Содержание к диссертации
Введение
НИТРАТРЕДУКТАЗА, ЕЕ РЕГУЛЯЦИЯ И СВЯЗЬ С ПРОДУКТИВНОСТЬЮ ШСШИХ РАСТЕНИЙ
1.1 Общая характеристика ферментов ассимиляции азота 8
1.2 Нитратредуктаза и ее регуляция в высших растениях 13
1.3 Активность нитратредуктазы как показатель эффективности превращения азота у растений 22
ГЛАВА 2. ЭКСПЕШЛЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 33
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛІЩОВАНИЯ
2.1 Объекты исследования 33
2.2 Определение активности нитратредуктазы в интактных тканях 34
2.3 Определение активности нитратредуктазы в гомогенате растительных тканей 35
2.4 Определение белка в вегетативных
тканях 36
2.5 Определение суммарного белка в зерне кукурузы 36
2.6 Определение азота в вегетативных тканях 37
2.7 Определение обогащения органов органов растений меченым азотом 38
2.8 Электрофоретическое разделение белков 38
2.9 Проявление нитратредуктазной активности в полиакриламидном геле 39
2.10 Статистическая обработка данных . 39
2.11 Использованные реактивы 40
ГЛАВА 3. НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА НИТРАТРЩУКТАЗЫ И ЕЕ АКТИВНОСТЬ У РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ И ГИБРИДОВ ВИНОГРАДНОМЛОЗЫ 41
3.1 Некоторые свойства нитратредуктазы виноградной лозы 41
3.2 Нитратредуктазная активность у различных видов и гибридов виноградной лозы 45
ГЛАВА 4. ХАРАКТЕРИСШКА НИТРАТРЕДУКТАЗЫ И ЕЕ СВЯЗЬ С НЕКОТОРЫМИ ПОКАЗАТЕЛЯМИ УСВОЕНИЯ АЗОТА У РАЗЛИЧНЫХ СОРТОВ И ГИБРИДОВ КУКУРУЗЫ 51
4.1 Выделение и характеристика нитратредуктазы некоторых сортов кукурузы 51
4.2 Нитратредуктазная активность различных сортов и гибридов кукурузы 56
4.3 Показатели усвоения азота у кукурузы 62
ГЛАВА 5. ДИНАМИКА НИТРАТРДЦУКТАЗНОЙ АКТИВНОСТИ В ПЕРИОД ВЕГЕТАЦИИ И ЕЕ СВЯЗЬ С ПРОДУКТИВНОСТЬЮ РАСТЕНИЙ КУКУРУЗЫ 71
ГЛАВА 6. ЭЛЖТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БЕЛКОВ ЛИСТЬЕВ И ЗЕРНА У КУКУРУЗЫ 80
6.1 Сравнительный диск-электрофорез водорастворимых белков листьев у кукурузы 80
6.2 Электрофоретическое исследование водорастворимых белков зерна кукурузы 88
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 92
ВЫВОДЫ 95
ЛИТЕРАТУРА 97
- Общая характеристика ферментов ассимиляции азота
- Определение активности нитратредуктазы в интактных тканях
- Некоторые свойства нитратредуктазы виноградной лозы
- Выделение и характеристика нитратредуктазы некоторых сортов кукурузы
- ДИНАМИКА НИТРАТРДЦУКТАЗНОЙ АКТИВНОСТИ В ПЕРИОД ВЕГЕТАЦИИ И ЕЕ СВЯЗЬ С ПРОДУКТИВНОСТЬЮ РАСТЕНИЙ КУКУРУЗЫ
Введение к работе
Уникальная способность растений усваивать неорганические форды азота и строить из них аминокислоты и белки привлекла особое внимание ученых мира в связи с ощущаемым в настоящее время недостатком белка. Поскольку необходимым условием для синтеза белка является обеспечение растений азотом, вопросы, связанные с азотным обменом, приобретают не только теоретическое, но и практическое значение.
Важность исследования азотного обмена заключается в том, что оно создает основу для решения таких проблем как повышение урожайности и белковости сельскохозяйственных культур, ставших особенно актуальными после принятия майским (1982 года) пленумом ЦК КПСС Продовольственной программы.
