Содержание к диссертации
Введение
1. Пути регулирования метаболизма дрожжей сахаромицетов 12
1.1. Классификация и систематика дрожжей 12
1.2. Сравнение морфологических и физиологических свойств дрожжей 15
1.3. Метаболизм углеводов дрожжами вида Saccharomyces cerevisiae
1.5.1. Эффект Пастера 21
1.5.2. Эффект Кребтри 22
1.5.3. Побочные продукты брожения 23
1.6.Основные стрессовые факторы 26
1.6.1.Этанольный стресс 26
1.6.2.Осмотическое давление среды 27
1.6.3.Влияние кислорода 29
1.7. Процессы культивирования микроорганизмов 29
1.7.1. Периодическое культивирование 31
1.7.2. Полунепрерывное культивирование 35
1.7.3. Полунепрерывное культивирование 36
1.7.4. Многоциклическое культивирование 37
1.7.5. Непрерывное культивирование 37
1.7.6. Схемы культивирования чистой культуры дрожжей на лабораторной стадии 38
1.7.7.Схемы культивирования чистой культуры пекарских дрожжей на производственной стадии 41
1.7.8.Схемы культивирования чистой культуры пивных дрожжей на производственной стадии 41
1.7.9.Схемы культивирования чистой культуры спиртовых дрожжей на производственной стадии 42
2. Материалы, объекты и оборудование 42
2.1. Материалы 42
2.2. Объекты 45
2.3. Методы исследования
2.3.1. Методы микроскопического анализа дрожжей 46
2.3.2. Способы стерилизации сусла, 47
инструментов и лабораторной посуды 47
2.3.3. Определение физиологической активности дрожжей 47
по методу Давыденко С.Г. 47
2.3.4. Определение бродильной активности 48
2.3.5. Определение мутности пива на нефелометре 48
2.3.6. Определение стойкости пива методом ускоренного состаривания
2.3.7. Определение вицинальных дикетонов в пиве 48
2.3.8. Определение концентрации эфиров и ацетальдегида в пиве 49
2.3.9. Определение содержания сахаридов в мальтозном сиропе 50
и солодовом сусле 50
2.3.10. Определение физико-химических показателей пива 50
2.3.11. Определение осмоляльности 51
2.3.12. Определение константы скорости деления 51
2.3.13. Определение длительности лаг фазы 51
3. Результаты и обсуждения 52
3.1. Регулирование эффекта Пастера в стационарной культуре при различной степени аэрации 52
3.1.1. Влияние площади контакта фаз 54
3.1.2. Влияние условий культивирования на интенсивность размножения клеток 57
3.1.3. Обсуждение результатов. Влияние различной степени аэрации на размножение дрожжей 63
3.2. Влияние величины засева на интенсивность размножения дрожжей 64
4. Влияние природы углевода и его концентрации на метаболизм дрожжей Saccharomyces cerevisiae 66
4.1. Влияние сахарозы на интенсивность размножения дрожжей Saccharomyces cerevisiae 69
4.1.1. Пивные дрожжи 69
4.1.2. Пекарские (штамм ЛВ7) и спиртовые (Ethanol Red) дрожжи 71
4.1.3. Обсуждение результатов. Влияние сахарозы на метаболическую активность пивных, спиртовых и пекарских дрожжей 74
4.2. Влияние мальтозы на интенсивность размножения дрожжей Saccharomyces cerevisiae 80
4.2.1. Гетерогенные условия культивирования 80
4.2.2. Стационарная культура с перемешиванием культуральной жидкости (гомогенная культура) 88
4.2.3. Периодическая культура с барботированием питательной среды 95
4.3. Влияние концентраций сахарозы и мальтозы на интенсивность образования диоксида углерода 102
5. Влияние осмоляльности среды на биосинтез вторичных метаболитов 104
5.1.Обсуждение результатов. Влияние осмоляльности среды на биосинтез вторичных метаболитов 113
6. Разработка и производственные испытания технологии ЧКД на заводах малой производительности 116
6.1. Разработка ЧКД для минипивоваренного завода 116
6.1.1. Влияние технологии ЧКД на размножение дрожжей и качество пива 117
6.1.2. Исследование физиологической активности семенных дрожжей 119
6.1.3. Влияние технологии ЧКД на качество пива 120
6.1.4. Технология ЧКД с учетом установленных закономерностей 121
6.2. Разработка чистой культуры хлебопекарных дрожжей при
производстве напитка «Мёд Хмельной» на заводе малой
производительности «МЕДОВАРУС» 122
