Энзимопатология герпетического кератита Терехина, Наталья Александровна

Введение к работе

Актуальность проблош. Выяснение механизмов взаимодействия вируса и инфицированного им организма - фундаментальная проблема биохимии и но менее ватная проблема медицины. Это касается*и самой распространенной вирусной инфекции герпетичоскоіі.

. Вирус простого герпеса /ВПГ/ вызывает длительную, преимущественно латентную mtfteKinro с более или менее частыми обострениями. 60$ детой до 3-5 лет и 90 людой старше 15 лет заражено ВПГ в латентной форле /Еарииский II.. с соавт., 1986 ; jcauftnen » Rayfield t 1988/. ВПГ первого типа /ВПГ-І/ чаще всего поражает коду, слизистую оболочку полости рта, глаз, мозг. Инфекция ВПГ второго типа /ВПГ-2/ передается в основном половым путем и преимущественно поражает геюгталии у'взрослых и головной мозг у новорожденных.

Герпетическим кератитом в СССР ежегодно страдают 300 000--500 000 человек Д'аДчук Ю.Ф., ID8I ; Каспаров А.А., 1285/.Большинство герпетических поракений приходится на рецидивирующий оО/гальмогерпес. Дало при использовании лучших противовирусных препаратов удаотся излечить не более 2/3 больных герпетическим кератитом /Каспаров Л.А., 1987/. При этом у многих больных с длительным рецидивирующим герпетическим кератоиридоциклитом на-блгодпптся тятолне осложнения.

По-видимому, неполноценность лечения и прогнозирования рецидивов герпетического кератита в известной мере связаны о недостаточностью сведений по биохимии герпетической инфекции. Биохимия взаимодействия НІГ с клетками изучена недостаточно, в, частности, это касается ферментных механизмов. Биохимия латентного состояния в нервной системе, в клетках крови а механизмов, он|ч;доляших рецидиви герпетической инфекции, мало исследована. Сведении о цермонтах лимфоцитов пря офтальмогерпесе в литературе мы не нашли. Имеется небольшое количество работ, в которых началась активность ферментов тканой глаза кролика при оерталь-!*ого]иіесе /Потрогич Ю.А., ТорехинаЛІ.А., 1976; Терехина Н.А., И-77 ; Ми!їч;,к В.Г., K8I; Касавина B.C., 1082 ; Чосиокова Н.Б. о соапт., 1981 ;Crmrbeli «,л_ч IC80 ; Birkl» et »1. і 1986/. ^:1ало исследовало аіпт.оксидантная система /АОС/ роговицы, активность j.epr.reifTOB олега при оітальмогорпесе. Отсутствуют данные'

U^r биохимии роговицы человека при этом заболевании.

Вместе с тем, изучение 8НЗИМОЛОГІШ вирусной инфекции перспективно не только для фундаментальной; биохимии, молекулярной биологии,-экспериментально:! вирусологии, но может быть полезным для научно обоснованных диагностики, лечения и прогнозировашш вирусных болезней.

Цель и загачи исследования. Целью данной работы явилось изучение энзимологии герпесшфицировшшого глаза, слезы, лимфо-цигов периферической крови для установления биохимических звеньев патологии при герпетической кератите, а токае для обліки эффективности лечения и прогнозирования рецидивов.

Соответственно цели били поставлены задачи:

1. Изучить активность рада дегидрогеиаз в роговице человека при различных клинических формах герпетического кератита, провести гистохимический и ультрадатохишческии апаш з аерменгов здоровой и герпесинхіицировашюЛ рогоь;и,ы кролика, _>. тшсде о.:роде-лить содерсание ряда метаболитов углеводного обмена в глазу.

2. Изучить активность дегидрогеиаз, йосчатаз, гликозидаз слезы человека при разных клинических формах герпетического кератита в динамике заболевания. Использовать полученные результаты для прогнозировашш роцидива герпетического кератита и оценки эффективности его лечения.

3. Исследовать свободнораднкалыюо окисление /СРО/ и антиоксидантную систему /АОС/ здоровой и герпесинфицировшшол роговицы, слезы, лимфоцитов, периферической крови человека и кролики ири офтальмогерпесе.

4. Провести энзимологическое исследование лимфоцитов периферической крови большие герпетический кератитом в диншико заболевания и при кератитах другое, негврпетіїчоскоіі этиологии.

б. Изучить включеіше антивирусного препарати !;-ііод-2'-два-оксиуридина /ИДУ/ в роговицу здоровой крысы и его изменение при герпетическом кератите.

