Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 4
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
Химическое строение и распространение полиаминов 11
Метаболизм полиаминов 145
2.1. Пути синтеза полиаминов и роль орнитиндекарбоксилазы 15
Орнитиндекарбоксилаза 16
8-аденозил-Ь-метиониндекарбоксилаза 22
Спермидин- и сперминсинтазы 23
2.2.Пути распада полиаминов и роль аминоксидаз 24
2.2Л. Диаминоксидаза 24
2.2.2. Полиаминоксидазы 25
2.3. Роль трансглутаминазы в обмене полиаминов 29
3. Пролиферация клеток 31
3.1. Влияние полиаминов на деление и рост клеток 32
3.1.Г. Полиамины в нормальных пролиферирующих клетках 33
3.1.2.Полиамины в регенерирующей и эмбриональной ткани
животных 34
3.1.3. Полиамины и опухолевый рост 35
3.2. Неоплазии 39
3.2.1 .Меланома 39
3.2.2.Меланин 41'
3.2.3 .Меланогенез 43
Дифференциация клеток 45
Действие аналогов полиаминов и метил еновых производных ксантина> на метаболизм полиаминов 48
Резюме 50
Заключение 51
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 543
1. Количественный анализ основных показателей обмена полиаминов в
бесклеточных тест-
системах 632
Регенерирующая печень здоровых крыс 62
Пролиферирующая ткань гепатомы крыс Г27 63
Определение активности ДАО и ПАО 65
Определение активности ОДК и уровней полиаминов 67
Количественное определение белка в бесклеточных тест-структурах 72
2. Количественный анализ основных факторов пролиферации и
дифференциации на клеточной модели 74
Клеточные культуры 73
Обработка клеток веществами 77
Оценка антипролиферативной активности и цитотоксичности тестируемых веществ 78
Определение внутриклеточных уровней полиаминов 80
Экстракция свободных ПА 80
Разделение и количественное определение ПА методом ВЭЖХ 81
2.5. Определение активности трансглутаминазы 84
Активность трансглутаминазы «in vivo» 84
Активность трансглутаминазы «in vitro» 86
Определение уровней меланина внутри клеток 87
Количественный анализ белка в лизате 88
Статистический анализ данных 90
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 92
Глава 1. Исследование биохимических свойств гетероциклических
веществ оригинального синтеза на бесклеточном уровне 93
Тест-система из регенерирующей печени-крыс 92
Тест-система из гепатомы Г-27 крыс 96
Глава 2. Исследование биологических свойств тестируемых веществ
оригинального синтеза и производных метилксантина на клеточном
уровне 100
2.1 Влияние исследуемых веществ на пролиферацию клеток мышиной
меланомы линии В16-F10 99
Цитотоксичность исследуемых веществ Г02
Влияние испытуемых веществ на уровень образования полиаминов в клетках мышиной меланомы В16-F10 106
Влияние испытуемых веществ на активность ТГ в клетках мышиной меланомы B16-F10 113
Влияние испытуемых веществ на уровень образования меланина в клетках мышиной меланомы В16-F10 115
Влияние тестируемых веществ на дифференцировку клеток мышиной меланомы В16-F10 118
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 121
ВЫВОДЫ 124
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 126
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ПРИНЯТЫХ В РАБОТЕ 1565
Благодарности 156
Введение к работе
Актуальность проблемы. В процессе совершенствования методов лечения злокачественных новообразований человека на первый план в проблеме современной химиотерапии выдвигается разработка и направленный син-тез новых высокоэффективных противоопухолевых агентов. В последнее время арсенал применяемых в клинике противоопухолевых средств значительно расширился, однако большинство из них остаются малоэффективными и высокотоксичными.
