Тепловая денатурация различных изоформ тропомиозина в отсутствие и в присутствии F-актина Кремнева Елена Валериевна

Содержание к диссертации

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5

Введение 6

Обзор литературы 9

1. Структура мышцы и основы мышечного сокращения. 9

2. Миозин. 11

3. Актин. 16 4). Молекулярный механизм подвижности. 19

5) Регуляция мышечного сокращения. 21

1. Миозиновый тип регуляции. 22

2. Актиновый тип регуляции. 24

6) Регуляторные белки тонкого филамента. 26

6.1. Тропомиозин. 26
6.1.1. Сходство и различие тропомиозинов из скелетных, сердечных

и гладких мышц. 3 1

6.1.2 Немышечные тропомиозины. 34

6.1.3. Миопатии, связанные с мутациями в тропомиозине. 35

6.2. Тропонин. 37

3. Тропонин С 37

4. Тропонин I 38

5. Тропонин Т 40

7) Применение метода дифференциальной сканирующей калориметрии для
структурных исследований мышечных белков. 43

6. Миозин. 43

7. Актин 46

8. Тропомиозин. 48

7.4. Тропонин. 50

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 52

Материалы и методы исследования. 52

1) Получение препаратов белков 52

1.1. Получение субфрагмента 1 миозина из скелетных мышц кролика. 52

Получение миозина. 52

Разглицеринизация миозина. 53

Получение субфрагмента 1 миозина (S1) 53

1.2. Выделение актина из скелетных мышц кролика. 54

Получение ацетонового порошка 54

Выделение актина из ацетонового порошка 54

3. Приготовление препарата гладкомышечного тропомиозина 55

4. Приготовление препаратов скелетного тропомиозина и

скелетного тропонина 55

5. Стабилизация F-актина фторидом алюминия 56

6. Экспрессия и очистка рекомбинантных ТМ. 56

7. Получение окисленных и восстановленных препаратов ТМ. 57

2) Используемые методы исследования 58

1. Определение АТРазной активности миозина 58

2. Градиентный электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии SDS 58

3. Исследования термодинамических характеристик белков методом дифференциальной сканирующей калориметрии. 59

Стандартный метод измерения. 59
Модифицированный метод измерения для некооперативных тепловых

переходов. 60

4. Вискозиметрический метод. 61

5. Метод кругового дихроизма. 61

6. Соосаждение ТМ с F-актином. 61

7. Исследование диссоциации комплекса ТМ с актином

методом светорассеяния. 62

Результаты и их обсуждение. 63

1) Взаимодействие скелетного тропомиозина с актином и тропонином. 63

1. Тепловая денатурация скелетного ТМ. 63

2. Взаимодействие ТМ с актином. 67

3. Регулируемый актиновый филамент. 74

2) Эффекты кардиомиопатических мутаций в тропомиозине. 83

4. Влияние FHC мутаций на тепловую денатурацию рекомбинантного ТМ. 83

5. Сродство ТМ к актину. 86

6. Тепловая денатурация мутантных форм ТМ в их комплексах с актином. 87

3. Предполагаемый механизм тепловой денатурации тропомиозина на поверхности актиновых филаментов. 94

4. Влияние структуры тропомиозина на характер его тепловой денатурации. 102

1. Влияние сегментов 2 и 3 на тепловую денатурацию дрожжевых ТМ. 103

2. Особенности тепловой денатурации немышечных ТМ. 110

3. Тепловая денатурация рекомбинантных ТМ: метод ДСК. 111

4. Исследование концевых взаимодействий: вискозиметрия. 116

5. Тепловая денатурация рекомбинантных ТМ:

метод кругового дихроизма. 116

4.2.4. Исследование методом ДСК тепловой денатурации связанного

с актином рекомбинантного ТМ. 119

5. Вызванная нагревом диссоциация комплекса ТМ-актин. 122

6. Суммарный анализ различий в тепловой денатурации

гладкомышечного и фибробластных ТМ. 123

Выводы 129

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 131

Принятые сокращения

ТМ - тропомиозин SmTm - гладкомышечный ТМ ТМ5а - фибробластный ТМ5а ТМ5Ь - фибробластный ТМ5Ь ТМ1 -дрожжевой ТМ первого типа ТМ2 - дрожжевой ТМ второго типа F-актин - фибриллярный актин

51. - субфрагмент 1 миозина

52. - субфрагмент 2 миозина

Rod - стержневая часть молекулы миозина

LMM - легкий меромиозин

НММ - тяжелый меромиозин

ЛЦ - легкие цепи

КЛЦМ - киназа легких цепей миозина

ФЛЦМ - фосфатаза легких цепей миозина

Тп - тропониновый комплекс

ТпТ - тропонин Т

Tnl - тропонин I

ТпС - тропонин С

ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия

КД - круговой дихроизм

Введение к работе

В основе биологической подвижности всего живого лежит всего несколько молекулярных механизмов. В случае эукариотических клеток наиболее распространенной считается актомиозиновая система подвижности, основанная на взаимодействии миозина и актина. Именно это взаимодействие ответственно за сокращение мышц и многие процессы клеточной подвижности.

