1.1.1.1. Повышение питательной ценности грубых кормов биотехнологическим методом 22
1.1.1.1.2. Перспективные штаммы микроорганизмов и их значение 24
1.1.2. Биотехнологические основы производства БАД к пище и их безопасность 27
1.1.3. Значение БАВ и пищевых премиксов и их место в современной нутрициологии 38
1.2. Механизмы антитоксического действия биологически активных соединений сельскохозяйственных культур 42
1.3. Флавоноиды и антоцианидины как природные антиоксиданты 46
1.4. Продукты вторичного обмена и функциональный стиль питания 53
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследований 61
2.1. Организация и схема проведения исследований 61
2.2. Характеристика объектов исследований
2.2.1 Отходы возделывания и переработки гречихи 62
2.2.2 Характеристика проростков гречихи 64
2.2.3 Характеристика производственных культур молочнокислых бактерий 65
2.3. Методы исследований 65
ГЛАВА 3. Производство вторичных ценных продуктов на основе отходов возделывания и переработки гречихи 67
3.1. Биогенетический комплекс флавоноидов гречихи 67
3.2 Получение экстрактов из гречихи 77
3.2.1 Стандартизация экстрактов из гречихи 86
3.2.2 Сравнительная оценка оптических и физико-химических свойств растительных экстрактов 93
3.2.3 Исследование антиоксидантных свойств экстрактов гречихи 114
3.3. Технология переработки растительного сырья с целью получения БАВ, СЗР, пищевых премиксов и кормовых добавок. 116
3.4. Изучение показателей качества РутиФлав гречихи при хранении 125
Заключение 127
ГЛАВА 4. Биотехнологическая переработка отходов производства гречихи с целью получения бав и пищевых премиксов 133
4.1. Исследование влияния способов термической обработки на структуру соломы гречихи 133
4.2. Исследование влияния ферментативного гидролиза на структуру соломы гречихи 137
4.3. Исследование влияния способов термической обработки и ферментативного гидролиза на компоненты химического состава соломы гречихи 147
4.4. Влияние нитрозоаминов и пестицидов на ферментолиз отходов переработки гречихи 157
Заключение 163
ГЛАВА 5. Обоснование использования отходов биотехнологических производств в качестве компонентов субстратов для культивированияstreptococcus salivarius subsp. thermophilus и lactococcus lactis subsp. lactis 167
5.1. Использование отходов производства лектинов и картофельного гранулята в качестве углерод- и азотсодержащих компонентов ферментационных субстратов для S. thermophilus, Lc. lactis 168
5.1.1 Изучение химического состава отходов производства лектинов и картофельного гранулята 168
5.1.2 Исследование влияния компонентов отходов производства лектинов и картофельного гранулята на удельную скорость роста S. thermophilus, Lc. lactis и экономический коэффициент 171
5.2. Исследование влияния продуктов переработки сои на рост пробиотических микроорганизмов 181
5.2.1. Исследование влияния продуктов переработки сои на параметры роста микроорганизмов S. thermophilus, Lc. lactis 181
5.2.2 Подбор концентрации соевого молока и соевого концентрата в составе питательных сред по экономическому коэффициенту 199
5.2.3. Исследование влияния минеральных солей на рост S. thermophilus, Lc. lactis S. thermophilus, Lc. lactis 210
5.3. Применение стимуляторов роста, выделенных из отходов возделывания сельскохозяйственных культур в культивировании пробиотических штаммов микроорганизмов 214
Заключение 235
ГЛАВА 6. Биохимические свойства и антимикробная активность молочнокислых бактерий 237
6.1. Исследование устойчивости S. thermophilus и Lc. lactis к химически агрессивным факторам среды 237
6.2. Исследование физиолого-биохимических свойств S. thermophilus и Lc. lactis 244
6.3. Исследование антагонистической активности по отношению к
санитарно-значимым кишечным микроорганизмам и плесневым грибам 247
6.4 Исследование совместного роста пробиотических культур 249
Заключение 253
ГЛАВА 7. Биотехнологии функциональных продуктов и напитков антиоксидантного, капилляроукрепляющего, противоаллергического, гепатопротекторного, антимикробного действия . 255
7.1. Стабилизация показателей качества продуктов животного происхождения биофлавоноидами гречихи 255
7.1.1 Влияние антиоксидантов природного происхождения на качество жиров при хранении 255
7.1.2 Влияние антиоксидантов природного происхождения на качество колбасных изделий при хранении
7.1.3. Исследование пищевой ценности и показателей безопасности мясных модельных систем с биофлавоноидами гречихи в результате хранения 268
7.1.4. Исследование влияния дозы внесения биофлавоноидов на физико-химические свойства мясных систем 275
7.1.5. Исследование влияние растительных экстрактов на органолептические и физико-химические свойства колбасных изделий 287
7.2. Разработка технологии функциональных продуктов с использованием рутина, биофлавоноидов и экстрактов гречихи 296
7.2.1 Исследование органолептических свойств козьего молока под воздействием экстрактов гречихи 296
7.2.2 Исследование физико-химических свойств козьего молока под воздействием экстрактов гречихи. 300
7.2.3 Исследование микроструктуры козьего молока при сквашивании под воздействием экстрактов гречихи и Lc. lactis МО 032. 303
7.2.4 Исследование антиоксидантной активности обогащенного рутином молока 305
7.2.5 Разработка технологии напитка сывороточного с экстрактом гречихи 307
7.2.6 Разработка технологии функциональных напитков с использование проростков гречихи 310