Научная новизна. Вперше у человека определена активность ферментов здоровой и герпесшщицировшшол рогошиі. Проведены внашолоічічаскио исследования слоаи и лим.о^итов пери^еричиской кров* в динамике инфекции. Бпервыэ установлена ультраструктурний локализация ферментов в эдороной роговице и ее изменения ара о>-тальюгерпосе.

Ііок&заио, что метаболизм їкішоіі гд-ан v .цлшігжи герпвтиче-

ской инфекции перостраивается в связи с реашзацнеіі генетической информации пируса. Впорвие определены изменения содержания мета--Эолитов углеводного обшна и повышение віслючегаот ВДУ, печенного ' J » ^D роговицу при герпетическом кератите.

Отмочено, что разные методи получоїпи слези могут привести к различным результатам. Отработаны оптимальные условия сбора слезы для ферментной диагностики. Впервые прогнозировали рецидив- герпетического кератита по активности ферментов слезы.

Впервые при разішх формах офтальмогорпоса в динамике забо-левшшл в лимфоцитах и сыворотке крови изучена активность окси-доредуктаз и фосфатаз. Проведен сравнительный анализ активности ферментов лимфоцитов при кератитах различной этиологии /герпетических, адонопирусігах, травматических/.

Впервые исследованы ферменты A0G глаза, слезы, лимфоцитов при герпетическом кератите у человека и кролика. Изучено влияние па их активность шггиоксидаптоп селенита натрия, оС-токоферо-ла, аскорбиновой кислоты.

Установлены при герпетическом кератите интенсификация хемп-лымипесценции /ХД/ в роговице и лимфоцитах крови, падение активности антиоксидантних /АО/ ферментов, изменошш диэлектрических характеристик, потеря слезой человека способности ингибироват* образованно гидроксилраднкала, исчезновение из слезы аскорбиновой кислоты.

Выявлен ряд патохимических звеньев герпетического поражения: иумоиягатся окясллтолыю-восстаповитолыше процессы, падает АО защита роговицы, лимфоцитов, нарушается.ингибироваїше образова-ния гидроксилрадикала слезой, усиливается СРО, нарушается проницаемость не только гемато-офтальмпчоского барьера, но и клеточ-mix и митохондркалышх мембран.

Прпктичоскач ценность. Исследование слезы важно не только'в тооретичоском плане для биохимии и медицины. Оно имеет диагностическое и прогностическое значение в офтальмологии и других раз- долах медицины.

При незначительной репллкации^вируса в роговице и внешне практически здоровом глазу в период ремигекк мифвкции ВПГ по активности дегидрогеназ в слозе можно прогнозировать рецидив герпетического кератита. "Способ прогнозирования рецидива герпетического кератита" задачей А.С. JE 1320755 /1987г./. ЭЙ&вКТИВ—' ность внедрогош способа в том, что даже при отсутствии клиничоо-

- * -

к¹-: признаков можно, проведя своевременно предупредительную терапию, избегать рецидива.

На патогенетическом значении резкого снижения АО защити роговицы, падения в ней содержания аскорбиновой кислоты, АТФ при герпетическом кератите основан предложении!! наш совместно с офтальмологами способ, его комплексного лечения путем внутриорган-ного электрофореза /Э2>/ аскорбиновой кислоты, АТФ и фонофореза .<-токоферола. Способ сокращает сроки лечения, повшает остроту зрения, может бить применен при разных формах герпетического кератита.

На основании обнаружения близкого содержания мочовиїш в олезе и крови подана заявка # 4375429/28-14 на "Способ диагностики урешш" с помопіью опредолешш мочевины в слозо. Боложитолыюо решение по ней о выдаче авторского свидетельства от 17 марта IS8S года.

' Внедрение в практику результатов исследования. Утверждены 1В РСФСР и разосланы методические рекомендации "Прогнозирование рецидивов герпетического кератита с помоцью определения в слозо активности ферментов"/I988/. Этот способ прогнозирования внедрен в практику глазных отделений Пермской областной клинической больницы, на кафедрах глазных болезней Пермского, Ияевского, Полтавского медицинских институтов.

Способ комплексного лечения герпетического кератита с вклзр.-чеиием антиоксидантов внедрен в практику глазных отделений Пермской областной клинической больницы, на кафедро глазных болезней Пермского медицинского института. Написаны методические ]>екомон-даиди /1988/.

Материалы диссертации внедрены'при чтении лекций на кафедрах биохимии Московского медицинского стоматологического института, Порлского, Ижевского медицинских институтов, на ка; одрах глазных болезней Порлского, ІЬхевского и Полтавского медицинских институтов.