7. Заключение 126
8. Список литературы 128
- Метаболизм углеводов дрожжами вида Saccharomyces cerevisiae
- Методы микроскопического анализа дрожжей
- Влияние условий культивирования на интенсивность размножения клеток
- Обсуждение результатов. Влияние сахарозы на метаболическую активность пивных, спиртовых и пекарских дрожжей
Введение к работе
Актуальность работы. В связи с развитием малого предпринимательства в России широкое распространение получили мини-производства, специализирующиеся на выпуске популярных напитков – пива, кваса, спирта, медовых и других напитков брожения.
В настоящее время на данных производствах в качестве посевного материала, как правило, используют сухие дрожжи, которые производят во Франции, Канаде, США и ряде других стран.
В то же время, в коллекциях ряда институтов России хранится значительное количество различных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, которые обладают всеми необходимыми производственно ценными свойствами для бродильной промышленности. Использование этих штаммов дрожжей позволило бы существенно расширить ассортимент напитков брожения, выпускаемых малыми предприятиями.
Однако, для использования этих культур на предприятиях небольшой мощности необходима простая и, вместе с тем, эффективная технология производства чистой культуры дрожжей (ЧКД), начинающаяся с пробирочной культуры. Данная технология должна обеспечить максимально быстрое и эффективное накопление необходимого количества засевных дрожжей, отличающихся высокой физиологической активностью и не содержащих посторонних микроорганизмов. Наличие такой технологии позволит сократить производственные затраты, расширить диапазон выпускаемых напитков брожения, а также повысить их качественные характеристики.
Цель и задачи исследования. Целью работы является научное обоснование и разработка технологии получение чистой культуры дрожжей Saccharomyсes cerevsiae для малых предприятий, выпускающих напитки брожения.
В соответствии с поставленной целью решали следующие задачи:
изучить влияние диффузии кислорода воздуха в питательную среду на размножение дрожжей в простой периодической культуре;
исследовать влияние величины засева дрожжей на интенсивность их размножения и физиологическое состояние клеток ЧКД при различных условиях культивирования;
изучить влияние природы и концентрации сбраживаемых углеводов на осмоляльность питательной среды и на проявление Эффекта Кребтри при культивировании хлебопекарных, пивных и спиртовых дрожжей;
изучить влияние осмоляльности питательной среды, обусловленной концентрацией мальтозы, на синтез вторичных метаболитов брожения штаммами дрожжей, использующимися в различных бродильных производствах;
на основании экспериментальных данных, полученных при изучении влияния различных факторов на биотехнологические процессы, протекающие при культивировании дрожжей, используемых в различных
бродильных производствах, разработать типовую технологию чистой культуры дрожжей для предприятий малой мощности. Научная новизна:
установлена зависимость между конечной концентрацией дрожжей в простой периодической культуре и площадью диффузии кислорода воздуха в культуральную жидкость при различных условиях культивирования дрожжей;
изучено влияние величины засева на размножение чистой культуры дрожжей и физиологическую активность клеток;
установлено влияние осмоляльности питательной среды при различных условиях культивирования клеток и концентрациях сбраживаемых углеводов (сахарозы и мальтозы) на размножение дрожжей Saccharomyces cerevisiae;
изучено влияние концентрации углеводов в питательной среде на синтез вторичных метаболитов для штаммов хлебопекарных, пивных и спиртовых дрожжей;
Практическая значимость. На основании полученных закономерностей обоснованы режимы культивирования дрожжей на всех стадиях накопления биомассы чистой культуры.
