Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 8
"Рековерин и другие паранеопластические антигены" 8
1. Рековерин 8
1.1. Рековерин как белок зрительной трансдукции 8
1.1.1. Тканевая и клеточная локализация 8
1.1.2. Основные характеристики 10
1.2. Рековерин как паранеопластический антиген 12
1.2.1. Аберрантная экспрессия рековерина в опухолях и клеточных линиях 13
1.2.2. Современные представления о причинах развития паранеопластической дегенерации сетчатки у онкологических больных 14
1.2.3. Модельные системы CAR-синдрома 16
1.2.4. Механизмы паранеопластической дегенерации сетчатки 17
1.2.5. Влияние аберрантной экспрессии рековерина
на процессы, происходящие в раковых клетках.. 19
2. РНК-связывающие белки и соответствующие им неврологические синдромы 21
2.1. Hu-антигены 21
2.2. Ri-антигены 23
3. ДНК-связывающий белок Yo-антиген и парансопластическая дегенерация мозжечка 24
4. Потенциалзависимые кальциевые каналы и миастеническии синдром Ламберта-Итона 25
5. Потенциалзависимые калиевые каналы и нейромиотония 27
6. Ацстилхолиновый (никотиновый) рецептори миастения 27
7. Амфифизин и синдром "скованного человека" 28
Материалы и методы 30
1. Реактивы 30
2. Материалы 30
3. Аналитические процедуры 31
3.1. Определение концентрации белков 31
3.2. SDS-электрофорез в полиакриламидном геле 31
3.3. Нативный электрофорез в полиакриламидном геле 32
3.4. Иммуноблоттинг 32
3.5. ELISA 33
3.6. Цитоиммуногистохимический анализ серийных парафиновых срезов опухолевых тканей 34
4. Получение рекомбинантного мири сто ил ирован ного рековерина 34
5. Получение иммобилизованных белков 36
6. Выделение поликлоналышх моноспецифических антител против рековерина 37
7. Культивирование клеточных линий 37
8. ПЦР с обратной транскриптазой 38
9. Количественный ПЦР с обратной транскриптазой 39
10. Анализ уровня метилирования ДНК при помощи бисульфитного сиквенса 40
11. Выделение р26 из тканей крысы 41
Результаты и их обсуждение 43
1. Рековерин в раковых опухолях и нормальных тканях 44
1.1. Экспрессия рековерина в злокачественных опухолях 44
1.1.1. Иммуногистохимический анализ срезов опухолей легких 46
1.1.2. Анализ экспрессии мРНК рековерина в раковых опухолях 49
1.2. Экспрессия рековерина в нормальных тканях 53
2. Исследование механизмов аберрантной экспрессии рековерина.. 63
2.1. Анализ статуса метилирования области промотора и первого экзона гена рековерина в нормальных тканях и раковых опухолях ...64
2.2. Исследование влияния различных агентов на уровень экспрессии рековерина в клеточной линии рака легких 70
2.2.1. Влияние ДАЦ, ТСА и бутирата натрия на уровень экспрессии мРНК рековерина 73
2.2.2. Изменение уровня метилирования области промотора и первого экзона гена рековерина в NCI-H82 под воздействием ДАЦ...75
2.2.3. Исследование влияния ДАЦ, ТСА и бутирата натрия
на уровень экспрессии рековерина 79
3. Рековерин как потенциальный маркер злокачественной трансфомации 82
3.1. Серийный анализ опухолей легких на присутствие в них экспрессии рековерина 82
3.2. Серийный анализ образцов сыворотки крови онкологических
больных на присутствие аутоантител против рековерина 85
Выводы 95
Список литературы 96
- Современные представления о причинах развития паранеопластической дегенерации сетчатки у онкологических больных
- Потенциалзависимые кальциевые каналы и миастеническии синдром Ламберта-Итона
- Анализ экспрессии мРНК рековерина в раковых опухолях
- Анализ статуса метилирования области промотора и первого экзона гена рековерина в нормальных тканях и раковых опухолях
Введение к работе
Актуальность проблемы, Рековерин - Са+-связывающий белок позвоночных животных с молекулярной массой 23,3 кДа, состоящий из 201 аминокислотного остатка [Dizhoor et al., 1991; Lambrect, Koch, 1991]. В норме рековерин локализован в фоторецепторных клетках сетчатки глаза, где Са2+ -зависимым образом регулирует фосфорилирование родопсина, ин-гибируя активность родопсинкиназы. В пределах сетчатки рековерин экспрессируется преимущественно в наружных сегментах палочек и колбочек, а также в нейронах более высокого порядка - в биполярных и ганглиозных клетках. Кроме того, рековерин обнаружен в эпифизе. В молекуле рековерина присутствуют 4 потенциальных Са2+-связывающих участка типа EF-hand; его N-конец ацилирован остатками жирных кислот [Dizhoor et al., 1992; Flaherty etal.,1993].