Успешному решению задачи повышения эффективности сельскохозяйственного производства, поставленной пленумом, способствует широкое внедрение в практику достижений биологической и сельскохозяйственной наук, в частности, в области применения удобрений и роста механизации.
Однако современное растеневодство нуждается в принципиально новых подходах к повышению продуктивности растений. Одним из них является создание сортов, способных наиболее активно поглощать и метаболизировать минеральные азотистые вещества, в наибольшей степени используя их для создания высоких урожаев. Хорошей предпосылкой в этом отношении служат данные о различиях в отзывчивости на минеральные удобрения существующих сортов сельскохозяйственных культур.
При изучении причин этих различий, к сожалению, недостаточное внимание уделялось внутренним, физиолого-биохимическим причинам. Между тем, этим причинам принадлежит важная, а возможней главная роль в определении потенциальной способности растений к использованию минеральных удобрений. При создании новых сортов и подборе исходных форм для скрещивания необходимо в первую очередь учитывать их способность к поглощению азота и включению его в обмен веществ, поскольку азот имеет решающее значение в повышении продуктивности растений.
Для эффективного отбора форм, наиболее активно усваивающих и метаболизирующих минеральный азот, необходимо установление показателей для ранней диагностики этих свойств. Считают, что одним из таких показателей может служить активность нитратредукта-зы - фермента, ответственного за восстановление в растении поглощенных нитратов. Отсюда понятна важность исследования нитрат-редуктазы - ключевого фермента азотного обмена.
Однако задачи, поставленные перед селекционерами, требуют новых, дополнительных критериев интенсивности превращения азота в растениях.
Следует отметить, что исследования по выявлению потенциальных возможностей растений к использованию азота удобрений и путей повышения их урожайности, в основном, ведутся на однолетних культурах и мало касаются многолетних культур.
Одной из ведущих многолетних культур сельского хозяйства Грузинской ССР является виноградная лоза, азотный обмен которой недостаточно хорошо изучен в этом аспекте. Между тем, выяснение характера первичного усвоения и превращения неорганического азота виноградной лозой и на этой основе отбор исходных форм для создания высокопродуктивных сортов, способствовали бы поднятию урожайности этой культуры.
Важнейшей зерновой культурой в Грузинской ССР и за ее пределами является кукуруза. Вместе с другими злаковыми она служит источником растительного белка для человека и животных. Поэтому - 7 -работы по выявлению и созданию высокоурожайных и высокобелковых сортов кукурузы являются весьма актуальными.
Кроме того, однолетняя культура кукурузы служит удобным объектом для поисков новых критериев интенсивности азотоусвое-ния зерновыми.
Общая характеристика ферментов ассимиляции азота
В среде, окружающей растения, азот находится в двух формах: в виде газообразного азота атмосферы (Л ), который не усваивается большинством растений, и в виде различных органических и неорганических соединений почвы.
Для большинства растений источником азота служат нитраты, присутствующие в почве в наибольших количествах по сравнению с другими азотистыми соединениями. Они хорошо поглощаются и усваиваются растениями.
Усвоение азота сводится к восстановлению нитратов до аммиака, который затем используется для синтеза аминокислот, белков и других азотсодержащих органических соединений в растениях. Поэтому ассимиляция азота представляет собой важнейший процесс жизнедеятельности растений, результатом которого является синтез белка.
Восстановление нитратов растительными организмами представляют в виде схемы:
Согласно этой схемы каждый этап восстановления сопровождается изменением валентности атома азота и катализируется соответствующим ферментом: нитратредуктазой, нитритредуктазой, гипо-нитритредуктазой и гидроксиламинредуктазои. Восстановление одной молекулы нитрата до нитрита идет с участием двух электронов, а восстановление нитрита до аммония - с участием шести электронов (Xw# ei al., 1969).
Эти ферменты выделены из микроорганизмов и высших растений. Все они являются флавопротеидами, кофакторами которых служат ФАД или ШН. Первоначальными донорами электронов являются восстановленные формы НАД«Н9 или НАДФ Нр. Ферменты отличаются природой металла, являющегося активатором восстановления азота. Для нит-ратредуктазы эту роль играет молибден, для нитритредуктазы и ги-понитритредуктазы - медь, железо или магний, для гидроксиламин-редуктазы - магний и марганец. Все ферменты содержат сульфгид-рильные группы (Кретович, 1972).