7.2.7 Исследование влияния ультразвуковой обработки на активность молочнокислых микроорганизмов при производстве функциональных продуктов 318
Заключение 330
ГЛАВА 8. Расчет экономической эффективности производства фитодобавок и функциональных продуктов 333
Основные результаты и выводы 339
Список литературы 342
- Перспективные штаммы микроорганизмов и их значение
- Отходы возделывания и переработки гречихи
- Сравнительная оценка оптических и физико-химических свойств растительных экстрактов
- Исследование влияния способов термической обработки и ферментативного гидролиза на компоненты химического состава соломы гречихи
Введение к работе
Актуальность проблемы. Гречиха обыкновенная является важной зерновой культурой для Орловской и ряда других областей Центральной России. Особенностью данной культуры является наличие биофлавоноидов (БФ) с доминированием рутина. Содержание рутина в растениях разных сортов и видов гречихи колеблется, что дает возможность выявления форм с высоким содержанием витамина Р и получения новых продуктов питания, обогащенных биологически активными веществами. Актуальность производства продуктов функционального назначения неизмеримо растет, особенно в связи с появлением новой нозологической формы – «лекарственной болезни», с ростом токсико-аллергических заболеваний, ослабления иммунитета в результате повышения потребления химико-терапевтических средств, неблагоприятной экологической обстановки.
Ассортимент продуктов профилактического назначения,
удовлетворяющих запросам потребителей, ограничен. В настоящий момент в
России подавляющее большинство пищевых ингредиентов, добавок,
премиксов импортируется, в связи с чем, организация их производства
является остросоциальной задачей. Эффективность решения этой проблемы во многом определяется четкой научной системой рационального, патогенетически оправданного применения функциональных ингредиентов из натурального сырья с учетом технологических аспектов производства в получении новых видов пищевых продуктов, витаминопрофилактике и здоровом питании.
В связи с этим исследования, посвященные разработке биотехнологий
функциональных продуктов питания на основе компонентов гречихи и
пробиотических культур, а также определение возможностей более полноценной
утилизации отходов производства гречихи и получения спектра продукции для
фармацевтической, пищевой, кормовой, сельскохозяйственной
промышленности, являются своевременными.
Степень разработанности темы. Изучением биоконверсии
сельскохозяйственных отходов, в т.ч. и гречихи, в полезные продукты занимаются Панфилов В.И., Градова Н.Б., Кузнецов А.Е., Шакир И.В., Исакова Е.П., Поляков А.Н., Зябрева Н.В., Гнеушева И.А. и многие другие. Значительный вклад в теорию и практику природных веществ различных классов, концепцию фармаконутриентологии внесли акад. А.А. Покровский, акад. В. А. Тутельян, Т.Л. Пилат, А. П. Нечаев, О. В. Багрянцева, Кочеткова А.А. и др.
Накапливается отечественный и международный опыт использования обогащенных премиксами пищевых продуктов, появляются доказательства наличия антиоксидантных свойств у некоторых молочнокислых бактерий (МКБ). Так, М. А. Усковой, В. А. Тутельян, Кравченко Л.В. (ФИЦ питания и биотехнологии) установлено синергетическое действие рутина и L. casei при совместном поступлении с пищей, что проявляется в возрастании антиоксидантной емкости плазмы крови, печени и слизистой оболочки тонкого кишечника.
Необходимо также отметить отсутствие результатов исследования по технологии производства функциональных продуктов питания с применением рутина из гречихи в сочетании с пробиотическими молочнокислыми микроорганизмами.
Связь работы с научными проектами. Работа выполнена в 2002-2016 г.г. в соответствии с Федеральной Целевой программой и Перечнем Критических Технологий РФ; с государственным контрактом Министерства промышленности, науки и технологий РФ по темам: «Трансформация генофондов и реализация биологического потенциала зернобобовых культур»; «Разработка экологосберегающих технологий производства кормов для сельскохозяйственных животных»; с фундаментальными исследованиями, научно-исследовательскими и опытно-конструкторскими и технологическими работами в рамках раздела “Исследования и разработки, выполняемые государственными научными центрами Российской Федерации” ФНЦТП “Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники”, а также отраслевыми научными программами по заказам Министерства сельского хозяйства РФ в рамках Российской научно-технической программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации по темам: «Разработка ускоренных методов для исследования микроорганизмов, новых сортов сельскохозяйственных растений, плодовых, ягодных и технических культур к вирусам и вироидам методами электрофореза белков и ДНК- технологий, а также анализа кормовых добавок, отходов животноводства экспресс-методами»; «Разработка экологосберегающих технологий производства продукции животноводства и совершенствования систем селекции с/х животных в условиях членства России в ВТО»; с договором на проведение научно-исследовательских работ по теме: «Создание продукта для детского питания на основе картофеля» (ЗАО «Погарская картофельная фабрика»); с договором «Выделение функционально-значимых для пищевой промышленности веществ из гречихи, овса и ячменя и изучение их биологической активности» (Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики имени Н.М. Эммануэля).
