Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 10
1. Методы выделения и очистки тимических пептидных факторов 12
2. Физико-химическая характеристика тимических факторов 16
3. Биологическая активность тимических факторов и механизм действия . 28
4. Количество и взаимосвязь тимических факторов 47
5. Заключение 49
ГЛАВА 2. Использованные материалы и методы исследования 51
1. Метод выделения фракции АФТ-6 Т-активина. . 51
2. Методы^ использовавшиеся при выделении субфракции Т-активина 54
3. Методы, использовавшиеся для физико-химической характеристики субфракции Т-активина и АФТ-6 .......... 57
4. Методы оценки биологической активности субфракций Т-активина и АФТ-6 60
5. Статистическая обработка результатов. ... 67
ГЛАВА 3. Результаты исследований 68
1, Выделение субфракций Т-активина 68
2, Частичная физико-химическая характеристика фракции АФТ-6 и субфракций Т-активина ... 86
3, Тестирование биологической активности фракции АФТ-6 И субфракций Т-активина 92
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов ПО
ВЫВОДЫ 135
ЛИТЕРАТУРА 136
- Методы выделения и очистки тимических пептидных факторов
- Метод выделения фракции АФТ-6 Т-активина.
- Выделение субфракций Т-активина
Введение к работе
Актуальность темы определяется тем, что в последние годы интенсивно развиваются биохимические исследования низкомолекулярных белков и пептидов в связи с обнаружением их исключительной роли в регуляции биологических процессов рО, 49]. Среди пептидов важное место занимают гормоны и гуморальные факторы, многие из которых являются медиаторами реакций, играющих ключевую роль в функционировании организма и согласовании функций клеточных популяций на разных уровнях интеграции [52, 54, 56, 67]. К группе биологически активных низкомолекулярных белков относятся и тимические гуморальные факторы [3, 10, 52, 95, 122, 157, 191, 212]. Они представляют собой регуляторные пептиды первой ступени, так как непосредственно влияют на иммунную систему [кГ].
Тимус играет центральную роль в развитии, становлении и функционировании лимфоидной системы и поддержании иммунного гомеостаза [Ї22, 169, 19f] . Доказано, что свое влияние он осуществляет посредством низкомолекулярных пептидных факторов, контролирующих диффе-ренцировку предшественников Т-клеток и регулирующих работу зрелой популяции клеток иммунной системы. Важную роль пептидов тимуса подтвердили результаты экспериментов на животных, лишенных тимуса, а также наблюдения, сделанные на людях, страдающих первичными и вторичными иммунодефицитными состояниями, у которых синтез этих веществ нарушен [[41, 42, I9l| . Необходимость лечения таких заболеваний поставила на повестку дня вопрос об изыскании средств и способов целенаправленной компенсации нарушенных функций [53, 165].
В связи с этим одной из основных задач современной биохимии и молекулярной иммунологии является поиск иммунологически активных веществ, в том числе и пептидов тимуса, участвующих в контроле функций иммунной системы. Выделение иммунорегуляторных пептидных факторов, всестороннее исследование их физико-химических и биологиче- ских свойств имеет большое значение как с теоретической, так и с практической точки зрения с целью использования их в качестве имму-номодулирующих соединений.
В области изучения пептидных тимических факторов имеется много нерешенных проблем, в том числе и вопрос о количестве синтезируемых тимусом факторов. Согласно одной точке зрения тимус синтезирует только один пептид или моногормон, который обусловливает биологическую активность всех известных тимических факторов и входит в состав каждого из них р-8, III]. Другая группа исследователей во главе с Ж.-Ф.Бахом, А.Гольдштейном, Г.Гольдштейном, считает, что в связи со сложностью и многообразием функций тимуса существует целый спектр пептидных гормоноподобных тимических факторов [83, 139, 175]. От правильного подхода к решению этого вопроса зависит' подбор методов выделения пептидных факторов (фактора) и изучение их (его) биологических свойств. В теоретическом плане, решение вопроса о количестве и степени гетерогенности тимических факторов, дает возможность исследовать молекулярные механизмы становления иммунокомпе-тентных клеток, в практическом плане - позволяет вести целенаправленный поиск высокоспецифичных иммунорегуляторов для иммунокоррек-ции и дифференциальной диагностики иммунодефицитных состояний.