Разработана технология ЧКД пекарских и пивных дрожжей для заводов производительностью 1м3 напитков брожения в сутки. Доказана зависимость качественных показателей целевых продуктов брожения от технологии выращивания засевных дрожжей.
Проведены производственные испытания технологии чистой культуры пивных дрожжей на минипивзаводе ООО «Ситик» и пекарских дрожжей при выпуске напитка «Мед хмельной» на ООО «МЕДОВАРУС».
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы
представлены на II и III конгрессе молодых ученых (СПб, НИУ ИТМО
ИХиБТ, 2013, 2014), а так же на XLII и XLIII научных и учебно-
методических конференциях НИУ ИТМО, на международной научной
конференции и школе молодых ученых «Физиология растений –
теоретическая основа инновационных агро- и фитобиотехнологий»
(Калининград, 2014)
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Основные положения, выносимые на защиту:
регулирование эффекта Пастера при культивировании дрожжей в простой (гомогенной и гетерогенной) периодической культуре;
регулирование эффекта Кребтри при выращивании дрожжей на различных углеводных субстратах;
влияние осмоляльности питательной среды на длительность лаг-фазы и при различной степени диффузии кислорода воздуха в культуральную жидкость;
влияние величины засева на физиологическую активность ЧКД в условиях гомогенной и гетерогенной культуры;
-влияние концентрации мальтозы на синтез вторичных метаболитов брожения.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 6 глав, заключения, списка литературы, включающего 130 источников, из них 45 – иностранных и 13 приложений. Диссертация содержит 140 страниц машинописного текста, 49 иллюстраций и 55 таблиц.
Метаболизм углеводов дрожжами вида Saccharomyces cerevisiae
Дрожжи выделяют так же при брожении альдегиды и кетоны: ацетоин и диацетил. Важнейшим альдегидом является ацетальдегид, который образуется в первые дни брожения, затем его содержание идет на спад.
В процессе метаболизма дрожжей образуются предшественники вицинальных дикетонов, одним из которых является диацетил или 2,3 бутандион. Диацетил отмечают как один важнейших факторов образования букета зеленого пива. Диацетил и пентандион называют виценальными дикетонами, их формирование в пиве проходит в три этапа: в ходе первого образуются их предшественники, на втором превращение предшественников, и на последнем восстановление дикетонов, т.е. диацетил ацетоинбутандиол. На скорость образования предшественников вицинальных дикетонов - -цетогидрокислот – влияют физико-химические условия питательной среды, а так же штаммовые особенности дрожжей. Он тесно связан с азотным обменом клеток и в частности с метаболизмом аминокислот. От физиологического состояния дрожжей зависит как биосинтез ацетогидроксикислот, так и редукция дикетонов [49, 39,100].
Сульфосоединения.
В ходе брожения, при метаболизме дрожжей возникают летучие сернистые соединения. Одним из наиболее хорошо изученных суфосоединений, является диметилсульфид (ДМС). Уровень ДМС определяется содержанием в солоде предшественников ДМС и технологическими параметрами ведения процесса кипячения сусла с хмелем (давление/температура). Так же из сульфосоединений выделяют сероводород и меркаптаны. Сероводород тесно связан с жизнедеятельностью дрожжей и образуется в процессе брожения [49,36,100]. Образование глицерина.