Поскольку ассимиляция азота в растениях начинается с восстановления нитрата до нитрита, катализируемого нитратредуктазой, этот фермент считают "ключевым" ферментом азотного обмена растительных организмов.
Нитратредуктаза обнаружена в различных органах и тканях зеленых и этиолированных растений - в корнях, стеблях, листьях (Му-равин и др., 1964; Хавкин и др., 1968; Кузнецова, 1974; СпШШІґ wUoOruf d(U.t 1976; бШлп d od., І980; РоЄшЩ , 1983), суспензионной культуре ткани (ty)fW Ms &1- ., 1978), зародышах (Кузнецов, 1979) и репродуктивных органах (Павлов и др., 1981; Шф,Щ щаАшт\т, i98i).
Определение активности нитратредуктазы в интактных тканях
Активность нитратредуктазы в интактных тканях виноградной лозы и кукурузы определяли по методу Мульдера ( ЇЇШШіМ., 1959), основанному на способности А/Од, образовывать с сульфаниламидом соли диазония, которые затем, взаимодействуя с ароматическими аминами, дают красноокрашенные азо соединения.
Навеску растительного материала в I г нарезали на кусочки и помещали в сосуд Тунберга. Туда же добавляли 5 мл 0,066 М фосфатного буфера с нужным значением рН, I мл 0,1 М яблочной кислоты, предварительно нейтрализованной fCOH , I мл 0,1 М и 2 мл дистиллированной воды. После вакууминфильтрации реакционную смесь инкубировали в ультратермостате при 37 С в течении 30 минут. Реакцию останавливали добавлением I мл 12% уксусной кислоты и 3 мл насыщенного раствора сульфата аммония и содержимое сосудов фильтровали. В контрольные варианты уксусную кислоту добавляли еще до начала реакции. Об активности нитратредуктазы судили по количеству /VOo » образовавшегося в реакционной смеси в течении 30 минут. Для этого к 5 мл фильтрата приливали 2 мл реактива Грисса (1% сульфаниловая кислота, 9% винная кислота и 0,1$ d-нафтил-амина). Характерная окраска развивалась в течении 30 минут в темноте. Интенсивность окраски измеряли при 540 нм спектрофотометре "Спекол".
Количество образовавшегося NOz расчитывали с помощью стандартной кривой, предварительно построенной для различных концентрации
Некоторые свойства нитратредуктазы виноградной лозы
Ркацители - широко распространенный в Грузии промышленный сорт винограда, характеризующийся высокой урожайностью и качеством продукции. Изучение вопросов усвоеїшя глинерального азота этим сортом внесет определенный квлад в решение задачи управления азотным обменом виноградной лозы с целью дальнейшего повышения ее продуктивности.
В интактных тканях корней и листьев сорта Ркацители исследована нитратредуктаза. Показано, что фермент проявляет максимальную активность при значениях рН от 7 до 8. Оптимальное значение рН для нитратредуктазы корней и листьев винограда составляло 7,6. Эта величина близка к значениям рН, полученным для многих растительных нитратредуктаз (Sundmoti, Шипу , 1964; Ршщш $ СЖ.9 1965; КШ tt Oil , 1980).
Изучение влияния температуры на нитратредуктазную активность показало, что фермент проявляет активность при довольно низкой температуре +2 С и достигает максимума при 40 С. Дальнейшее повышение температуры приводит к быстрой потере ферментативной активности. При 55 С фермент полностью инактивируется, что свидетельствует о термолабильности нитратредуктазы виноградной лозы.
Исследование влияния продолжительности реакции на активность нитратредуктазы показало, что восстановление нитратов начинается с первых минут их поступления в растение. Рисунок I демонстрирует, что скорость реакции восстановления находится в прямой пропорциональной зависимости от времени инкубации растений на нитрате в течении первых 40 минут, после чего эта зависимость нарушается.