Цель работы: Исследование и обоснование использования БАВ гречихи посевной как потенциального сырьевого источника флавоноидных препаратов, витамина Р, средств защиты растений, стимулятора роста м/о, различных композиций для стабилизации показателей качества продуктов животного происхождения и получения новых функционально полезных продуктов питания.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
-выявление промышленно значимого сырья с высокой Р-витаминной активностью;
-исследование биогенетического комплекса флавоноидов гречихи в разных органах растения;
-разработка режимов экстрагирования БАВ из гречихи и факторы, обеспечивающие максимальный выход и сохранность биофлавоноидов, в том числе рутина для разнонаправленного использования;
-разработка технологии производства РутиФлава;
- изучение сроков и условий хранения на антиоксидантную активность БАВ и экстрактов;
-получение новых стимуляторов роста для культивирования пробиотических микроорганизмов и изучение их влияния на рост и развитие Streptococcus salivarms subsp. thermophilus штаммов ST-441; ST 020.
-определение биохимических свойств Streptococcus salivarius subsp. thermophilus ST-441; ST 020, с выявлением диапазона антибиотических препаратов, по отношению к которым данный микроорганизм проявляет резистентность, и изучением его антагонистических свойств по отношению к различным видам грамположительных и грамотрицательных бактерий;
-разработка рекомендаций по безотходной переработке гречихи на основании исследований химического состава и структуры ферментолизатов остатка соломы гречихи после извлечения БАВ;
-стабилизация показателей качества продуктов животного происхождения биофлавоноидами гречихи;
-разработка технической документации функциональных продуктов и
напитков с использованием пробиотических культур, обогащенных БАВ
гречихи антиоксидантного, капилляроукрепляющего,
противоаллергического, гепатопротекторного, антимикробного действия.
-разработка методологии комплексной оценки качества ФПП, содержащих рутин;
-оценка экономической эффективности производства фитодобавок и функциональных продуктов.
Научная новизна работы.
Выявлены генотипы гречихи (Молва, Антоциановая, Баллада, Дизайн, Деметра, Дружина) с максимальным накоплением флавоноидов в цветках и листьях с целью использования их в качестве сырья для промышленного получения рутина.
Проведена оценка биологической активности гречихи, установлены факторы, увеличивающие выход БАВ, их растворимость, биодоступность, уменьшение потерь при хранении.
Разработаны средства для предпосевной обработки семян гороха с биофлавоноидами гречихи.
Апробирован при масштабировании Streptococcus salivarius subsp. thermophilus стимулятор роста из гречихи.
Отработана технология биоконверсии продуктов переработки гречихи и отходов ее возделывания.
Определен эффект антиоксидантной активности биофлавоноидов гречихи на продление сроков хранения молочной и мясной продукции.
Предложен механизм бактерицидного воздействия Streptococcus salivarius subsp. thermophilus на продукцию путем саморегулирующейся реакции образования лантибиотиков.
Разработана математическая модель для оптимизации количества вносимых проростков гречихи в молочные продукты.
Отработан алгоритм получения многокомпонентных напитков с
применением ультразвуковой обработки на этапе внесения закваски молочнокислых бактерий с целью стимуляции ферментативной активности.
Научно обосновано обогащение рутином молока и получение функциональных напитков с использованием экстрактов гречихи и молочной сыворотки. На основании результатов биологической активности, научной и патентной литературы сформулированы рекомендации для функциональных напитков, рекомендованных для употребления в качестве регуляции обмена веществ, функций сердечно-сосудистой, иммунной систем, а также фитнес-напитков и напитков для завтрака.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Разработана технология производства РутиФлав, зарегистрирована торговая марка продукта, полученного на основе биофлаваноидов гречихи -«РутиФлав». Получены патенты на изобретение «Способ получения рутина», «Средство для предпосевной обработки семян гороха», в состав композиций которых входят биофлавоноиды гречихи.
Проведенные исследования позволяют разработать биотехнологии функциональных напитков и компонентов, входящих в их состав, обладающих антирадикальным, антиоксидантным, иммунокорректирующим и другими действиями с улучшенными технологическими и биологическими свойствами.
Показана целесообразность использования фитодобавок на основе
биофлавоноидов гречихи при производстве молочных продуктов
функционального назначения. На основании проведенных экспериментальных
исследований определены оптимальные концентрации и способы
использования антиоксидантов при обогащении молочных продуктов. В работе предложена методика определения рутина в молоке и молочных продуктах.
Разработан стимулятор роста Streptococcus salivarius subsp. thermophilus,
подана заявка на изобретение «Способ получения стимулятора роста
Streptococcus salivarius subsp. thermophilus».
Предложены способы получения МКБ на ферментативных гидролизатах отходов производства рутина из гречихи посевной.
Материалы диссертации используются в учебном процессе при чтении лекций по специальности 19.03.01 «Биотехнология» в ФГБОУ ВО «Орловский государственный аграрный университет имени Н.В. Парахина».