В настоящее время стало очевидным, что методология подходов разработки новых перспективных химиотерапевтических соединений направленного действия с заранее заданными свойствами должна базироваться на фундаментальных исследованиях особенностей метаболизма опухолевой клетки. В этом отношении обмен полиаминов (ПА), являющихся эссенциальными факторами процессов клеточного роста и дифференцировки [143, 255], с учетом активности трансглутаминазы (ТГ) [193] может служить, удобной и надежной мишенью для поиска и конструирования противоопухолевых агентов, в частности, в качестве специфических ингибиторов ТГ и регуляторов активности ключевых ферментов обмена ПА.
Была высказана гипотеза о том, что аналоги ПА способны замещать эндогенные ПА в клетке в участках связывания. Это приводит к нарушению функций внутриклеточных ПА [234]. Исследования ограничились аналогами ПА алифатической структуры [270]. Однако предварительные результаты показали, что онкопротекторной активностью могут обладать также гетероциклические соединения, в частности, бис-уридильные [266], азафлуорено-вые и бензимидазольные [29] производные, а также алкалоиды [207]. Выбор данных веществ был обусловлен тем, что в их структуре можно выделить по-лиаминовые фрагменты. Изучение характера и степени влияния названных веществ на ключевые ферменты обмена ПА позволит сделать предположение об их возможном канцерогенном или противоопухолевом действии.
Цель исследования. Изучение биологических (антипролиферативных и антиопухолевых) и биохимических свойств структурных аналогов ПА из числа гетероциклических соединений оригинального синтеза.
Задачи исследования
Изучение влияния производных бензимидазола и азафлуорена на основные показатели обмена ПА на бесклеточных тест-системах из тканей с повышенной клеточной пролиферацией.
Определение действия производных анилина и диоксаборенинопи-ридина на скорость окислительного дезаминирования ПА на бесклеточной тест-системе из ткани регенерирующей печени крыс.
Оценка антинеопластических свойств, производных азафлуорена, пиперидона и метилксантина на клеточной модели из мышиной меланомы линии B16-F10.
Научная новизна работы. Проведено сравнительное исследование влияния ряда гетероциклических соединений оригинального синтеза на ме-таболизм ПА в бесклеточных тест-системах, на скорость пролиферации и на дифференцировку клеток мышиной меланомы линии B16-F10. Результаты экспериментов позволяют впервые выявить и рекомендовать для дальнейшее го исследования биологических свойств ряд синтетических аналогов ПА в качестве потенциальных противоопухолевых средств.
Практическая значимость работы. Полученные результаты могут быть использованы для формирования базы данных при разработке программного обеспечения расчетов связи «структура-активность» для компьютерного моделирования химических структур с заданными биологическими свойствами, в частности, с антипролиферативным и противоопухолевым действием.
Определены группы веществ из числа исследованных гетероциклических соединений, которые позволяют прогнозировать перспективные направления дальнейшего синтеза соединений с повышенным терапевтическим эффектом действия.
Выявлены вещества с выраженной противоопухолевой активностью, которые рекомендованы для дальнейших клинических исследований в области онкологии, и подлежат патентированию.
Положения, выносимые на защиту
Канцерогенные свойства производных диоксаборенинопиридина и бензимидазола. Пролиферативные свойства производных пиперидона. Ан-типролиферативные свойства производных анилина. Онкопротекторные свойства и свойства индукторов клеточной дифференциации производных азафлуорена и ксантина.
Перспективность дальнейших исследований производных азафлуорена и ксантина в качестве потенциальных противоопухолевых средств.
Превосходство в эффективности действия производных азафлуорена над остальными исследованными гетероциклическими соединениями.
Связь исследований с научной программой. Работа проведена в рамках темы НИР РУДН «Исследование структуры и биологической активности ферментов с антиопухолевой активностью» № 01.2.00 105254 и темы НИР: № 030507-1-173 «Исследование противоопухолевых свойств новых биологически активных препаратов и создание отечественной иммунолипосомальной"; системы направленного транспорта лекарств».