Выделение и характеристика нитратредуктазы некоторых сортов кукурузы
В первую очередь были подобраны условия получения экстракта с высоким содержанием нитратредуктазы из проростков различных сортов кукурузы, позволяющие предотвратить инактивацию фермента. Добавление 2-меркаптоэтанола и тритона хІОО в экстрагирующую среду практически не влияло на выход фермента. Определенный эффект достигался при использовании дитиотреитола в концентрации 1»10""2 М. Цистеин в концентрации І«ДГ2 М и ЭДТА в концентрации 5-Ю""3 М эффективно защищали нитратредуктазу от разрушения.
Следует отметить, что необходимость присутствия цистеина для максимальной экстракции нитратредуктазы показана также у различных видов трав ФіА/Жц &f Oil ., 1977).
Активность нитратредуктазы определяли в гомогенатах из корней и листьев 7-дневных проростков кукурузы сортов: Абашури кви-тели, Аджаметис тетри, ймерули гибриди и Картули круги.
Определение коферментной специфичности нитратредуктазы спектрометрическим методом показало, что фермент функционирует только в присутствии НАД Eg, оптимальная концентрация которого равна 1,26 «КГ4 М.
Проявление нитратредуктазной активности с помощью диск- электрофореза в полиакриламидном геле подтвердило, что фермент исследованных сортов активен только с НАД«Но и выявляется в виде одной полосы с Rjj 0,17 (рис.10).
Динамика нитратрдцуктазной активности в период вегетации и ее связь с продуктивностью растений кукурузы
Целью исследования явилось изучение динамики нитратредуктаз-ной активности, как показателя эффективности превращения азота, и ее связи с продуктивностью и накоплением белка в зерне у широко районируемых и селекционных сортов и гибридов кукурузы в период вегетации в полевых условиях.
Исследования проводили на Мцхетской селекционной станции в течении трех лет.
Растения для анализов отбирали с учетом продолжительности вегетации в три различные фазы: в фазу 4-5 листьев, перед цветением метелки и после цветения початка.
Учитывая то, что, за исключением раннего периода развития проростков, основная часть нитратов восстанавливается в листьях фтШ, 1969), определение активности нитратредуктазы проводили только в верхних, полностью распустившихся листьях. Кроме того, это позволяло сохранить растения в неповрежденном виде и повторно использовать их в исследованиях.
Поскольку природные условия 1980 - 1982 годов различались незначительно и не оказали существенного влияния на развитие растений кукурузы, в таблице J& 9 представлены усредненные данные, полученные за три вегетационных периода.
Как видно из таблицы, исследованные растения имели широкие различия по уровню нитратредуктазной активности, практически сохранявшиеся в течении исследованного времени.
Высокий уровень нитратредуктазной активности на ранней стадии вегетации (4-5 листьев) отмечен у сорта Имерули гибриди, а самый низкий среди сортов - у Абашури квители.
Интересно, что полученная из этого сорта линия Абашури квители 30 имела довольно высокую нитратредуктазную активность, а полученный из нее и В 40 Т простой межлинейный гибрид Картули 52 характеризовался еще более высокой способностью к восстановлению нитратов.
У гибрида Картули 9, полученного скрещиванием линий Картули круги 44 и ШР 44, активность фермента на стадии 4-5 листьев была ниже, чем у родительских форм. Однако на более поздних стадиях вегетации интенсивность восстановления азота у гибрида приблизилась к интенсивности восстановления у материнской линии ШР 44 и даже несколько превысила ее.
У всех исследованных растений перед цветением повышалась, а после цветения резко падала активность нитратредуктазы. Подобный характер изменения нитратредуктазной активности в период вегетации отмечен многими исследователями 1970; %0WC 6t/ Сії ., 1978).
Поскольку увеличение активности нитратредуктазы связано с синтезом белка (Ш%Ь( Н$&ьд. et сЖ ., 1972), падение этой активности после цветения может быть обусловлено снижением эффективности белкового синтеза в стареющих тканях.( Owkb &v at., 1972).
Определенного интереса заслуживали сорта Абашури квители и Имерули гибриди в связи с продолжавшимся в их листьях повышением нитратредуктазной активности и после цветения. Это указывало на повышенную способность названных сортов к поглощению и метаболи-зации азота на более поздних стадиях вегетации, что очевидно, сыграло определенную роль в накоплении белка в зерне этих сортов (табл.Ю).