Глицерин является побочным продуктом брожения. Известно, что при спиртовом брожении проходит ещё и глицерино- пировиноградное брожение, и, как следствие, образование глицерина внутри дрожжевой клетки. В период лаг-фазы возрастает синтез глицерол-3-фосфатдегидрогеназы, что приводит к увеличению внутриклеточной концентрации глицерина. В обычных условиях культивирования, глицерин проникает через цитоплазматическую мембрану дрожжевой клетки, но при гиперосмотическом стрессе поры, через которые он выходит, закрываются и глицерин не выделяется в питательную среду. Образование глицерина хорошо изучено на примере метаболизма винных дрожжей. В ходе экспериментов установлено, что при сбраживании виноградного сусла 92 % молекул сахаридов идет на спиртовое брожение и 8 % молекул на глицерино- пировиноградное брожение [60, 101]. Синтез глицерина увеличивается при культивировании дрожжей в средах с повышенным осмотическим давлением, что особенно важно при использовании высокоплотного пивоварения. При таком такой технологии лучше использовать дрожжи, синтезирующие меньше глицерина, так как при этом образуется меньше побочных продуктов брожения, которые не искажают сенсорный профиль пива. Присутствуют в качестве побочных продуктов брожения летучие жирные кислоты: уксусная, пропионовая, масляная и изомасляная.
Условия культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae существенным образом влияют на метаболизм клеток. Адаптация дрожжей вида Saccharomyces сerevisiae к стрессовым факторам тщательно изучается в последние годы [101, 92, 93, 94, 95, 87, 128, 18, 77, 86, 97, 105, 106,108]. Часто дрожжевые клетки используются, как модельные системы, для изучения стрессовых реакций лежащие в основе стрессоустойчивости эукариотических клеток [95, 99, 119]. Повышенное содержание сухих веществ и низкая температура затрудняют проникновение питательных веществ через клеточную стенку в дрожжевую клетку, тем самым снижая её термоустойчивость и осмоустойчивость.
Основным внеклеточным метаболитом дрожжей вида Saccharomyces cerevisiae как при аэробном, так и анаэробном брожении является этанол. Как известно, этиловый спирт оказывает токсическое действие на дрожжи, на эту тему проведено большое количество исследований [97, 98, 86, 91, 92, 94, 105, 32,108]. Его токсическое действие связано с увеличением проницаемости клеточных мембран, изменяется транспорт питательных веществ. Если концентрация этилового спирта составляет выше 1,2%, это приводит к снижению удельной скорости [121,122] роста, концентрация 3 – 4% замедляет процесс почкования, что ведет к нарушению клеточного цикла [106,98] изменению физиологической активности [87,125] и, следовательно, к уменьшению выхода биомассы. Стойкость дрожжей к этанолу зависит от состава питательной среды [88,97,122], генетической предрасположенностью [116, 94, 16, 90,62,113], а так же при селекции [1].
Как показывают исследования, дрожжи разных видов проявляют не одинаковую устойчивость к спирту. Так разные штаммы Saccharomyces cerevisiae , применяемые в спиртовой промышленности, могут развиваться при концентрации этанола от 7-13% [61,25, 32], а отдельные штаммы спиртовых дрожжей Saccharomyces cerevisiae устойчивы к содержанию спирта до 17-18% [62], пивные дрожжи обладают средней спиртоустойчивостью и применяются в субстратах с концентрацией этанола 6-8%. Винные дрожжи выдерживают концентрации этилового спирта 10-15%. При производстве Токайских вин и саке (рисовое вино) используют дрожжи выдерживающие концентрации этанола 20%. При высоком содержании спирта в субстрате происходит увеличение проницаемости и пористости клеточной мембраны дрожжевой клетки [50,59], что может привести к нарушению нормального метаболизма, нарушению почкования, остановке ассимиляции азотистых веществ, а дальнейшим и гибели клетки. Кроме самого этанола, токсичное действие на дрожжевые клетки могут оказывать промежуточные и вторичные метаболиты [45,110].
Методы микроскопического анализа дрожжей
При непрерывном перемешивании и в режиме периодического перемешивания максимальная константа скорости деления клеток приходится в период с 10-16 час, когда культура находится в логарифмической стадии роста, которая характеризуется максимальной скоростью размножения, тогда как стационарно этот показатель 8-10часов рисунок 3.4. При непрерывном перемешивании, имеет место быть эффект Пастера.