Разработана техническая документация на производство
функциональных продуктов питания: ТУ, ТИ 10.51.52-001-05013607-2016 «Напитки кисломолочные, обогащенные пророщенными семенами гречихи»; ТУ, ТИ 10.51.55-002-00492894-2016 «Напиток сывороточный с экстрактом
гречихи»; ТУ, ТИ 10.51.11-003-05013607-2016 «Молоко питьевое
пастеризованное «РУТА», обогащенное рутином».
Научная новизна и практическая значимость работы подтверждена получением шести патентов РФ.
Апробация работы. Основные положения и результаты
диссертационной работы докладывались и обсуждались на 11-ом
Международном симпозиуме по гречихе (Орел, 2010); I, II, IV, V, VI, VII, VIII,
IХ Московских международных конгрессах «Биотехнология: состояние и
перспективы развития» (Москва, 2002, 2003, 2007, 2009, 2011, 2013, 2015,
2017); II, IV, V съездах Общества биотехнологов России (Москва, 2004, 2006,
2008); международных, всероссийских и региональных научных, научно-
практических конференциях и выставках: «Роль Черноземья в обеспечении
продовольственной безопасности России и экспорта сельскохозяйственной
продукции» (Орел, 2016); «Продовольственная безопасность: научное, кадровое
и информационное обеспечение» (Воронеж, 2015); «Биотехнология: экология
крупных городов» (Москва, 2010); «Биотехнология и качество жизни» (Москва,
2014); «Биология – наука XXI века» (Москва, 2012); «Биоантиоксидант»
(Москва, 2010); «Инновационный потенциал молодых ученых – АПК
Орловской области» (Орел, 2010); «Инновации аграрной науки и производства»
(Орел, 2011); «Инновационные биотехнологии в селекции растений,
животноводстве, бионанотехнологии и медицине» (Брянск, 2011);
«Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж,
2012); «Теоретические и прикладные аспекты современной науки» (Белгород,
2014); «Пути повышения устойчивости сельскохозяйственного производства в
современных условиях» (Орел, 2005); 1-ой международной телеконференции:
«Фундаментальные медико-биологические науки и практическое
здравоохранение» (Томск, 2010); интернет-конференциях: «Инновационные
фундаментальные и прикладные исследования в области химии
сельскохозяйственному производству» (Орел, 2012); «Актуальные проблемы в биотехнологии, молекулярной биологии и генетики» (Алматы, 2014), вебинаре «Технология производства антиоксидантного средства из гречихи под торговой маркой «РутиФлав» (Орел, 2015).
Основные положения, выносимые на защиту:
Перспективное сырье (промышленно значимые морфотипы Fagopyrum esculentum Moench) для выделения комплекса биологически активных веществ (РутиФлав), рутина, пищевых волокон, кормовых добавок, средств защиты растений, стимуляторов роста м/о.
Качественный и количественный состав водно-этанольных экстрактов гречихи посевной с использованием физических факторов, их стандартизация и изучение антиоксидантных свойств при хранении.
- Технология РутиФлав и перспективы его применения в
фармацевтической, химической, пищевой и кормовой промышленностях.
- Результаты научно-обоснованного использования ферментолизата в
биотическом обороте соломы гречихи.
- Получение многокомпонентных напитков (обогащенных рутином) с
применением ультразвуковой обработки на этапе внесения закваски
молочнокислых бактерий с целью стимуляции функционально значимых
продуцентов.
- Математические модели, позволяющие оптимизировать количества
вносимых проростков гречихи в производства кисломолочных продуктов.
- Биохимические свойства Streptococcus salivarius subsp. thermophilus ST-
441; ST 020, с выявленным диапазоном антибиотических препаратов, по
отношению к которым данный микроорганизм проявляет резистентность.
- Методология комплексной оценки качества ФПП, содержащих рутин.
Публикации. По материалам исследований опубликовано 104 печатных
работ, в том числе 25 в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК России, 6 патентов РФ, 3 монографии.
Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена постановка задач, моделирование изучаемых процессов, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования и обсуждения результатов в научных публикациях и докладах.
Структура и объем работы. Материалы диссертационной работы изложены на 296 страницах машинописного текста и включают 174 рисунка и 67 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 450 наименований. Диссертация состоит из введения, 8 глав, заключения, выводов, списка литературы и приложений.
Перспективные штаммы микроорганизмов и их значение
Существуют различные способы переработки и утилизации сельскохозяйственных отходов с помощью механических, физико-химических, химических и биологических методов. При выборе способа утилизации приоритет, в основном, отдается способам, направленным на извлечение из отходов полезных компонентов [116, 195, 304].
Механическая обработка позволяет изменить физические параметры отходов – размер фракций, плотность и др. Для этого используются технологии дробления, сепарации, прессования и брикетирования. http://www.saveplanet.su/articles_433.html
Физико-химических методы применяются для очистки отходов от конкретных удаляемых веществ: аммиака, сероводорода и других опасных компонентов путем флоккуляции, осаждения, адсорбции, ионного обмена, экстракции, обратного осмоса и ультрафильтрации [308, 451]. Химическая переработка целлюлозосодержащего сырья осуществляется воздействием на биомассу щелочей, кислот, кислых солей, сернистой кислоты, растворителей, а также термическим разложением [107].