Наибольшую трудность в изучении пептидов тимуса составляет подбор методов их выделения, которые позволяют получить недеградированные, нативные молекулы факторов (фактора). В настоящее время имеется богатый арсенал биохимических методов выделения пептидов и от их подбора и сочетания зависит характер получаемого вещества. В том случае, если в процессе выделения тимических факторов (фактора) получено несколько различных веществ, следует провести сравнительный анализ их физико-химических и биологических свойств. Это позволяет уже на промежуточных этапах выделения факторов выявить биологически активные компоненты и в дальнейшем сосредоточить внимание на их исследовании. После получения иммунологически активных пепти- - б - дов тимуса в чистом виде становится возможным изучение их структуры.
Для выяснения физиологического действия выделенных пептидных тимических факторов разрабатываются методы тестирования их биологической активности. Характеристика биологических свойств фактора -один из наиболее ответственных этапов его изучения, так как без него нельзя решить вопрос о механизме действия и роли данного вещества в регуляции иммунных процессов, что в конечном счете отражается на его правильном клиническом использовании. Известны примеры выделения, очистки и структурной характеристики пептидов тимуса, которые после проверки биологических свойств в разных тест-системах оказались неактивными и были отнесены к разряду балластных. Это касается ряда пептидов тимозина, в частности ^-тимозина [134, 175].
Работы по выделению и характеристике пептидных тимических факторов ведутся в СССР, США, Франции, ФРГ, Италии и других странах. Возможность применения пептидных тимических факторов с целью коррекции нарушений Т-клеточного звена иммунитета, сопровождающих им-мунодефицитные состояния и опухолевые заболевания, уже подтверждена некоторыми исследователями, начавшими их клиническое испытание [38, 70, 75, 76, 112, 165, 218].
В лаборатории молекулярной иммунологии НИИ ФХМ при 2 МОЛГМИ им.Н.И.Пирогова из тимуса телят выделен тимическии фактор пептидной природы Т-активин [7, 40, 167]. Наиболее изученной является фракция АФТ-6 (активный фактор тимуса-6) Т-активина, которая в настоящее время проходит успешное клиническое испытание [б, 38, 39, 45]. Этот фактор гетерогенен по составу и обладает широким спектром биологических свойств [з, 4, 4о]. До сих пор не выяснено, обусловлено ли биологическое действие фактора наличием одной молекулы, или оно обеспечивается разными молекулярными структурами в составе Т-активина. Также неизвестно, с чем связана молекулярная гетерогенность фракции АФТ-6 Т-активина: с функциональной неоднородностью, разно- образием свойств компонентов фактора, или же с другими причинами, например, с деградацией молекул в процессе выделения. Выяснение этих вопросов необходимо для понимания механизмов иммунорегулятор-ного действия Т-активина, а также для более широкого и целенаправленного использования этого препарата или отдельных его компонентов при иммунокоррекции.
Цель исследования заключалась в решении вопроса: существует ли взаимосвязь между молекулярной гетерогенностью фракции АФТ-б Т-активина и функциональным разнообразием пептидов, входящих в ее состав.
Для этого необходимо было решить следующие задачи.
Задачи исследования
Изучить степень молекулярной и функциональной гетерогенности фракции АФТ-б Т-активина.
Разработать подходы к выделению отдельных субфракций Т-активина .
Изучить некоторые физико-химические параметры фракции АФТ-б и субфракций Т-активина.
Исследовать биологическое действие фракции АФТ-6 и субфракций Т-активина в разных биологических, тестах.
Научная новизна результатов исследования заключается в том, что в работе впервые осуществлено фракционирование гетерогенного тимического пептидного фактора Т-активина и выделено 16 компонентов, входящих в состав фракции АФТ-б. Разработан способ выделения отдельных пептидных субфракций Т-активина, основанный на различии молекул по электрическому заряду и молекулярным массам. Получены новые данные о физико-химических свойствах Т-активина: определены изоэлектрические точки для шести и молекулярные массы для шестнадцати субфракций; подтверждена пептидная природа Т-активина и уточнена нижняя граница молекулярных масс фракции АФТ-б Т-активина. Впервые в трех биологических тестах, выявляющих разные уровни развития Т-клеток, показана функциональная гетерогенность фракции АФТ-б Т-активина. Выяснено, что для осуществления определенных этапов созревания Т-лимфоцитов необходимы различные субфракции Т-активина, а для "запуска" самого раннего этапа, выявляемого в тесте индукции Thy-і антигена, необходимо одновременное действие всего комплекса пептидных компонентов фракции АФТ-б.