После 16 часа культивирования константа скорости деления клеток во всех режимах снижается в течение культивирования. По результатам можно сделать предварительный вывод о том, что перевод дрожжевого инокулята в следующую лабораторную стадию нужно осуществлять в период с 16 по 20час культивирования. Рисунок 3.4 – Константа скорости деления клеток при различной степени интенсивности диффузии
В процессе выращивания чистой культуры важно не только накопить достаточное количество биомассы, но и нужно, чтобы эта биомасса содержала большое количество активных клеток. После лабораторной стадии, дрожжи попадают в цех чистой культуры, где предусматривается дальнейшее накопление биомассы дрожжей, затем на брожение, где процесс сбраживания солодового сусла протекает за счет биохимической активности дрожжей и влияет на динамику процесса брожения что, в конечном счете, может повлиять на качество готового продукта.
Состояние культуры при различной степени интенсивности диффузии оценили при помощи прижизненного окрашивания клеток для выявления активных, мертвых клеток, а так же применяли микрокопирование в видимом свете для подсчёта почкующихся клеток. В течении культивирования измеряли концентрацию этилового спирта, рН, FAN. Пробы отбирали на 15, 22 и 26 час культивирования. Концентрация свободных аминокислот (FAN) в среде составляла 230 мг/л, начальное рН сусла 5,4.
Одним из достоверных методов, с помощью которого можно оценить физиологическое состояние дрожжей, является метод прижизненного окрашивания дрожжевых клеток метиленовым синим и сафранином [14] ход окрашивания описан в приложении 1.
Фотографии культуры были сделаны на 15 час культивирования рисунок 3.5, при ближайшем рассмотрении можно заметить, что окрашенные клетки при непрерывном перемешивании приобрели более красноватый оттенок, чем клетки, которые культивировали при периодическом перемешивании. Важно отметить то, что с увеличением длительности
Физиологическое состояние дрожжей 15 час культивирования а) периодическое перемешивание, б) постоянное перемешивание культивирования с 15 до 22 часов количество физиологически активных клеток уменьшается, а доля ослабленных и мертвых возрастает в обоих случаях рисунок 3.6. На 22 час культивирования, в образце с непрерывным перемешиваним доля ослабленных клеток составила 17%, а при периодическом – 27%. Рисунок 3.6 - Изменение физиологического состояния культуры в процессе культивирования с различной аэрацией
Старые клетки, имеют большое количество дочерних рубцов, а ослабленные клетки имеют низкую жизнеспособность, следовательно, далее на стадии брожения в производстве это может привести к замедленному брожению и к снижению качества готового напитка. И наоборот большое количество молодых и физиологически активных клеток за счет интенсивной диффузии позволит ускорить процесс брожения.
На физиологическое состояние оказывает влияние и физико-химические условия питательной среды, известно, что концентрация этанола в среде более 1,2 % приводит к уменьшению выхода биомассы [121, 122].
Содержание спирта в среде на 15 час культивирования было примерно одинаковое и равнялось 0,75 и 0,95% . Не смотря на низкий уровень спирта в среде в обоих случаях, зафиксировано разное физиологическое состояние дрожжей. Это свидетельствует о том, что на состояние культуры влияет не только концентрация спирта, но и количество спирта, приходящегося на единицу биомассы. В первом случае эта величина составляла 0,15, во втором - 0,35 г этанола/млн клеток. Содержание спирта в среде на 24 час культивирования составляет 4,3 и 4,7 % рисунок 3.7.