Рековерин также относят к паранеопластическим, или онконевральным, антигенам, которые представляют собой белки, в норме экспрессирующиеся исключительно в пределах нервной системы. Однако при злокачественной трансформации клеток экспрессия этих белков выявляется также и в опухолях, локализованных вне нервной системы. Иммунная система организма реагирует на аберрантную экспрессию нейрональных белков в опухоли выработкой аутоантител, которые в некоторых случаях могут приводить к специфическим неврологическим нарушениям, развивающимся на значительном удалении от места локализации опухоли и ее метастазов, и быть причиной развития соответствующего неврологического синдрома.
К началу данной работы было известно, что при паранеопластической дегенерации сетчатки, ассоциированной с мелкоклеточной карциномой легких (МККЛ), в крови пациентов присутствует высокий титр аутоантител против рековерина, а в опухоли экспрессируется рековерин. В то же время оставалось неизвестным,
экспрессируется ли рековерин в опухолях при немелкоклеточной карциноме легких (НМККЛ), которая составляет более 80% от всех регистрируемых случаев рака легких?
какова частота экспрессии рековерина в опухолях легких?
каковы молекулярные механизмы, лежащие в основе аберрантной экспрессии рековерина в злокачественных опухолях?
какова частота встречаемости аутоантител против рековерина при раке легких, а
также при других злокачественных заболеваниях?
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - изучение аберрантной экспрессии рековерина при злокачественной трансформации. В соответствии с этой целью в работе решались следующие задачи.
Изучение аберрантной экспрессии рековерина в опухолях легких и определение частоты этой экспрессии.
Исследование молекулярных механизмов, лежащих в основе аберрантной экспрессии рековерина в злокачественных опухолях. Определение частоты встречаемости аутоантител против рековерина в сыворотке крови пациентов с различными злокачественными заболеваниями.
Научная новизна и практическая значимость работы. В процессе выполнения настоящей работы впервые определена частота экспрессии рековерина в опухолях легких, которая составляет 76%. Получены данные, свидетельствующие о том, что мРНК рековерина может быть выявлена в тканях, не относящихся к тканям нервной системы. Установлено, что дсмстили-рование участков промотора и первого экзона гена рековерина вовлечено в регуляцию экспрессии рековерина в клеточной линии рака легких in vitro. Продемонстрировано, что ацети-лирование гистонов не участвует в проявлении аберрантной экспрессии рековерина in vitro. Показано, что аутоантитела против рековерина могут присутствовать в сыворотке крови больных различными злокачественными заболеваниями, причем наибольшая частота их встречаемости составляет 17% при раке легких.
Полученные результаты по обнаружению аутоантител против рековерина в сыворотке крови пациентов с различными злокачественными заболеваниями при полном отсутствии аутоантител против рековерина в сыворотке крови здоровых индивидов, а также тот факт, что рековерин экспрессируется в большей части проанализированных опухолей рака легких, создают основу для последующего клинического применения рековерина в качестве маркера злокачественной трансформации тканей.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на заседании кафедры биохимии биологического факультета МГУ, на семинарах НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ (НИИФХБ МГУ) и отдела сигнальных систем клетки НИИФХБ МГУ, а также на ряде научных конференций: XIII и XIV зимних международных молодежных научных школах "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2001 и 2002), Национальных конгрессах по болезням органов дыхания (Москва, 2001 и 2002; Санкт-Петербург, 2003), Европейских респираторных конгрессах (Берлин, 2001; Стокгольм, 2002; Вена, 2003) и других.
Публикации, Результаты работы представлены в 5 статьях, опубликованных в научных журналах, и в 11 тезисах докладов.
Структура и объём работы. Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Материал иллюстрирован 20 рисунками и 6 таблицами. Библиографический указатель включает 133 цитированных работы.