Выделено несколько субфракций Т-активина, превосходящих по эффективности исходную фракцию АФТ-6 в 400-2000 раз. В составе АФТ-б наряду с полифункциональными субфракциями (например A.I, C.I, E.I) обнаружены компоненты, проявляющие активность только в одном тесте (например, В.2, С.З, F.1) и неактивные субфракции (А.2, А.З).
Сделано заключение о том, что молекулярная гетерогенность фракции АФТ-6 Т-активина отражается в функциональном разнообразии пептидных компонентов, входящих в ее состав и различающихся по физико-химическим свойствам.
Практическое значение работы
Работа направлена на изучение физико-химических и биологических свойств отдельных пептидных компонентов тимического фактора Т-активина.
Впервые показана возможность и разработан способ выделения из фракции АФТ-6 Т-активина пептидов с определенными физико-химическими параметрами и биологическим действием. Этот подход может быть использован для выделения любых низкомолекулярных белков, близких по молекулярным массам и изоэлектрическим точкам.
Разработан способ получения двух субфракций Т-активина - В.З и С.2, превышающих эффективность исходной фракции АФТ-6 более чем в 400 и 2000 раз, соответственно. Биологическое тестирование в разных тест-системах показало их высокую иммунологическую активность. Эти субфракции могут быть использованы при изучении отдельных этапов созревания Т-клеток, а также, после дополнительного исследования, в целях иммунокоррекции.
Проведен сравнительный анализ биологических моделей оценки эффективности тимических пептидных факторов. Предложен комплекс биологических тестов для выявления влияния тимических факторов на разные этапы развития Т-клеток.
Полученные в работе данные о структурной и функциональной гетерогенности Т-активина вносят вклад в изучение природы и механизма действия этого иммунорегуляторного тимического фактора, а также подтверждают гипотезу о том, что для регуляции процессов развития Т-звена иммунитета необходим ряд регуляторних факторов тимуса.
Работа является фрагментом научно-технической проблемы 0.69.07 ГКНТ СССР и выполнена в соответствии с решением конкретной задачи 02.05.Н2: "Разработать способы дальнейшей очистки препарата Т-активина (АФТ-б) с целью получения индивидуальных пептидов и исследовать их биологическое действие".
Методы выделения и очистки тимических пептидных факторов
В основе выделения тимических пептидных факторов лежит несколько биохимических приемов, но их сочетание, последовательность, модификация, разнообразие материалов и реагентов для фракционирования белков и пептидов, предлагаемое современной промышленностью, позволяет выделять вещества, различающиеся по физико-химическим характеристикам и биологической активности.
І.І. Тимозин фракция 5 [і 49].
Препарат выделяют из тимуса телят. Основные этапы выделения следующие: гомогенизация тимуса в растворе хлористого-натрия, нагревание, осаждение ацетоном, высаливание сульфатом аммония, ультрафильтрация, гель-хроматография на колонке с Сефадексом G-25. Выход препарата - 200 мг из I кг тимуса.
1.2. СТФ [87, 194].
Источник получения СТФ - сыворотка свиньи, реже - сыворотка других видов животных, в том числе и человека. Схематично процесс выделения можно представить следующим образом: дефибринизация сыворотки, диализ, концентрирование на фильтрах Diaflo им-2 (Amicon ), фильтрация на Сефадексе G-25, катионообменная хроматография на КМ-целлюлозе, повторная гель-фильтрация на Сефадексе G-25 в иных условиях, обессоливание на Сефадексе G-ю и электрофорез. Выход СТФ - 2 мкг из 90 л крови.
1.3. ТГФ [162, 217].
При выделении ТГФ из тимуса теленка последовательность процедур следующая: гомогенизация ткани в натрий-фосфатном буфере, диализ супернатанта, гель-фильтрация на Сефадексе G-Ю И G-25,amio-нообменная хроматография на ДЭАЭ Сефадексе А-25.
1.4. Тимопоэтин [іЗб, І9І].
Стандартная схема выделения тимопоэтина: гомогенизация тимуса теленка в растворе уксуснокислого аммония, нагревание, ультрафильт-трация на мембранах Diaflo XM-IOOA (Amicon ), концентрирование на
- 14 фильтрах Diaflo им-2 (Amicon), гель-фильтрация на Сефадексе G-50, адсорбционная хроматография на гидроксиаппатите, ионообменная хроматография на QAE-Сефадексе. Выход препарата из I кг тимуса - I мг.