Содержание FAN при непрерывном перемешивании резко снижается с 157 до 33, 5 мг/л, в это время происходит активное потребление FAN. Считается, что остаточное содержание FAN должно быть 20-40 мг/л, что свидетельствует о том, что клетки полностью утилизировали -аминный азот из сусла [ 2, 50,51]. После 15 часа культивирования, как в первом, так и во втором случае условия выращивания становятся менее благоприятными: уменьшается рН, FAN, экстрактивность ниже 7, происходит накопление спирта. Оптимальной величиной рН для размножения клеток дрожжей является 4,8, так как при этом значении рН фермент транспорта мальтозы в клетку – мальтозопермеазы – имеет максимальную активность.
Как видно из опытов, интенсивная диффузия, т.е. непрерывное перемешивание культуральной жидкости влияет на размножение дрожжей, за счёт того, что дрожжевые клетки в питательной среде находятся во взвешенном состоянии и равномерно распределяются по всему объему среды, и, следовательно, контактируют с питательной средой всей площадью поверхности дрожжевой клетки. От эффективной площади поверхности клетки зависит массообмен клетки между кислородом, растворенным в питательной среде и между клеткой и питательными компонентами, от которого в свою очередь зависит процесс размножения и скорость роста.
Влияние условий культивирования на интенсивность размножения клеток
Как показано в литературном обзоре, разведение ЧКД сахаромицетов предполагает использование различных по углеводному составу питательных сред. Известно, что дрожжи вида Saccharomyces cerevisiae используемые в бродильных производствах, могут обладать двумя типами метаболизма и способны к перестройке обмена веществ, в связи с изменением состава питательной среды.
Так, сырьем для производства пекарских дрожжей служит как солодовое сусло (первые стадии размножения дрожжей), так свекловичная или тростниковая меласса, которая содержит 46-50% сахарозы. В технологии ЧК пивных дрожжей применяют только солодовое сусло, в состав которого главным образом входит мальтоза (более 60%). Для выращивания чистой культуры спиртовых дрожжей используют мелассу, но чаще крахмалсодержащее сырье, которое предварительно подвергается биотрансформации ферментными препаратами. В зависимости от природы продуцента продуктом гидролиза может быть сусло с разным соотношением между сбраживаемыми углеводами, в состав которых также входит мальтоза. Таким образом, в качестве основного источника углеводного питания при культивировании дрожжей является сахароза, мальтоза и глюкоза. Эти углеводы утилизируются клетками по-разному. Так в метаболизме мальтозы клетка задействует как адаптивный фермент мальтозопермеазу, которая переносит молекулу мальтозы в клетку, так и конститутивный фермент – глюкозидазу, которая гидролизует мальтозу до двух молекул глюкозы, вступающей в последствие в энергетический и конструктивный обмен клеток [6].
При метаболизме сахарозы участвует конститутивный фермент -фруткофуранозидаза, которая расщепляет сахарозу на -глюкозу и -фруктозу, после чего оба углевода вступают в реакцию гликолиза.
Активный транспорт глюкозы осуществляют конститутивные ферменты-пермеазы [6,11]. Таким образом, в виду разного механизма переноса углеводов в клетки скорость их утилизации будет неодинаковой, следовательно, и влияние концентрации сахаридов на размножение дрожжей будет также различаться.
Кроме того, исследования Устиновой [74] , а так же исследования которые были сделаны в ходе работы, показали различные значения осмоляльности растворов рисунок 3.9.
В связи с тем, что метаболизм мальтозы и сахарозы отличается по механизму их транспорта в клетки, представляется важным с точки зрения разработки технологии ЧК дрожжей исследовать влияние, как природы углеводов, так и их концентрации на основные параметры роста. Кроме того эти исследования важны для дальнейшего расширения знаний по регулированию эффекта Кребтри, который является наряду с ПЭ, основным регуляторным механизмом жизнедеятельности дрожжей. Рисунок 3.9 – Осмоляльность углеводов Получены уравнения, описывающие зависимость осмоляльности субстрата от концентрации в нем сбраживаемых углеводов: глюкозы ОС = 64,5 Сг + 23,4; сахарозы ОС = 35,2 Сс - 1,6; мальтозы ОС = 33 См - 24,4.
