Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 3
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕЗА БЕЛКОВ
В ПРОЦЕССЕ КЛЕТОЧНОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ 6
Глава I. Дифференцировка клеток хрусталика глаза ... 6
1. 6-кристаллины 7
J? -кристаллины II
сб-кристаллины 12
Глава П. Дифференцировка клеток яйцеводов кур .... 14
Глава Ш. Дифференцировка клеток печени 28
Глава ІУ. Появление структурных компонентов соедини
тельной ткани в ходе дифференцировки 41
Структура и функции протёогликанов 41
Использование протёогликанов в качестве маркеров дифференцировки соединительной ткани .... 44
Структура и функции коллагенов 51
Коллагены как маркеры дифференцировки 54
Коллагены как индукторы дифференцировки
(о гипотезе информационной роли коллагена) . . . ф
Молекулярные механизмы регуляции биосинтеза коллагенов 59
Регуляция биосинтеза коллагенов при трансформации клеток 63
Глава У. Некоторые закономерности регуляции биосин
теза маркеров клеточной дифференцировки в рас
смотренных системах . . 65
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 69
Стр.
Биологический материал 69
Получение экстрактов тканей и зародышей 69
Определение концентрации белков 72
Получение иммунных сывороток 73
Электрофорез, шмуноэлектрофорез и изоэлектро-фокусирование белков 74
Получение препаратов коллагена 76
Хроматографическое разделение белков 80
Обработка ферментами 82
9. Радиоактивное мечение белков 83
10. Радиоиммунологическое определение белков ..... 86
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 88
Часть I. Маркеры дифференцировки хорды 88
1. Обнаружение специфического антигена хорды белуги
и его очистка от посторонних антигенов 88
Характеристика свойств хордина НО
Очистка и характеристика коллагена из хорды
белуги 127
Часть П. Появление маркеров дифференцировки хорды
в ходе эмбриогенеза 141
Количественное определение общего содержания коллагена П типа в развиващихся зародышах белуги . 141
Количественное определение содержания хордина
в развиващихся зародышах белуги 167
ОБЩЕЕ ОБСУЖДЕНИЕ 174
ЗАКЛЮЧЕНИЕ (задачи дальнейших исследований) 179
ВЫВОДИ 180
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Введение к работе
Изучение молекулярных основ механизмов дифференцировки клеток стало в последние годы одной из самых интересных и одновременно самых трудных проблем биологии. Интерес к молекулярным основам дифференцировки определяется разработкой конкретных подходов к изучению таких проблем, как дифференцировка клеток при эмбриональном развитии, изменения клеток в онтогенезе, а также патологические случаи дифференцировки, такие как злокачественное перерождение. Трудность разработки этих научных задач в том, что несмотря на большое количество полученных экспери -ментальных данных до сих пор остаются непонятными основные механизмы клеточной дифференцировки, а также в том, что в боль -шинстве исследований результаты нормальной или злокачественной дифференцировки выявляются по морфологическим изменениям, которые, несомненно, опосредуются множественными биохимическими изменениями в клетке. Существует и иной способ обнаружения этих изменений, использующий биохимическое определение специфических продуктов,, отличающих дифференцированные клетки от недифференцированных. Такие продукты - маркеры дифференцировки - были использованы для изучения процессов дифференцировки хрусталика глаза, яйцеводов кур, а также некоторых других объектов. Изучение причин, вызывающих дифференцировку, следствием которой явилось появление соответствующего белкового маркера или маркеров показало, что в некоторых случаях индукторами являются гормоны. В других случаях, например, при дифференцировке клеток хрусталика, индуктор выявлен, но природа его не установлена. В некоторых случаях в качестве маркера дифференцировки используется не начало появления специфического продукта, а способность клеток на определенном этапе их дифференцировки синтезировать спе-
цифический продукт в ответ на действие индуктора, возникнове -ние такой компетентности имеет место при дифференцировке кле -ток печени. Во всех случаях, использование чистой системы индуктор —> дифференцировка (появление маркеров дифференциров-ки) позволяет изучать такие молекулярные механизмы происходящих процессов, как регуляция биосинтеза индивидуального белка на транскрипционном и посттранскрипционном уровне.