В основе биологических методов переработки отходов лежит способность микроорганизмов различных видов в результате своей жизнедеятельности разлагать или усваивать растительные компоненты и органические загрязнители [97].
Согласно принятой классификации, встречающейся у многих авторов и внесенной в регистр РСТ ИСО 9000, биологические методы делят на микробиодеградацию загрязнителей, биопоглощение и перераспределение токсикантов [11, 87, 88, 196]. Для очистки почв используют сообщества бактерий: бактериум (кишечная палочка), азотобактер, микрококки (артробактерия), актиномицеты (актиномицеты, микобактерии, стрептомицеты), серобактерии (гамма- и бета-протеобактерии), бациллы (сенная палочка) и другие, а также низшие формы грибов (аспергилла, фузарий) [85, 113, 166].
При биоконверсии растительного сырья применяются также различные группы микроорганизмов: бактерии, дрожжи, микроскопические грибы [115, 116, 168].
В связи с тем, что в природных условиях процессы биодеструкции идут медленно, в управляемых же системах уделяется внимание интенсивности процесса и выходу конечного продукта.
Основные способы интенсификации направлены на повышение продуктивности микроорганизмов. Для этого ведется селекционная работа с помощью генной инженерии. Особое значение приобретает использование ассоциативных групп микроорганизмов для утилизации сложных субстратов [105, 309].
Другие способы предполагают оптимизацию состава питательной среды, изменение условий культивирования микроорганизмов, повышение концентрации микробной биомассы в среде или иммобилизацию клеток на инертном носителе.
Немалую роль играет и техническое перевооружение реакторов и систем его управления путем внедрения непрерывных процессов, их автоматизации, повышения энергоемкости технологического оборудования и т. д. [10, 16, 96,157].
Существующие риски экологических проблем переработки возобновляемого растительного сырья можно решить биотехнологическими методами. Современные направления биоконверсии биомассы включают экструзионную переработку биологических отходов в корма, микробную протеинизацию углеводсодержащего сырья, вермикомпостирование, метановое сбраживание для энергетических целей и удобрений и прочее [25, 99,134]. Подобные исследования активно ведутся как в нашей стране, так и за рубежом. Например, жительница Вьетнама Транг Тран предложила альтернативный способ переработки рисовых стеблей в подкормку для грибов, остатки грибов так же будут перерабатываться в удобрения [453. 454].
На кафедре фармацевтической биологии университетского центра фармации, университет Гронингена, Нидерланды занимаются получением лекарственных средств в результате биоконверсии, или в комбинации с химическим синтезом. Там же ведутся исследования по производству терпеноидов с использованием методов метаболической инженерии сенной палочки [292, 313]. Преобразованием биомассы (остатков топлива или культур) и отходов, начиная от научных исследований до коммерческих предложений, занимаются группы компании «Bioconversion Austria Companies Worldwide». Большая часть исследований направлена на ферментацию лигноцеллюлозного субстрата в производстве биотоплива [269, 353, 384].
Солома гречихи является распространенным и практически не востребованным возобновляемым сырьем. Непосредственное вскармливание животным приводит к нежелательным последствиям (токсикозам, выпадением шерсти, солнечным ожогам и т.д.), запахивание её в землю, в качестве органического удобрения недопустимо, так как почвенный азот используется не для питания корневых систем, а для процессов разложения органических остатков, земля закисляется и становится неплодородной [175].
Не смотря на это, солома гречихи обладает рядом полезных свойств и содержит биологически активные вещества, стимулирующие рост растений и являющиеся компонентами средств защиты растений от болезней, поражаемости вредителями [149].
После экстракции этих соединений, солома содержит прекрасный материал для биоферментации Aspergillus, Trichoderma и Fusarium, продуцирующих глюкоамилазы и ксиланазы, способных гидролизовать лигнин, целлюлозу и гемицеллюлозу. В результате образуются продукты, которые можно использовать в различных отраслях перерабатывающей промышленности и сельского хозяйства (производство кормов для животных, спиртовой) [80, 81, 153, 251, 354, 359 ].
Переработке пшеничной соломы микроскопическими грибами посвящено немало работ, что нельзя сказать о биотрансформации соломы гречихи. Однако имеются сведения о ее высокой питательной ценности. В 1 кг гречневой соломы содержится 0,29 корм, ед., 24 г переваримого протеина, 15,7 г кальция, 1,4 г фосфора и 29 мг каротина, а в 1 кг половы — 0,56 корм, ед., 8,2 г переваримого протеина, 23,9 г кальция, 2,4 г фосфора и 106 г каротина [314, 453, 454].