Кроме того в связи с расширением применения в бродильных производствах плотных и сверхплотных питательных сред следует выяснить роль осмоляльности субстрата, связанной с концентрацией и природой углеводов, на биосинтез некоторых вторичных метаболитов, определяющих как органолептические свойства продукта, так и его безопасность [70,71,72,73].
Для моделирования процессов использовали питательные среды с различным углеводным составом: солодовое сусло с добавлением мальтозы, мелассное сусло с добавлением сахарозы. Физико-химический состав мелассы и солодового сусла, из которых были приготовлены рабочие растворы для культивирования, представлены в разделе 2.1. В состав питательных сред вносили компоненты, недостающие для жизнедеятельности дрожжей. В связи с тем, что доля глюкозы и мальтотриозы в промышленных средах при культивировании пивных дрожжей очень низкая, а при культивировании хлебопекарных дрожжей эти углеводы отсутствуют вообще, исследовали влияние концентраций мальтозы и сахарозы на выход биомассы.
В ходе работы применяли различные способы культивирования: стационарное (гетерогенная простая периодическая культура), гомогенное культивирование предусматривающее перемешивание на лабораторном шейкере, культивирование барботированием стерильным воздухом на пилотной установке по культивированию дрожжей рисунок в приложении 10.
Для исследования влияния сахарозы на метаболизм дрожжей базовой средой была выбрана меласса. Концентрацию сахарозы варьировали путем внесения в среду сахарозы. С учетом сахарозы, содержащейся в мелассе, готовили питательные среды с содержанием этого дисахарида 9,12,16 и 20 % (содержание сухих веществ составляло 13, 16, 20 и 24 % соответственно). Осмоляльность среды соответственно равнялось 388, 758, 1742 и 2326 ммоль/кг. Далее среду разливали по 100 мл в стеклянные конические колбы вместимостью 250мл. Питательные растворы стерилизовали при 1 атм.(120С) в течение 30 мин. Дрожжи выращивали в стационарных условиях при температуре 25±1С. Площадь контакта фаз соответствовала 28,26 см2. Начальная концентрация клеток во всех вариантах составляла 1,5106 ± 0,2 кл./мл. Через каждые 4 часа производили отбор культуральной жидкости и проводили подсчёт клеток в камере Горяева.
Обсуждение результатов. Влияние сахарозы на метаболическую активность пивных, спиртовых и пекарских дрожжей
Синтез эфиров зависит от интенсивности биосинтеза высших спиртов и органических кислот [7,63,49].
Увеличение осмоляльности среды не зависимо от используемого штамма приводит к увеличению содержания этилацетата и изоамилацетата, и только у пекарских дрожжей наблюдается возрастание этилкапроната рисунок 5.3. Количество этилацетата возрастает при использовании хлебопекарных дрожжей в 1,6, у пивных в 1,3 и спиртовых в 1,2 раза. Отмечено, что максимальная концентрация этилацетата достигается при сбраживании среды спиртовыми дрожжами и приближается к порогу ощущения (25-30 мг/л). Концентрация изоамилацетата во всех вариантах превышала порог ощущения (1,4 мг/л), особенно при использовании пекарских и спиртовых дрожжей.
Следует отметить, что, не смотря на различия в концентрации исследуемых эфиров, в культуральной жидкости разных штаммов дрожжей продуктивность эфиров, за исключением этилкапроната (0,06 для пивных против 0,47 и 0,62 для пекарских и спиртовых соответсвенно), мало зависит от штаммовой принадлежности таблица 5.4.
Диацетил образуется вне клетки из ацетолактата- вторичного метаболита дрожжей [20]. Его концентрация зависит как от метаболизма валина, так и от концентрации кислорода в среде и физиологического состояния дрожжей, в первую очередь от активности редуцирующих ферментов находящихся в клеточной стенке живых микроорганизмов.