Одной из центральных проблем эмбриологии является детерминация путей клеточной дифференцировки. Опытами по пересадке клеток эмбрионов с последующим анализом морфологических изменений в ходе их дифференцировки и трансдифференцировки были получены временные данные о компетентности пересаженных клеток к индуцирующему действию клеточного окружения. Оказалось, что на ранних этапах пересаженные клетки компетентны к действию окружения и формируют ту ткань, в которую они пересажены. Но на определенных этапах развития эта компетентность исчезает, клетки оказываются детерминированными и дифференцируются лить в том направлении, в котором будет развиваться донорный участок зародыша. Молекулярный механизм этого явления не известен. Значительная часть этих морфологических исследований была проведена в нашей стране, в лаборатории Т.А.Детлаф. В качестве объекта исследований использовались зародыши осетровых рыб, значительные размеры которых облегчали микрохирургические операции по переносу клеток от зародыша к зародышу. Было показано, что первым орга -ном, появляющимся в ходе эмбриогенеза, является хорда, которая в свою очередь индуцирует морфологические изменения, характер -ные для других органов и тканей. Несмотря на свое первенство в ходе эмбриогенеза не только у хордовых, но и у позвоночные животных биохимическое изучение хорды почти не проводилось.
Отсутствие таких данных сдерживает биохимическое изучение процессов, приводящих к этой первой дифференцировке клеток зародыша, результатом которой является хорда. В связи с этим в качестве начального этапа исследований дифференцировки клеток презумптивной хордомезодермы в хорду нам представлялось целесообразным выявить специфические маркеры дифференцировки хорды и с их помощью тестировать биохимические изменения в ходе дифференцировки клеток, приводящие к образованию этого органа.
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕЗА БЕЛКОВ В ПРОЦЕССЕ КЛЕТОЧНОЙ ДШЕРЕНЦИРОВКИ Глава I. Дифференцировка клеток хрусталика глаза
Одной из наиболее удобных систем для изучения дифференци-ровки клеток являются клетки эмбрионального хрусталика глаза. Некоторые результаты, полученные при изучении этой системы рассмотрены в обзорах Пятигорского ( 117 ) и Де-Йонга ( 46 ). Хрусталик, имеющий форму эллипса, образуется при дифференциров-ке эпителиальных клеток, часть которых, находящаяся во фрон -тальной области глазного бокала, начинает удлинняться, образуя первичные хрусталиковые волокна, перпендикулярные большой оси эллипса. Эпителиальные клетки, располагающиеся по экватору хрусталика, начинают делиться, и новообразованные клетки смещаются к задней части хрусталика, удлиняются, образуя вторичные хрусталиковые волокна. К возрасту 3,5 дней полость хрусталика у куриного эмбриона оказывается практически заполненной удлин-нившимися клетками, активно идет образование вторичных волокон.
Основным биохимическим изменением, которое характеризует дифференцировку хрусталика, является появление семейства специфических белков хрусталика - кристаллинов. Это семейство представлено приблизительно 20 полипептидами, которые составляют основную массу белка хрусталика у взрослых животных. Общим их свойством является низкое содержание Х-спиралей - от 0 до д% - и высокое содержание ^-структуры - от 51 до 68% ( 146 ). Основная масса биохимических исследований выполнена на эмбрионах кур, поэтому дальнейшее рассмотрение процессов дифференци-ровки глаза целесообразно проводить именно на этом объекте. Кристаллины куриного эмбриона подразделяются на три группы, которые называют
зано с их электрофоретической подвижностью и иммунологическими свойствами ( 117 ).
I. о-кристаллины
Первыми и основными кристаллинами эмбрионального хрусталика кур являются о-кристаллины, имеющие молекулярный вес около 45000 ( 173 ). Имеются данные, что ген -кристалликов представлен двумя копиями, близко прилегающими друг к другу, с которых считывается одна мРНК-предщественник ( 35 ). Момент начала синтеза б'-кристаллинов в ходе эмбриогенеза варьирует по данным разных авторов в зависимости от использованного метода определения. Иммуногистологическим методом З'-крис -таллины выявляются в хрусталике на стадии 60 часов ( 179 ), радиоиммунологический метод выявляет их на стадии 54 часа ( 143 ), а использование % -меченого метионина с последующим осаждением радиоактивных продуктов сывороткой против
б'-кристаллинов позволяет обнаружить обе цго цепи на стадии 48 часов ( 144 ). В последней работе авторы использовали
Н-меченую кДЩ комплиментарную препарату б'-кристаллино -вых мРНК. С использованием этой кДНК было найдено, что био -синтез б'-кристаллиновых мРНК начинается на стадии 48 ч, то есть одновременно с началом биосинтеза их продуктов. На этой стадии происходит морфологическая дифференцировка части кле -ток: те из них, которые находились во фронтальной области глазного бокала начинают удлиняться, образуя первичные линзовые волокна. На этом этапе, как это следует из приведенных данных, синтез б'-кристаллинов регулируется на транскрипционном уровне. Экспрессия этих генов коррелирует с их гипоме-тилированием в клетках хрусталика по сравнению с этими же генами в других тканях (обезглавленные зародыши, кровь, сперма).