Отходы возделывания и переработки гречихи
Это подтверждено многочисленными клиническими исследованиями, например употребление экстрактов плодов черники оказывает ингибирующее действие на клетки человеческой лейкемии и карциномы, положительно действует при микробных инфекциях, диарее и в целом ряде иных заболеваний [6-8], однако систематические исследования фармакологических свойств изолированных из природных объектов антоцианов in vitro, in vivo и в клинических опытах проводится и сейчас [7, 9]. В опытах in vitro и in vivo Hou D-X. установил, что антоцианы уменьшают скорость деления раковых клеток, препятствуя образованию опухолей [301, 302]. Это подтвердили Kang, Seeram и др., которые проводили опыты на мышах, используя антоцианы вишни [315, 323]. Зафиксировано уменьшение скорости образования пероксидов на 39 75% в зависимости от вида антоциана при концентрации 2 ммоль/л. Такая активность сопоставима с активностью трет-бутилгидрохинона и бутилокситолуола и выше, чем активность витамина Е. С. Было выдвинуто предположение, что способность антоцианов влиять на канцерогенез, связана со сложным механизмом действия, включающим ингибирование циклооксигеназных ферментов за счет высокого антиокислительного потенциала антоцианов. На кафедре биохимической науки и технологии (факультет сельского хозяйства университета Кагосима, Япония) сотрудниками Hou D-X, Kai K, Li J-J, Lin S, Terahara N, Wakamatsu M, Fujii M, Young, M, Colburn, N В найдено, что антоцианы блокируют активацию протеинкиназы [276, 301].
Дейнека с соавторами более подробно описывает роль антоцианов и связывает предотвращение ряда заболеваний с защитой от окислительного стресса. Эпидемиологические исследования показали обратную связь между смертностью от заболеваний сердечно-сосудистой системы и уровнем потребления красных вин [274, 388]. При этом этанолу приписывается эффект уменьшения вероятности тромбообразования, а влияние полифенолов определяется их антиоксидантной активностью. Работами Khan N.Q., Lees D.M. и др. установлено, что экстракты полифенолов красных вин ингибируют синтез эндотелина-1 в культуральных клетках эндотелия аорты крупного рогатого скота, специфически модифицируя сигнал тирозинкиназы. Именно ингибирование синтеза эндотелии-1, вероятно, и объясняет уменьшение вероятности развития атеросклероза и, как следствие, уменьшение риска коронарных заболеваний сердца [275317].
На примере антоцианов бузины (Sambucus) было прямо показано, что антоцианы встраиваются в клетки эндотелия кровеносных сосудов, в значительной мере обеспечивая защиту от оксидантов [445].
Найдено, что дельфинидин (в отличие от цианидина и мальвидина) способствует определяемой эндотелием вазорелаксации аорты крыс [233].
Сырой экстракт черники при оральном или инъекционном введении уменьшал проницаемость капилляров [324].
По данным работы [9] при испытании на мышах диеты, в значительной мере обогащенной жирами, но с добавлением антоцианов, выделенных из кукурузы с пурпурной окраской, не наблюдалось ни увеличение массы тела, ни заметного увеличения отложения жира. Типичные симптомы гипергликемии, гиперинсулинемии и гиперлептинемии, характерные для диет с высоким содержанием жиров, не проявлялись при параллельном введении в диету антоцианов. У мышей, специально сенсибилизированных по отношению к оксидантному стрессу, при использовании обогащенных антоцианами диет существенно снижались индексы окисления жиров и разрушения ДНК [23, 277]. Антоцианам приписывается способность модулировать познавательные и моторные функции, усиливать память, уменьшать возрастные отклонения в нервных функциях. Употребление мышами частично очищенных антоцианов батата пурпурной окраски повышало любознательность мышей, эффективно снижало уровень образования перекисей в жировых тканях мозга [24]. Опыты по введению в корм добавок антоцианов черники свидетельствовали об эффективном восполнении возрастных потерь некоторых моторных функций и памяти [25]. Антоцианы показали сложный защитный эффект против плеврита; установлена их способность гасить воспалительные процессы в легких, снижая активность соответствующих ферментов [26]. Хорошо известна фунгицидная активность антоцианов, включающая ингибирование биосинтеза афлатоксинов [27]. Эпидемиологические исследования подтверждают положительное влияние антоцианов при диабете и панкреатите [28, 29]. По данным работы [30] антоцианы ингибируют окисление липопротеинов низкой плотности [17, 21, 82, 83, 138, 139, 169, 252, 294, 306, 307, 311, 312, 335, 338, 350, 361, 363, 365, 366, 367, 386, 389, 393, 399, 405, 408, 420, 421, 429, 432, 433]
Таким образом, флавоноиды и антоцианы являются эффективными антиоксидантами, специализирующимися на всесторонней защите организма от различных повреждающих агентов и угроз внешней среды.
Сравнительная оценка оптических и физико-химических свойств растительных экстрактов
Так, было обнаружено, что рутин локализован в основном в цветках и листьях, кверцетин, эпикатехин, хлорогеновая кислота в цветках, остальные органы, несмотря на то, что и содержали эти компоненты, но не в промышленно значимых концентрациях, поэтому целесообразно использовать именно комплекс флавоноидов в производстве необходимых продуктов народного потребления.
В связи с широким использованием проростков гречихи в технологии функциональных продуктов питания необходимо проследить динамику накопления геропротекторов – рутина и кверцетина в процессе проращивания.