Исследования, в рамках научной стажировки, проводились в лаборатории клеточной биологии Второго Римского университета «Tor Vergata» под руководством профессора Симоне Бенинати (2006-2007 гг.), поддержанные грантом президента Российской Федерации в 2006 году.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на 9 конгрессах и конференциях, в том числе на 6 международных.
Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на 9-ом Международном конгрессе по аминокислотам (Вена, Австрия, 2005); на 4-ой Международной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы спортивной медицины, лечебной физической культуры, физиотерапии и курортологии» (Москва, 2005); на Итоговой конференции меди-
7 цинского факультета Российского университета дружбы народов «Клинические и теоретические аспекты современной медицины» (Москва, 2005); на Межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 85-летию самарского государственного медицинского университета «Новая идеология в единстве фундаментальной и клинической медицины» (Самара, 2005); на Всероссийской научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Перспектива-2006» (Нальчик, п. Эльбрус, 2006); на 20-ом Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии IUBMB и 11-ом FAOBMB конгрессе (Киото, Япония, 2006); на Международной конференции «Роль полиаминов и их аналогов, в раковых и других заболеваниях» (Тиволи, Рим, Италия, 2006); на 15-ой Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, 2007); на 10-ом Международном конгрессе по аминокислотам и белкам (Каллитея, Греция, 2007).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ, в том числе 6 в рецензируемых журналах:
Golomazova К., Syatkin S., Svinarev V., Fedoronchuk Т., Shevchenko А. Carcinogenic and Carcinostatic Properties of Psychotropic Medications II Amino Acids - Springer Wien. -New York, 2005. - Vol. 29(1). - P.20-21.
Шевченко A.A., Голомазова K.A. Канцерогенные свойства психотропных препаратов // Материалы четвертой международной конференции студентов и молодых ученых: Актуальные вопросы спортивной медицины, лечебной физической культуры, физиотерапии и курортологии. - М.: РГМУ, 2005. - С. 45-46.
Голомазова К.А., Шевченко А.А. Пролиферативные свойства синтетических аналогов полиаминов // Материалы четвертой международной конференции и молодых ученых: Актуальные вопросы спортивной медицины, лечебной физической культуры, физиотерапии и курортологии. - М.: РГМУ, 2005. - С. 27-29
Шевченко А.А., Голомазова К.А. Влияние структурных аналогов полиаминов на скорость окислительного дезаминирования путресцина, сперми-
8 дина и спермина в ткани регенерирующей печени крыс // Материалы итоговой научной студенческой конференции. - М.: РУДН, 2005. - С. 109-110.
Сяткин СП., Голомазова К.А., Левов А.Н., Федорончук Т.В., Свина-рев В.И., Шевченко А.А., Березов Т.Т. Канцерогенные и канцеростатические свойства производных бензимидазола и азафлуорена как структурных аналогов полиаминов // Материалы- межрегиональной научно-практической- конференции, посвященной 85-летию самарского государственного медицинского университета: Новая идеология в единстве фундаментальной и клинической медицины. - Самара: 2005. - С. 389-393.
Шевченко А.А. Доклинические исследования структурных аналогов полиаминов-как потенциальных противоопухолевых агентов // Материалы всероссийской научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Пер-спектива-2006». - Нальчик: Каб.-Балк.ун-т., 2006. - С. 87-91 (0,4 п.л.). ,
Berezov Т., Syatkin S.,Golomazova К., Levov A.JFedoronchuk Т., Svi-narev V., Shevchenko A. Carcinogenic and carcinostatic properties of benzimidazole and azafluorene derivatives as a polyamines structural analogs II The 20th IUBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology and 11th FAOBMB Congress, Kyoto, Japan (June 2006). - P. 188.
Syatkin S.P., Golomazova K.A., Levov A., Fedoronchuk T.V., Svinarev V.L, Shevchenko A. A., Berezov T.T. Quantitative evaluation of benzimidazole and azafluorene derivatives influence on polyamine metabolism as potential antitumor agents II International Conference on the Role of Polyamines and their Analogs in Cancer and Other Diseases, Tivoli (Rome). - Italy (September, 2006) - P. 231-232.