- 8 -Связь активации генов о -кристаллинов с их гипометилирова-
нием подтверждается опытами по трансформации линзовых клеток вирусом саркомы Рауса; после трансформации исчезает синтез
Морфологические изменения эпителиальных клеток, ведущие к образованию вторичных линзовых волокон,сопровождаются увеличением синтеза 5-кристаллинов с 35% в эпителиальных клетках до 80% в линзовых волокнах от всего синтезируемого клетками белка ( 118 ). Аналогичные изменения происходят и в культуре в присутствии 15% эмбриональной сыворотки теленка, содержащей низкомолекулярный "фактор дифференцировки и трансдифференци-ровки" ( 47 ), при этом синтез сГ-кристаллинов усиливается не до 80$, а лишь до 50$ ( 118 ). Однако с использованием ак-тиномицина Д было показано, что для этих морфологических изменений - удлинения клеток - не требуется синтеза мРНК ( 45 ) и белка ( 119 ). С другой стороны, для активации кристаллияовых генов, по крайней мере в культуре, не требуется удлинения клеток ( 29 ). Функциональная связь между происходящими морфологическими изменениями клеток в процессе дифференцировки хрусталика и наблюдаемыми биохимическими изменениями синтеза кристаллинов еще не изучена. Одним из перспективных подходов к этой проблеме является изучение процесса дифференцировки экваториальных эпителиальных клеток во вторичные линзовые волокна. С использованием меченой кДШ было показано, что основная масса мРНК для Г-кристаллинов в хрусталиках зародышей в возрасте 3,5-6 дней находится в ядрах в частично процесси-рованном состоянии. В полирибосомах содержание этих матриц
значительно ниже. Эти данные авторы подтверждают опытами по гибридизации с кДНК на замороженных срезах: содержание мРНК для Я'-кристаллинов значительно выше в ядрах эпителиальных клеток, чем в цитоплазме. В морфологически дифференцированных, удлиннившихся клетках содержание этой мРНК в цитоплазме выше, чем в ядре. Аналогичные опыты, проведенные с цыплятами через I день после вылупления показывают, что вся хрусталиковая мРНК для ^-кристаллинов находится в лолирибосомах ( 35 ). Эти данные подтверждают, что in vivo удлинение клеток сопровождается созреванием мИЖ и вовлечением ее в трансляцию. В ходе развития эмбриона уменьшается способность экваториальных клеток дифференцироваться во вторичные линзовые волокна и, соответственно, способность усиливать продукцию $ -кристалли-на. Такие же изменения происходят при культивировании в присутствии эмбриональной сыворотки эпителиальных клеток, взятых от эмбрионов цыпленка разного возраста. Детальное изучение содержания мРНК, а также измерение скорости синтеза Ъ -кристалли-нов до и после стимуляции эпителиальных клеток эмбриональной сывороткой, проведенное на 6-і' и 19-дневных эмбрионах, показало следующее: содержание мРНК для <5"-кристаллина почти одинаково в эпителиальных клетках до стимуляции эмбриональной сывороткой; после стимуляции оно возрастает и у 6-дневных и у 19-дневных зародышей примерно в 3 раза. При этом синтез
5 -кристаллина возрастает примерно в 3 раза у 6-дневных зародышей и не меняется у 19-дневных ( 29, 30 ). Таким образом, имеет место явный трансляционный контроль, запрещающий увеличение синтеза Ъ -кристаллина в эпителиальных клетках хрусталика 19-дневного эмбриона.