Из графиков рисунка 8 видно, что за первые два дня роста концентрация рутина и кверцетина практически не меняется, далее наблюдается прогрессивный рост и к седьмым суткам концентрация рутина возрастает в 27, а кверцетина в 22 раза. мг/100 г 300
Богатейший потенциал отходов возделывания, производства и переработки гречихи позволяет целенаправленно разрабатывать эффективные технологии биотехнологических продуктов, что является одной из важнейших целей сохранения благоприятной экологической ситуации.
За 40-50 дней вегетации с одного гектара гречиха способна образовывать до 150-300 Ц. зеленой массы, из которой можно получить от 300 до 600 кг рутина – витамина, обладающего капиляроукрепляющими и радиопротекторными свойствами, до 2 т биофлавоноидов (БФ) с антиоксидантными свойствами и 100-200 кг антоцианового красителя при норме высева семян 3,5 млн. шт.
Масштабы ежегодного образования сельскохозяйственных отходов в Орловской области РФ характеризуются величиной более 1,5 млн. тонн, из них пожнивные остатки гречишной соломы составляют 18 тыс. т, из которых можно произвести ценнейшие компоненты для изготовления средств защиты растений ( 2 т); 20 тыс. т белково-углеводных кормовых добавок для животноводства с содержанием белка 58-60%; 10 тыс. т биоудобрений с содержанием макроэлементов К, Са, Mg и микроэлементов Вг, Ва,Со и прочих полезных продуктов [191].
Сырье гречихи является ценным для получения функциональных напитков (ФН)- чая, молочных напитков, настоев. Функциональность определяется наличием рутина (витамин Р), который в медицине применяют для профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний, гипертонии, сахарного диабета, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, ревматизма, злокачественных образований, заболеваний печени и желчного пузыря. Рутин уменьшает отмирание тканей при обморожении, усиливает защитные свойства организма людей, работающих с рентгеновскими лучами и радиоактивными веществами. Особого внимания заслуживают и проантоцианидины, содержащиеся в экстрактах в меньших количествах, но которые по антиоксидантным свойствам мощнее рутина и кверцетина в 20 раз. Это проантоцианидин В2, В5 и их галаты [90].
Технология приготовления ФН включает несколько стадий, определяющей является экстракция. Проблемой является то, что многие полифенолы трудно растворимы в воде, а также находятся в гликозильной форме и при нагревании гидролизуются [20].
Эффективность экстракции оценивали по количеству выделенных флавоноидов. Содержание флавоноидов в экстрактах определяли методом дифференциальной спектрофотометрии [127]. Определение основано на способности флавоноидов образовывать окрашенный комплекс, со спиртовым раствором хлорида алюминия, который дает основной максимум поглощения для листьев гречихи – 405 нм, и для стандартных образцов ГСО рутина – 405 нм (рисунок 9), в то время как ГСО кверцетина 430 нм [127, 231]. Спектры поглощения исследуемых экстрактов имеют близкие максимумы поглощения к спектру комплекса рутина с алюминием, поэтому этот флавоноид (рутин) выбран нами в качестве стандартного образца. Использование в качестве раствора сравнения испытуемого экстракта без комплексообразователя позволяет исключить влияние окрашенных и других сопутствующих веществ [127].
Для определения содержания исследуемых компонентов в исходных растительных объектах необходимо было определить массовую долю влаги в образцах. Это позволяет оценить содержания флавоноидов в пересчете на сухую массу сырья. Массовая доля влаги в образцах растительного сырья с среднем составила11,81±0,67%. В таблице 6 представлены лучшие результаты, полученные при варьировании параметров экстракции флавоноидов из листьев гречихи посевной разными экстрагентами.
Исследуемый параметр Массовая доляфлавоноидов всырье, мг/г с.в. впересчете нарутин Исследуемый параметр Массовая доляфлавоноидов всырье, мг/г с.в.впересчете нарутин
Наиболее полное выделение целевых веществ из исходного сырья достигается при экстракции 40%–ым раствором этанола. Флавоноиды из листьев гречихи извлекаются практически в равных количествах, как 40 % так и 60 %–ым раствором этанола. Максимальное извлечение флавоноидов из сырья достигается двукратной экстракцией на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 90 минут (дальнейшее увеличение времени экстракции до 240 минут и соотношение сырье:экстрагент 1:30 не приводило к увеличению выхода флавоноидов [127]. Оптимальное соотношение 1:15 приводит к максимальному выходу флавоноидов. Выход флавоноидов составляет 94,4%.
Проведенные исследования позволили определить лучшие параметры выделения БАВ с достижением экстрактивных веществ в экстрактах до 25%. Экстракционный фактор 1,2. Плотность диффузионного потока 0,9 кг/м2с. Соотношение сырья и растворителя 1:15. Критерий Био (количественная мера интенсивности) 6,9. Диффузионный критерий Фурье 2,45.
Для обоснования научного подхода к созданию функциональных продуктов, был определен выход сухих веществ в исследуемых экстрактах.
В таблице 7 представлены результаты влияния физических факторов на содержания сухих веществ в экстрактах листьев гречихи.
Таким образом, применение СВЧ в течение 5мин ускоряет степень извлечения БАВ и увеличивает выход на 6,7% и тоже время применение СВЧ в течение 10мин замедляет степень извлечения БАВ и уменьшает выход на 3,3%. Это связано с разрушающим действием микроволновых волн на компоненты листьев гречихи.