1.5. Тимостимулин [124].
Препарат был выделен в институте фармакологии Сероно в Риме, отсюда и сокращенное название тимостимулина - ТП-І Сероно. Этапы выделения: гомогенизация тимуса теленка, экстракция ацетатом аммония, осаждение сульфатом аммония, ультрафильтрация на фильтрах Diaflo РМ-10 (Amicon), гель-фильтрация на Сефадексах G-25 и G-50.
1.6. Сывороточный фактор [80].
Препарат выделяют из дефибринированной сыворотки крови человека. Основной процедурой при выделении СФ является многоэтапная ультрафильтрация на мембранах Centriflo CFA-50 (Amicon) и разделение на других фильтрах с различной величиной пор.
1.7. Убиквитин [137].
Убиквитин выделен из тимуса теленка с помощью экстракции раствором бикарбоната аммония, нагревания, ультрафильтрации на мембранах DiafioXMIOO и им-2 и гель-хроматографии на колонке с Сефадек-сом G-50.
1.8. Тимарин [47, 48].
Процесс выделения тимарина включает следующие этапы: делипои-зация тимуса теленка с помощью ацетона, гемогенизация и экстракция раствором уксусной кислоты и хлористого цинка, осаждение ацетоном, ионообменная хроматография на смоле Биокарб T-I2 в кислых условиях и гель-фильтрация на Сефадексе G-25.
1.9. Т-активин [4, 7, 18, 40].
Препарат выделен в 1976 году из тимуса теленка. Схема выделения фракции АФТ-б Т-активина следующая: гомогенизация ткани в раст - 15 воре хлористого натрия, аутолиз, нагревание, осаждение ацетоном и сульфатом аммония в различных условиях, ультрафильтрация на мембранах Peiiicon PSED, гель-фильтрация на Сефадексе G-50 и обессолива-ние на Сефадексе G-ю ИЛИ G-15. ВЫХОД АФТ-б из I кг тимуса составляет 100 мг.
Для того, чтобы полнее представить арсенал методов и приемов, применяемых при выделении тимических факторов, приведем еще несколько кратких схем получения менее изученных гуморальных факторов тимуса.
Метод выделения фракции АФТ-6 Т-активина.
Фракцию АФТ-б Т-активина выделяли по методике, разработанной в лаборатории молекулярной иммунологии НИИ ФХМ при 2-ом МОЛГМИ им. Н.И.Пирогова [4, 40]. Основные этапы выделения АФТ-б перечислены ниже и указаны на схеме I.
Тимус телят получали на производственном объединении Мосмясо-пром, хранили при - 20. Все процедуры, кроме особо отмеченных в тексте проводили на холоду при 4.
1. 900 г тимуса, очищенного от соединительной ткани, измельчали и гомогенизировали порциями по 150 г в 0,15 М NaCi в соотношении 1:3 в размельчителе тканей Waring 3 мин при скорости 8000 об/мин.
2. Гомогенат подвергали аутолизу в течение 16 час при 4, затем центрифугировали I час при 2000 xg (центрифуга Mistral , ротор g-344).
3. Супернатант фильтровали через несколько слоев марли, нагревали до 80 и выдерживали при этой температуре 15 мин. Денатурировавшие белковые компоненты удаляли после охлаждения центрифугированием при 2000 xg в течение часа (центрифуга Вескшап J21B» ротор JA-14).
4. Супернатант по каплям добавляли из делительной воронки
в ацетон, охлажденный до - 20 в соотношении 1:7 при постоянном перемешивании и оставляли на ночь.
5. Осадок собирали центрифугированием при 2000 xg 30 мин. (центрифуга Missal, ротор g-344)і трижды отмывали ацетоном и высушивали в чашках Петри до исчезновения запаха ацетона.
6. Порошок растворяли в 10 мМ натрийфосфатном буфере, рН 7,0 и перемешивали в течение часа при температуре 18-20. Не раст - 52 ворившийся осадок удаляли центрифугированием при 30000xg 40 мин (центрифуга Beckman J21B, ротор JA-20). Супернатант собирали, определяли концентрацию белка и доводили концентрацию до 25 мг/мл.
7. К полученному раствору добавляли по-каплям насыщенный раствор сульфата аммония, рН 7,0 до 25% насыщения (на 100 мл раствора - 33,3 мл (MH.)2SO. ). Смесь перемешивали I час, центрифугировали при 30000 xg40 МИН (центрифуга Beckman J21B, ротор JA-20 ).