Современные представления о причинах развития паранеопластической дегенерации сетчатки у онкологических больных
Возможность экспрессии рековерина в ткани МККЛ была впервые продемонстрирована на пациентах с синдромом CAR [43]. Авторы этой работы сделали заключение, что экспрессия рековерина раковой опухолью может быть выявлена у больных МККЛ только при одновременном наличии у них ретинопатии и высокого титра антител против рековерина. Matsubara et al. [44, 45, 46] также показали возможность экспрессии рековерина в ткани больного МККЛ с синдромом CAR.
Позднее было также показано, что рековерин может экспресси-роваться в некоторых видах клеточных линий, полученных из опухолей различной этиологии и локализации [47]. В цитируемой работе рековерин был обнаружен в опухолевых клетках даже в тех случаях, когда паранеопластическая дегенерация сетчатки у пациента отсутствовала [47]. Авторы работы проанализировали 33 клеточные линии, при этом экспрессия рековерина была обнаружена: при раке легких в двух случаях из девяти проанализированных, при раке шейки матки — в трех из пяти, раке эндометрия - в двух из трех, раке желудка — достоверно в одной из трех, раке молочной железы - во всех трех проанализированных случаях. Также экспрессия рековерина была выявлена в одной проанализированной клеточной линии рака пищевода и в двух проанализированных линиях рака ротовой полости. Ни в одной из 3-х клеточных линий рака поджелудочной железы и ни в одной из 4-х линий рака крови экспрессия рековерина не была отмечена.
В другой работе [48] для выявления рековерина и его мРНК в образцах тканей опухолей пациентов с различными типами рака в отсутствие синдрома ретинопатии использовались методы иммуноблот-тинга и полимеразной цепной реакции (ПЦР). Всего было проанализировано 30 образцов опухолевых тканей, при этом экспрессия рековерина и его мРНК была обнаружена в 15 образцах, то есть в 50% случаев.
Таким образом, экспрессия рековерина раковой опухолью - явление нередкое, хотя при этом стоит отметить, что количество исследуемых объектов в подобных экспериментах часто не дает оснований для статистически достоверных выводов. Вместе с тем, очевидно, что частота встречаемости синдрома CAR в десятки раз меньше частоты экспрессии рековерина в опухоли (на настоящий момент во всем мире описан лишь 31 пациент с подобным синдромом). Объяснением этого различия может служить гипотеза, что синдром CAR возникает только в случае персистирования аутоантител против рековерина с высоким титром в кровотоке, тогда как при низком титре аутоантител дегенерации сетчатки не происходит. Это подтверждается данными, полученными в нашей лаборатории, которые свидетельствуют, что при раке легких в сыворотке крови пациентов присутствуют с низким титром аутоантитела против рековерина. Ни у одного из этих пациентов синдрома паранеопластической дегенерации сетчатки зарегистрировано не было.
Указание на другое возможное объяснение упомянутого несоответствия присутствует в работе Adamus et al. [49], в которой было проведено исследование, направленное на выявление иммуногенных эпитопов рековерина при синдроме CAR. Оказалось, что мажорный иммуногенный эпитоп рековерина представлен фрагментом, вклю-чающем 64-70 аминокислотные остатки во втором Са -связывающем участке, а минорный иммуногенный эпитоп присутствует в этом же участке, но в другом фрагменте: 35-45 аминокислотные остатки. Кроме того, у некоторых пациентов были обнаружены аутоантитела против 1-Ю, 1-20, 81-90, 121-130, 151-160, 171-180 аминокислотных остатков молекулы рековерина. Эти результаты согласуются с данными по определению иммуногенных эпитопов рековерина с использованием моноклональных антител против рековерина, представленными в этой же работе. На основании полученных данных авторы работы [49] сделали вывод, что синдром CAR развивается только в случае генерации аутоантител против мажорного эпитопа рековерина (64-70 аминокислотные остатки). Соответственно, можно полагать, что за развитие ретинопатии отвечают аутоантитела, выработанные против мажорных эпитопов, а в случае персистирования в сыворотке крови больных аутоантител против рековерина, выработанных против минорных эпитопов, дегенерации сетчатки не происходит.