Frolov V.A., Syatkin S.P., Golomazova K.A., Svinarev V.L, Shevchenko A.A., Fedoronchuk T.V. The influence of psychotropic medications on polyamines metabolism in tissues with high rate of proliferation II International Conference on-the Role of Polyamines and their Analogs in Cancer and Other Diseases, Tivoli (Rome). - Italy (September, 2006) - P. 217-218.
10. Lentini A., Provenzano В., CaragliaM., Shevchenko A., Abbruzzese A.
and Beninati S. Impairment of the metastatic activity of melanoma cells by trans-
9 glutaminase-catalyzed incorporation of polyamines into laminin and Matrigel. Amino Acids. - 2008. - Vol. 34, № 2 (Printed in The Netherlands). - P.251-256.
11. Натрошвили Н.Г., Неборак E.B., Шевченко А.А. Влияние производ
ных диоксаборининопиридина на скорость окислительного дезаминирования
полиаминов. // Материалы конференции итоговой конференции студенческо
го научного общества медицинского факультета РУДН: Клинические и тео
ретические аспекты современной медицины. - М.: РУДН, 2007. - С. 97.
Неборак Е.В., Натрошвили Н.Г. Шевченко А.А. Окислительное де-заминирование путресцина, спермидина и спермина на фоне действия аналогов полиаминов анилинового ряда // Материалы конференции итоговой конференции студенческого научного общества медицинского факультета РУДН: Клинические и теоретические аспекты современной медицины. - М.: РУДН, 2007. - С. 98.
Сяткин СП., Фролов В.А., Голомазова К.А., Левов А.Н., Федорон-чук Т.В., Свинарев В.И., Шевченко А.А., Неборак К.В., Натрошвили Н.Г. Применение окислительного дезаминирования полиаминов и путресцина при мониторинге канцерогенных и противоопухолевых свойств производных бензимидазола и азафлуорена // Материалы XV международной конференции: Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. - Гурзуф, 2007. - С. 92-94.
Shevchenko A., Beninati S. A new synthetic polyamine analogue reduces B16-F10 melanoma cells proliferation by the enhancement of transglutaminase activity II 10th International Congress on Amino Acids. Kallithea, Greece (August 20-25, 2007). - Amino Acids - Springer Wien. - New York, 2007. - Vol. 33. - P. 45.
Syatkin S.P., Golomazova K.A., Fedoronchuk T.V., Levov A.N., Berezov T.T., Svinarev V.I., Shevchenko A.A., Natroshvili N.G., Neborak E.V. Prediction of antiproliferative and carcinogenic properties of benzimidazole and azafluorene derivatives as synthetic structural analogs of polyamines II 10th International Congress on Amino Acids. Kallithea, Greece (August 20-25, 2007). -Amino Acids - Springer Wien. - New York, 2007. - Vol. 33. - P. 43.
Березов Т.Т., Фролов В.А., Сяткин СП., Голомазова К.А., Федорончук Т.В., Шевченко А.А., Левов А.Н. Прогноз возможных онкопротекторных и канцерогенных свойств, структурных аналогов полиаминов из группы производных бензимидазола и азафлуорена // Вестник РУДН. - 2007. - № 6. - С. 331-335.
Сяткин СП., Березов Т.Т., Фролов В.А., Голомазова К.А., Левов А.Н., Шевченко А.А., Федорончук Т.В. Прогноз канцерогенных и противоопухолевых свойств, производных бензимидазола и азафлуорена // Вестник РУДН. -2007.-№6.-С. 70-73.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 156 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов, 2-х глав с описанием результатов собственных исследований, обсуждения результатов и выводов. Список литературы включает 274 источника, из них 235 зарубежных и 39 отечественных. Работа иллюстрирована 70 рисунками и 24 таблицами.