Еще один путь регуляции биосинтеза о -кристаллинов на уровне трансляции - стабилизация соответствующих мРНК - был обнаружен в экспериментах с использованием актиномицина Д. Было показано, что через 2 часа после его воздействия на эпителиальные клетки исчезает синтез всех белков кроме ^-кристаллинов, а интенсивность синтеза последних не меняется (45). Детальное изучение этого процесса в эпителиальных клетках с использованием актиномицина Д и актидиона показало, что стабилизация матриц происходит на стадии 11,7 - 12,7 суток. Для стабилизации ^-кристаллиновых матриц нужен белковый синтез. Его блокирование актидионом на этом этапе (с последующей отмывкой ингибитора) приводит к тому, что стабилизация не происходит ни в этот момент, ни на более поздних этапах развития эмбриона. В уже удлиннившихся клетках (Г-кристаллиновая мРНК стабильна на всех последующих этапах эмбриогенеза ( 178 ). Анализ дальнейшей судьбы этой мРНК с помощью гибридизации с кДШ на срезах и в электрофорезе, а также анализ продуктов трансляции суммарной мРНК из фибриллярных клеток хрусталика в бесклеточной ретикулоцитной системе показал, что трансляци-онно-активная мРНК для (Г-кристаллинов присутствует в течение длительного периода времени и исчезает в интервале между 3 и 5 месяцами после вылупления. Гибридизация на срезах выявляет все уменьшающиеся количества этой мРНК даже у 12-месячных животных, что, вероятно, свидетельствует о наличии в этих клетках продуктов деградации 5"-кристаллиновых матриц (156). Исходя из того, что ядра фибриллярных клеток неактивны и постепенно распадаются, авторы этой работы предполагают, что период полужизни мРНК S-кристаллинов из фибриллярных клеток составляет около 2 месяцев.
- II -
2. Л-кристаллины
В ходе эмбрионального развития и после вилуплення цыплят в хрусталике идет нарастание синтеза й -кристаллинов - группы из 7 полипептидов, характеризующихся молекулярным весом от 20500 до 34000 ( 46 ). J} -кристаллины синтезируются как в эпителиальных, так и в фибриллярных клетках хрусталика, при -чем полипептид 35000 появляется лишь при удлинении эпителиальных клеток, являясь маркером этой дифференцировки. Начало синтеза всех А -кристаллинов совпадает по времени с появлением соответствующих мРНК и приходится на 3 сутки развития. При передвижении эпителиальных клеток в экваториальную область, что сопровождается их удлинением, происходит постепенное нарастание синтеза мРНК для полипептида 35000 ( 108 ). По крайней мере 4 J5 -кристаллиновых цепи кодируются различными генами, так как было получено 4 перекрестно не реагирующие плазмиды: одна для белка 35000, другая для белка 25000, третья для 23000 и одна плазмида, кодирующая две цепи: 26000 и 19000. Для полипептида 27000 плазмида пока не получена, но имеется соответствующая мРНК ( 68 ).
Регуляция начала биосинтеза б -кристаллинов на транскрипционном уровне, по-видимому, сочетается с трансляционной регуляцией их биосинтеза в ходе развития. Так, анализ содержания матриц для J3 -кристаллинов по продуктам трансляции в бесклеточной системе (с последующим осаждением их специфическими антителами) в разных клеточных фракциях показывает, что практически равные количества активных матриц находятся в ло-лирибосомах и в супернатанте над полирибосомным осадком (153). Вопрос о том, являются ли эти матрицы маскированной формой В -кристаллиновых мИПС или они находятся в равновесии с тран-
слируемой частью матриц, не изучался. Запасание матриц для
й -кристаллинов в последующих работах этих авторов не изучалось; в литературе нет подтверждения или опровержения этих данных.
3. Л-кристаллины
Л -кристаллины появляются сначала в удлиннившихся, а затем и в эпителиальных клетках хрусталика эмбриона цыпленка, вскоре после появления л-кристаллинов ( 117 ). ^-кристаллины цыпленка являются, таким образом, последними из появляющихся в ходе эмбриогенеза кристаллинов. В литературе нет данных о регуляции их биосинтеза.
х к ж
Рассмотрение некоторых особенностей биосинтеза кристаллинов показывает, что в ходе дифференцировки клеток хрусталика первичное включение их биосинтеза осуществляется путем активации соответствующих генов одновременно с активацией биосинтеза их продуктов. Трансляционный контроль на этом этапе не обнаружен. Однако на последующих этапах транскрипционный контроль дополняется (или, возможно, модулируется) посттранскрипционной регуляцией. Эта регуляция проявляется в таких явлениях, как стабилизация кристаллиновых мРНК, а также в трансляционном запрете на увеличение биосинтеза (Г-кристаллинов у 19-дневных зародышей. Нельзя не отметить, что наблюдаемые исследователями морфологические изменения - удлинение эпителиальных клеток в ходе их дифференцировки в линзовые волокна - не связаны прямой зависимостью с активацией биосинтеза кристаллинов. В определенных условиях клетки могут удлиняться без увеличения биосинтеза
- ІЗ -
кристаплинов (действие актиномицина Д), в других условиях активация кристаллиновБХ генов происходит в отсутствии морфологических изменений.