Еще одно возможное объяснение несоответствия между частотами экспрессии рековерина и проявлением синдрома CAR может быть предложено на основании работы Maeda et al. [47]. Авторы этой работы показали, что рековерин экспрессируется в ткани неонаталь-ного тимуса, т. е. рековерин на самом деле, возможно, и не является для иммунной системы совсем "незнакомым" белком. Если это действительно так, то появление аутоантител против рековерина, как и развитие паранеопластического синдрома, определяется комплексом факторов, а не только экспрессией рековерина в раковой опухоли.
Gery et al. [50] показали, что иммунизация рековерином крыс Льюиса вызывает у них воспалительный процесс, увеит, причем, этот эффект зависел от дозы антигена. Высокие титры антител против рековерина у подопытных животных приводят не только к воспалительным процессам, но и к дегенерации сетчатки [51]. Кроме того, найдено [51], что перенос стимулированных лимфоцитов, полученных от предварительно иммунизированных животных неиммунизированным особям, также приводит к дегенерации фоторецепторного слоя сетчатки. Тем самым была продемонстрирована возможность моделирования процесса аутоиммунной дегенерации сетчатки под действием аутоантител, выработанных против рековерина. На основании описанных результатов авторы работы [51] предположили, что те же процессы могут происходить и у пациентов с синдромом CAR.
Более доказательный подход использовал Thirkill [52], который привил культуру клеток МККЛ NCI-H69, экспрессирующую рекове-рин, подопытным животным и наблюдал появление у них аутоантител против рековерина (ААР) в сыворотке крови и развитие дегенерации сетчатки. Таким образом, результаты работ [51, 52] доказывают, что именно появление аутоантител против рековерина в сыворотке крови приводит к паранеопластическому синдрому CAR.
Потенциалзависимые кальциевые каналы и миастеническии синдром Ламберта-Итона
В работе использовали Трис, глицин, ДТТ, СаСЬ, ЭГТА, 3,3 -диаминобензидин, масляную кислоту, тиазолиновый голубой, полный адъювант Фрейнда, стерильный 0,02%-ный раствор ЭДТА, антитела, выработанные против иммуноглобулинов человека и коньюгированные с пероксидазой хрена, производства Sigma; персульфат аммония, акриламид, метиленбисакриламид, TEMED, Кумасси ярко-голубой Servablue G производства Serva; нитроцеллюлозные мембраны с размером пор 0,22 цм производства МШіроге; ВrCN-активированную агарозу, фенилсефарозу, нитроцеллюлозные мембраны Hybond-C extra, антитела, выработанные против иммуноглобулинов кролика и коньюгированные с пероксидазой хрена, ECL-system производства AmershamPharmaciaBiotech; бычий сыворочный альбумин, TWEEN 20 производства Ferak; среда RPMI-1640 с глутамином, гентамицин 0,1 производства ПАНЭКО; фетальная сыворотка теленка производства Gibco; "ABC kit vector, CA, DAB kit" производства Dianova; Enzo ApopDetek cell death assay system производства Enzo Diagnostics.
Образцы сыворотки крови пациентов с диагнозом рак легких и эпикризы пациентов были предоставлены академиком РАМН А.Г. Чучалиным и к.м.н. О.Н. Шифриной (Институт пульмонологии Минздрава РФ); образцы сыворотки крови пациентов с различными злокачественными и нераковыми заболеваниями и их эпикризы были предоставлены академиком РАМН Н.Е. Кушлинским (НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН) и к.б.н. М.Ю. Гончарской (НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН); образцы сывороток хранили при температуре -70С Парафиновые срезы операционного материала МККЛ и НМККЛ были предоставлены д.м.н. Е.А. Коган (кафедра патологической анатомии Московской медицинской академии им. И.М, Сеченова РАМН). Образцы кДНК здоровых (легкие, молочная железа, кожа) и раковых (легкие, молочная железа, меланома) тканей и клеточных линий, а также образцы нормальной кожи и меланомы были предоставлены В. Lethe и М. Swinarska.
Концентрацию рековерина определяли спектрофотометрически, принимая коэффициент молярного поглощения раствора белка при Х=280 нм, равным 36500 [113]. Определение концентрации белка в клеточных экстрактах проводили по методу Брэдфорда [114], используя в качестве стандарта бычий сыворочный альбумин.