, ролояонип. выдвигаемые на заїтату.

1. Знание внзимологии герпетического нораменля позволяет на

ОТрОГО Объективной ООНОВЄ НЗЫСКИВаТЬ НОВІШ СГОССМ'Н .'ХЧі'НИЛ и

прадупрездения отой юфекцин.

2. Еиохимичеокне показатели слезы отратот состояние не то
лько тканой і\лаза, но и всего оргашізш. С их помошьо можно оце
нивать состояние шіогіи спетом организма в целое прогноза, диаг
ноза и характеристики лочеакя.

3. Биохимические и ульграцитохимические данные подтвердили наличие субкллнически протекающего процесса во внешне здоровом контрлатеральном глазу.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены: на 3 и 4 Всесоюзних симпозиумах по медицинской энзнмолопш АМН СССР /Астрахань, 1979 ; Алма-Ата, 1983/, 5 совещании по проблеме "Гисто-. тематические барьеры" Alt СССР /Москва-, 1978/, 5 и 6 Всесоюзных съездах офтальмологов /Ташкент, 1979 ; Ашхабад, 1985/, 3 Всероссийском пленуме по трансплантации и гомосорбции /Москва, 1980/, на Всесоюзной конференции патофизиологов /Киев, 1981/, на конференции офтальмологов Западной, Восточной Сибири и Дальнего Востока /Владивосток, 1983/, на Всесоюзном симпозиуме "Пентозофос-фатний путь препращешш углеводов, ого механизмы и регуляция" /Калинин, 1984/, на 5 Всесоюзном симпозиуме "Циклические нуклео-тпда и система регуляции ферментативных реакций" /Рязань, 1985/, па 3 Всесоюзном симпозиуме с Швдународным участием "Структура и функция лизосом" /Тбилиси, 1986/, на научных конференциях биохимиков Урала и Западноіі Сибири /Тюмень, 1982 ; Пермь, 1984 ; Свердловск, 1985/, на I и 3 Всесоюзных конференциях "Биоантиоксидант" АН СССР /1983, 1989/, на 4 конференции "Ультраструктурные основы патологии органов и тканей" /Тбилиси, 1989/, на 4 Всесоюзном оъезде патофизиологов /Кишинев, 1989/, на Всесоюзном совещании "Транспорт кислорода и антиоксидаотная система" /Гродно, 1989/, на совместном заседшпга кафедр биохимии, микробиологии, глазных болозпоіі, ІДІИЛ, патофизиологии Пермского медицинского института /Пормь, 1989/, на совместном заседании кафедр биохимии, физиологии, ЩйИ Псковского медицинского стоматологического института /1089/, на научной конференции кафедра биохимии медицинского фа-культота Ушгоорситота Дружби народов пм.П.Лумукбы /1990/. '

Структура и объем работу. Диссертация излолена в основном-томе па 350 страницах машинописи, содержит 61 рисунок и 38 таблиц. Том состоит из введения, обзора литературы, описания объек-< тов и методов псслодоваши, результатов и пх обоуяденпя, выводов; практических рекомендаций. Список цитированной литературы включает 556 наименований, из них 125 отвчоствешшх авторов, 431 иностранный. Приложение в отдельной тош на 119 отраняцах, содерзят 109 таблиц.

- б -

' Объекта и метоли исследование. ОІтальмогерпес у кролика -наиболее близкая к естественной ингекции человека модель. Исследовали 180 здоровых и герпесинфицировшшых взрослых кроликов порода шиншилла. Наносили 2 кашш жидкости с ШГ-І штамм VR /титр 4,0 lgim 50/мл/ на анестезироваїшую 1% раствором дшшина скарифицированную правую роговицу. Через 2, 5-7, 14 дней после этого исследовали эпителий, строму, эндотелий роговицы, радужку, хрусталик, водянистую влагу.

Исследовали также эпителий и строму дисков 44 роговиц, удаленных офтальмологами при послойной кератопластике у людей с тяжелыми герпетическими кератоиридоциклитами после безуспешного консервативного лечения. Исследовали слезу, сыворотку и лимфоциты периферической крови 189 больных герпетическим кератитом. Контроль --слеза, лимфоциты и сыворотка крови 218 здоровых доноров, а также роговицы 15 здоровых людей, взятые через 2 часа после смерти при транспортных авариях.

Кровь и слезу получали со станций переливания крови, глазных отделений областной клинической больницы и других лечебных учреждений города Перми. Лимгоциты из 4 мл периферической крови выделяли методом разделения в градиенте плотности фиколл-веро-графин /а=1,077 г/л/ по Воуші /1968/.