8. рН супернатанта доводили до значения 4,0 с помощью 10%-ного раствора уксусной кислоты на автоматическом титриметре (На-delkis, тип 0Р-506).
9. При постоянном помешивании добавляли сухой сульфат аммония из расчета 14,6 г на 100 мл раствора для достижения 50% насыщения. Смесь перемешивали I час, центрифугировали 30 мин в условиях, описанных в пункте 7.
10. Супернатант удаляли, осадок растворяли в 10 мМ Трис-НС1 буфере, рН 8,0 и добавляли равный объем насыщенного сульфата аммония, рН 7,0. В результате данных процедур получали активную фракцию тимуса 4 (АФТ-4), которая может длительное время храниться при 4.
11. С целью дальнейшей очистки АФТ-4 подвергали ультрафильтрации через мембранный фильтр Peiiicon PSED (ЬШІіроге). Ддя ЭТОГО осадок отделяли центрифугированием при 600xg в течение 15 мин (центрифуга Janetzki, К-23), растворяли в 10 мМ Трис-НСІ буфере,рН 8,0, определяли концентрацию белка и доводили ее до 10 мг/мл. Ультрафильтрацию осуществляли в камере аппарата жіііроге (Франция)под давлением 3,5 атмосфер с трехкратной промывкой исходным буфером. Фильтрат собирали, лиофилизировали на лиофильной сушке (CD-54, Неo), растворяли в минимальном объеме дистиллированной воды и обессоливали.
Выделение субфракций Т-активина
Ранее и в процессе выполнения данной работы методами электрофореза и изоэлектрического фокусирования было показано, что фракция АФТ-б Т-активина является гетерогенной смесью молекул с различными изоэлектрическими точками Г4, ё]. При этом компоненты фракции АФТ-б распределяются в диапазоне рН от 3,0 до 9,0 (см.раздел 2.3.1). В связи с этим свойством для дальнейшего разделения фракции АФТ-б Т-активина был использован метод ионообменной хроматографии. В качестве ионообменника была выбрана ДЭАЭ-целлюлоза (ДЕ-32), обладающая анионообменными свойствами. Для повышения эффективности разделения исследовали различные условия элюции материала, результаты которых приведены ниже.
Известно, что фракция АФТ-6 Т-активина гетерогенна по молекулярным массам и включает молекулы от 1500 до 6000 д \\, 5], поэтому следующим шагом явилось разделение фракций Т-активина методом гель-хроматографии. Для этой цели был выбран Сефадекс G-15, который позволял разделять белки с молекулярными массами от 300 до 4500 д (см.раздел І.4-.І). Это удовлетворяло нашим интересам, так как, во-первых, ранее было показано, что основная биологическая активность АФТ-6 сосредоточена в области от 2000 до 3500 д [l2j; во-вторых, в литературе имеется мало сведений о низкомолекулярных тимиче-ских факторах (с молекулярной массой ниже 3000 д) и поэтому выделить в первую очередь именно их представляло большой интерес; в-третьих, испытание Сефадекса G-25 не дало желательного четкого фракционирования материала.
После каждого этапа очистки фракций и субфракции Т-активина подвергали обессоливанию, что было необходимо для их подготовки к следующему этапу очистки или для проверки биологической активности. После ионообменной хроматографии фракции обессоливали на колонке (2,5x25 см) с Сефадексом G-15, в тех же условиях, что и АФТ-6. Это объясняется тем, что количество белка и солей, а также объем наносимых фракций были велики и сравнимы с этими параметрами при получении АФТ-6. В данных условиях достигалось отделение веществ с молекулярной массой ниже 1000 д и элюция белков с молекулярной массой выше 1000 д во внешнем объеме (раздел 1.5). После гель-хроматографии объем субфракций, количество белка и солей резко сократились. В связи с этим условия обессоливания были изменены для более тщательного отделения солей от белковой фракции и уменьшения потерь белка при обессоливании его малых количеств. С этой целью был выбран Свфадекс G-Ю, который в условиях эксперимента позволял отделять компоненты ниже 700 д от более высокомолекулярных. Были также уменьшены размеры колонки, что ускоряло процесс обессоливания и в то же время не влияло отрицательно на его эффективность, так как объем и количество белка в наносимом образце были малы.
1.2. Ионообменная хроматография