В ходе исследования установлено, что с повышением
осмоляльности питательной среды с 670 до 1116 ммоль/кг концентрация диацетила в культуральной жидкости возрастает более чем 2 раза у всех исследуемых штаммов рисунок 5.4. Продуктивность биосинтеа диацетила спиртовыми и пекарскими дрожжами практически одинакова таблица 5.5. и составляет 300% от биосинтеза диацетила пивными дрожжами. Можно распределить штаммы по синтезу диацетила:
При метаболизме дрожжей возникают летучие сернистые соединения такие как сероводород, меркаптаны и диметилсульфид. Одним из наиболее важных с точки зрения влияния на сенсорный профиль напитков является диметилсульфид (ДМС), образование которого связано с метаболизмом серосодержащих соединений. Дрожжи образуют ДМС из диметилсульфоксида при участии фермента метионинсульфоксидредуктазы, активность которого контролируется геном MXR1 [120].
В результате анализа установлено, что уровень ДМС повышается с увеличением осмоляльности питательной среды почти в 2-3 раза рисунок 5.5, но не достигает порога ощущения (50 мкг/л) Больше всего ДМС синтезируют хлебопекарные дрожжи таблица 5.5.
В результате исследований по влиянию осмоляльности среды на биосинтез вторичных метаболитов установлено: - существенные отличия между штаммами дрожжей по бродильной активности и биосинтезу вторичных метаболитов при культивировании дрожжей на субстрате с разным содержанием мальтозы; -средняя скорость образования диоксида углерода в расчете на 1 млн жизнеспособных клеток за весь процесс культивирования минимальна у спиртовых дрожжей таблица 5.6; -биосинтез СО2 протекает наиболее интенсивно у пивных дрожжей, которые более чувствительны к осмотическому давлению.
Как следует из таблицы 5.7. наиболее существенные различия между штаммами дрожжей наблюдаются в синтезе высших спиртов, метаболизм которых связан с превращением аминокислот в клетках. Установлено, что продуктивность пекарских дрожжей по биосинтезу пропанола, изобутанола и амилового спирта значительно увеличивается с повышением концентрации в субстрате мальтозы. Кроме того значение этого показателя в 1,5-2,5 раза выше, чем у пивных и спиртовых дрожжей. Что касается ацетальдегида, то его больше всего образуется у пивных и спиртовых дрожжей.
Биосинтез эфиров более выражен у пекарских и особенно спиртовых дрожжей таблица 5.7. Это связано с тем, что скорость роста клеток этих штаммов выше, а, следовательно, больше образуется АТФ, которая может быть задействована в синтезе эфиров [49].
В литературе представлено большое количество разнообразных режимов и технологических схем культивирования ЧКД, при этом не приведено научное обоснования выбора той или иной технологии. Так, например, количество лабораторных стадий варьируется от 2 до 6, а производственных стадий от 1 до 3. Между тем, увеличение количества стадий влияет не только на экономические показатели процесса культивирования дрожжей, в первую очередь расход электроэнергии и затраты труда, но и на физиологическую активность самого посевного материала. Снижение бродильной и репродуктивной активности дрожжей при увеличении количества стадий их размножения обусловлено увеличением количества генераций клеток, увеличением дочерних рубцов на их поверхности и, как следствие, снижением активной площади поверхности клеточной стенки, через которую происходит поступление в клетку питательных веществ и выведение из неё продуктов метаболизма.
В ряде литературных источников [35,23,68] рассматривается влияние качества посевного материала на показатели сбраживание пива (скорость снижения сухих веществ), а также влияния физиологического состояния дрожжей на коллоидную стойкость [46,109]. Однако в работах не рассматриваются такие вопросы, как взаимосвязь технологии культивирования дрожжей, качества посевного материала – ЧКД, сенсорного профиля пива и его мутности.