Нами отработаны оптимальные условия сбора слезы. Стимулировали слезоотделение поднесенным к носу комочком виты, смоченной IDS? раствором нашатырного спирта. Не кас&чсь глаза, чтобы избодать даже небольшой микрогравмы, глазной пипеткой собирали 0,Элл слезы о наружной поверхности нижнего вока.

Активность ферментов определяли в екстрактах тканей в в жидкостях на спектрофотометре СФ-4А и СФ-26: ДДТ /КФ І.І.І.27/ по Пепгу *.a./I960/, малатдегидрогеназы /\Щ/.- Ш І.І.І.37 по Berg -туев .Вага* /1974/, глшозо-б-фосфатдегидрогеїшзи /Г-6-іДГ/ КФ 1.1,1.49 no ЕйтиЪегБ .Horecker /1955/, гл>танатдогидро-Гйнааи /ГДДГ/ КФ J.4.I.3 - по Scheldt /1974/. кислой ^ос^тазы /W КФ S.I.S.2 по кв&ожаеЪ .Ssc*yplnakl /I9G2/. щелочной фос-фатйаі /Щ/ КФ ЗЛ.З.І по веввеу et ai. /1946/, глутитиоішор-окондавы /П10/ КФ І.ИЛ.9 по Гуткину І.%., їіотроикчу 1D.A./I9M2/. еупвроксвддисыугйзы /СОЛ/ Ш І.Ї5.І.І no Prtdovieh /1975/, Bietr* »PTidoTich /1972/, Дубинине.: ь.Е. с соаит./Г {/.

_-глгакозидазігКФ 3.2.1.2, ^-/У-ацетилглюкозамигаадазы КФ 3.2.1.30, ^-глюкуронидазы КФ 3.2.1.31 по Dengelmaier » Ноінвоп /1980/.

Содержание глюкозы определяли по Bergneyer et al.
/1970/, ішровиноградноіі кислоти по czok , Lanprecht '

/1970/, молочної! кислоти, по Hohoret /1962/, содержание моче
вины, уреазшш методом /Долвкторская Л'.ІІ., 1987/, аскорбиновой
кислоты методом индофенольного титрованіш по Tillmanu ,
HirechI932/, ингибироваиие образования гидроксилрадшсала слезой
ПО Richmond et al. /1981/ И Kuiaenga et al. /1987/.

Для анализа хеМшгоминосценции /ХЛ/ из энуклеироваюшх и замороженных жидким азотом глаз кролика но лимбу вырезали роговицы, гомогенизировали, помещали в сцинтилляциогашэ <]>лаконы с 8 мл 0,2 Н фосфатного буфера,1=7,4 на 30 минут при 370. Добавляли I мл 1% раствора Н₂0₂ и I мл 25 мМ рез0₄, регистрировали импуль-сы за 10 о на сцинтплляционном счетчике СБС-2. Для анализа ХЛ выделяли лимфоциты из 10 мл крови кролика по Воутст /1968/, доводили концентрацию до 7«10 в I мл и добавляли их к 7 ил раствора Хэнкса. Далее методика на отличалась от анализа ХЛ роговицы.

На автоматическом двухкаиалыюм диэльспоктрометрэ регистрировали частотные характеристики диэлектрической проницаемости"и фактора диэлектрических потерь роговицы.

Гистохимичоскл в здоровой и. горпесипфицировшшой. роговице кролика изучали распределение ЛДТ по Рангов /1972/, КФ по so -1%ааа, Kanholrasr /1949/, АТФ-азы, б'-нуклоотидази по _ЯаоЬ -ateln Маівві /1957/.

Ультрацптохимичвский анализ КФ, АТФ-азы, Б'-пуклеотцдазы в роговице проведен по Н.Б.Бухвалову /1982/, ЛДГ по Hanfcer. /I97Etf Просмотр проводили в электронном микроскопе JEM 100-ЗХ и Тезі» B^s-540. Научішй консультант по электронной микроскопии я ультрацитохимии ферментов профессор И.Б.Еухвалов /зав.лаб.олектроппрй микроскопия НППІ биотехнологии/.

Герпетическую природу заболевания подтверждали пряглм методом флюоресцирующих антител, выявляя антиген ПІТ в соокобе коиь-югастипи больного герпетическим кератитом ио Муравьевой Т.В. /І9С8/. Цифровой материал обработан статистически о педадьи t-крнтерпя Стыпдопта.