Исследование влияния способов термической обработки и ферментативного гидролиза на компоненты химического состава соломы гречихи
Снижение количества грубой клетчатки - отхода от производства флавоноидов из соломы гречихи можно осуществлять путем термохимического и ферментативного гидролиза до простых водорастворимых сахаров (по выходу редуцирующих веществ), которые затем легко подвергаются ферментации микроорганизмами с образованием одноклеточного белка и многих других ценных продуктов [191]. При ферментативном гидролизе растворимые вещества появляются в результате гидролиза некрахмальных полисахаридов клеточных стенок растительного сырья [191]. Целлюлоза является главной составной частью любого растительного материала, и синтез целлюлозы по своим масштабам превосходит синтез всех других природных соединений. Сохраняющиеся в почве и возвращающиеся в нее растительные остатки на 40-70% состоят из целлюлозы. Целлюлоза состоит из цепочек D-глюкозы, соединенных -(14) гликозидными связями и собранных в плотную упаковку с кристаллической структурой. Цепи поперечно сшиты водородными связями, что обусловливает высокую механическая прочность и стабильность целлюлозных фибрилл. По данным рентгеноструктурного анализа, участки, имеющие кристаллическое строение, чередуются в целлюлозе с аморфными (некристаллическими) участками. Целлюлозные волокна представляют собой пучки фибрилл, одетые общей оболочкой, которая содержит воск и пектин.
Микроорганизмы, содержащие набор специфических ферментов – целлюлаз, способны расщеплять аморфную и кристаллическую целлюлозу до глюкозы.
Ферментативная деструкция целлюлозы происходит обычно под действием нескольких ферментов, собранных в настоящие полиферментные комплексы, состоящие из экзо- и эндоферментов. Их совместное функционирование позволяет с максимальной эффективностью превращать целлюлозу в мономерные единицы, которые затем служат строительными блоками для создания новых химических веществ, необходимых для жизнедеятельности микроорганизмов.
Целлюлолитические ферменты, или целлюлазы относятся к классу О-гликозид-гидролаз, катализирующих гидролиз О-гликозидной связи, и являются одними из самых распространенных ферментов в природе – они встречаются в организмах животных, высших и низших растениях, бактериях, грибах. У некоторых микроорганизмов целлюлазы входят в состав целлюлосомы – белкового комплекса, находящегося на поверхности клеточной стенки.
По месту атаки и способу воздействия целлюлолитические ферменты делятся на четыре группы. В первую группу входят эндоферменты, в частности, эндоглюканаза, которая одновременно гидролизует различные -1,4-связи между соседними остатками глюкозы в неплотно упакованных областях целлюлозы, образуя разрывы в середине цепи. Это приводит к образованию больших фрагментов со свободными концами.
Вторую и третью группы составляют экзоферменты, такие как: – экзоглюканаза, отщепляющая разорванные целлюлозные цепи с нередуцирующих концов с образованием глюкозы, целлобиозы (содержит два остатка глюкозы) и целлотриозы (содержит три остатка глюкозы); – целлобиогидролаза, которая частично присутствует в целлюлолитических грибах и является разновидностью экзоглюканазы, отщепляющей фрагменты из 10 и более остатков глюкозы с нередуцирующих концов молекул целлюлозы.
И, наконец, четвертую группу образуют ферменты, расщепляющие небольшие фрагменты целлюлозы до глюкозы, например, -глюкозидаза, или целлобиаза, которая катализирует превращение целлобиозы и целлотриозы в глюкозу. Первыми в процесс деградации целлюлозы вовлекаются эндоглюканазы, поскольку молекула природной целлюлозы состоит из нескольких тысяч мономерных глюкозных единиц и количество концевых глюкозных остатков для действия экзоферментов в исходном полимере мало. При этом каждая удавшаяся атака эндоглюканазы приводит к разрыву полимерной цепи и образованию двух новых концов в укороченной молекуле целлюлозы, которые в свою очередь могут атаковываться экзоферментами. Иначе говоря, роль экзоферментов и скорость их действия прогрессивно возрастают по мере деградации целлюлозы эндоферментами. Наконец, целлобиоза и целлотриоза расщепляются под действием последнего фермента комплекса - -глюкозидазы с образованием двух и трех молекул глюкозы, соответственно.
Итак, для того, чтобы в реакционной смеси появился конечный продукт – глюкоза, реакция должна пройти через несколько этапов или стадий, включающих частичную деградацию исходного субстрата - целлюлозы.
Для получения ферментолизата были использованы ферментные препараты: Пектофоедин П 10 Х (реахим) – высушенный и очищенный экстракт поверхностной культуры микромицета Aspergillus foetidus, стандартизированный по пектолитической активности и содержащий пектинэстеразу, экзополигалактуроназу, эндополигалактуроназу, гемицеллюлазу, протеиназу, другие ферменты и ЦеллоЛюкс-F (ООО ПО «Сиббиофарм) – высушенный фильтрат культуральной жидкости гриба Trichoderma viride с наличием целлюлазы, ксиланазы, -глюканазы, других ферментов.