В основе молекулярного механизма сокращения мышц лежат структурные изменения, происходящие в миозиновой головке при гидролизе АТР и при взаимодействии с актиновым филаментом. В процессе этого взаимодействия происходит превращение химической энергии гидролиза АТР в механическую энергию движения. Для регуляции этого взаимодействия в мышцах существуют специальные белковые системы. Необходимость существования системы регуляции сократительной активности объясняется тем, что мышца не могла бы выполнять свои функции, если бы она постоянно находилась в сокращенном состоянии. Регуляция взаимодействия миозиновых и актиновых филаментов в мышце осуществляется ионами Са²⁺. Иначе говоря, основная задача регуляторных систем состоит в отслеживании изменения концентрации Са²⁺ внутри клетки (с 10~⁷ до 10"⁵ М). Регуляторные белки могут располагаться либо на тонких, либо на толстых филаментах. В поперечнополосатых и сердечных мышцах основным является актиновый тип регуляции, главную роль в котором играют тропомиозин и тропонин, ассоциированные с тонким (актиновым) филаментом. В состоянии расслабления, когда концентрация свободного Са²⁺ в мышце очень мала, тропомиозин закрывает сайты связывания миозина на актиновом филаменте, стерически блокируя взаимодействие миозина с актином. Связывание Са²⁺ с тропониновым комплексом позволяет сдвинуть тропомиозин из этого положения, что делает возможным связывание миозина с актином, приводящее к генерации силы. Таким образом, тропомиозин (ТМ) играет ключевую роль в регуляции сокращения поперечнополосатых и сердечных мышц. Помимо этого, во всех типах мышц и во многих немышечных клетках эукариот ТМ связан с актином, сильно повышая кооперативность актиновых филаментов. Однако многие особенности структурного состояния ТМ на поверхности актиновых филаментов остаются до сих пор неясными. Одним из подходов, применяемых для выяснения таких особенностей, является исследование характера тепловой денатурации ТМ непосредственно на поверхности актиновых филаментов с использованием метода дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) в сочетании с другими методами [Levitsky et al, 2000].

7 Важно отметить, что до настоящего времени метод ДСК применялся исключительно для изучения мышечных изоформ ТМ, тогда как тепловая денатурация его немышечных изоформ оставалась совершенно неизученной. Неясным оставался также вопрос о том, как именно происходит тепловая денатурация ТМ на поверхности актиновых филаментов и как влияют на нее различные модификации белка. В связи с этим, целью данной работы было исследование методом ДСК в сочетании с другими методами характера тепловой денатурации разных изоформ ТМ в отсутствие и в присутствии актина, включая мышечные ТМ с мутациями в молекулах и немышечные ТМ различной длины, а также влияние на него других регуляторных белков. В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи:

Методом ДСК изучить влияние актина и тропонина на тепловую денатурацию ТМ.

Исследовать влияние кардиомиопатических мутаций (D175N и E180G) в ТМ на характер его тепловой денатурации в отсутствие и в присутствии F-актина.

Используя дрожжевые ТМ различной длины, изучить влияние структуры ТМ на характер его тепловой денатурации.

Используя ТМ фибробластов в сравнении с гладкомышечным ТМ, изучить влияние замен участков, кодируемых определенными экзонами, на характер тепловой денатурации ТМ.

Провести сравнительный анализ тепловой денатурации связанного с актином ТМ, исследуемой методом ДСК, и температурных зависимостей диссоциации ТМ с поверхности актинового филамента, исследуемых по изменениям светорассеяния. На основании такого анализа представить механизм тепловой денатурации связанного с актином ТМ.

Научная новизна и практическая значимость.

Разработаны новые подходы на основе сочетания метода ДСК с измерениями температурных зависимостей светорассеяния для регистрации изменений характера тепловой денатурации ТМ, происходящих в результате его связывания с F-актином. Это позволило впервые описать механизм тепловой денатурации ТМ в присутствии F-актина, а также впервые объяснить существенную разницу в физиологических эффектах двух кардиомиопатических мутаций в молекуле ТМ, D175N и E180G. Помимо этого, методом ДСК в сочетании с другими методами (КД, светорассеяние)

8 впервые проведены исследования тепловой денатурации немышечных ТМ фибробластов и дрожжей. Работа имеет валшое значение для дальнейших исследований влияния различных факторов, таких как точечные мутации или изменения целых участков в молекуле ТМ, на тепловую денатурацию ТМ в отсутствие и в присутствии актина.

Похожие диссертации на Тепловая денатурация различных изоформ тропомиозина в отсутствие и в присутствии F-актина

Влияние малых белков теплового шока на тепловую агрегацию F-актинаПивоварова Анастасия Викторовна

Тепловая денатурация актиновых филаментов и влияние на нее актин-связывающего белка кофилинаМихайлова Валерия Вадимовна

Влияние 2-(пара-аминобензолсульфамидо)-тиазола на рост культуры Serratia Marcescens W1050 и биосинтез эндонуклеазы в присутствии и в отсутствие пуриновШах Махмуд Раихан

Влияние 2-(пара-аминобензолсульфамидо)-тиазола на рост кульутры Serratia Marcescens W1050 и биосинтез эндонуклеазы в присутствии и в отсутствие пуриновШах Махмуд Раихан