Электрофорез в ПААГ в присутствии SDS проводили по методу Лэммли [115] при концентрациях разделяющего и концентрирующего гелей, равных 12,5% и 4%, соответственно. В качестве стандартов молекулярных масс использовали набор белков: фосфорилаза b (94 кДа), бычий сывороточный альбумин (67 кДа), овальбумин (43 кДа), карбо-ангидраза (30 кДа), ингибитор трипсина из соевых бобов (20,1 кДа) и а-лактальбумин (14 кДа). Белки в электрофоретическом геле окрашивали Кумасси ярко-голубым в присутствии 10%-ной уксусной кислоты и 20%-ного этанола, несвязавшиися краситель отмывали смесью вода - уксусная кислота - этанол в соотношении 7:1:2 (v/v). 3.3. НативныЙ электрофорез в полиакриламидном геле.
Нативный электрофорез в ПААГ проводили при концентрации разделяющего и концентрирующего гелей, равных соответственно 10% и 4%, без добавления SDS в буферы. После проведения электрофореза гели фиксировали в течение 15 мин в 15% трихлоруксусной кислоте, после чего окрашивали их Кумасси ярко-голубым в присутствии 10%-ной уксусной кислоты и 20%-ного этанола, несвязавшийся краситель отмывали смесью вода - уксусная кислота - этанол в соотношении 7:1:2 (v/v).
Иммуноблоттинг проводили как описано в [47] следующим образом. После электрофореза гель, содержащий образцы белков, помещали на нитроцеллюлозную мембрану "Hybond-C extra"; далее следовал перенос белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану в буфере для блота (0,3% Трис, рН 7,5, 1,44% глицин в 20%-ном этаноле) при постоянной силе тока 300 мА в течение 1 часа, после чего белки, связавшиеся с нитроцеллюлозной мембраной, окрашивали Ponseau S. Затем мембраны инкубировали в 10%-м растворе сухого обезжиренного молока в 20 мМ Трис-HCl буфере (рН 7,5), содержащем 500 мМ NaCl и 0,05% TWEEN 20 (буфер А), в течение 1,5 час. Далее мембраны инкубировали в присутствии антител против рековерина (в концентрации 1 мкг/мл) в буфере А в течение 1,5 час, либо с исследуемой сывороткой крови пациентов (при начальном разведении сыворотки 1:20 в буфере А) в течение 12 час, после чего мембраны отмывали от несвя-завшихся антител. Окрашивание проводили при помощи вторичных антител, полученных против иммуноглобулинов кролика или человека (разведение 1:1000 в буфере А), ковалентно связанных с перокси-дазой хрена; далее следовало промывание буфером А для удаления несвязавшихся с нитроцеллюлозной мембраной белков. Все описан ные процедуры проводили при комнатной температуре при перемешивании. Окрашивание белков» связавших меченые иммуноглобулины, проводили в 10 мл "проявляющего" буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 7,2, содержащий 0,5 мг 3,3 -диаминобензидина) с последующим добавлением 50 мкл 30%-ноЙ перекиси водорода. Для усиления интенсивности реакции использовали систему хемилюминесцентного усиления сигнала (ECL-system). 3.5.ELISA.
Иммуноферментный анализ методом ELISA проводили согласно [116]; ниже приводится подробное описание процедуры.
Для определения антител в каждую ячейку планшета для имму-ноферментного анализа помещали 0,2 мл раствора рековерина в концентрации 5 мкг/мл в буфере В (20 мМ Трис-HCl, рН 8,5, содержащий 150 мМ NaCl и 1 мМ CaCl;), инкубировали планшет в термостате при 37С в течение 45 мин, после чего следовало 3-кратное отмывание буфером С (20 мМ Трис-HCl, рН 7,5, содержащий 150 мМ NaCl и I мМ СаСЬ). Блокирование свободных мест связывания проводили 10%-м раствором сухого обезжиренного молока или 0,1%-м раствором бычьего сывороточного альбумина в буфере В при 37С в течение 45 мин, затем планшеты отмывали как описано выше. Исходную сыворотку или поликлональные (моноспецифические) антитела разводили буфером С, соответственно, в 20 или 100 раз, затем последовательно двойным разведением титровали сыворотку в планшете приблизительно до разведения, соответственно, в 3000 или 24000 раз, инкубировали планшет в термостате при 37С в течение 45 мин, после чего следовало отмывание как описано выше. Далее рабочий раствор вторичных антител в 50 мМ Na-бикарбонатном буфере (рН 9,5) добавляли в каждую ячейку планшета, инкубировали в термостате при 37С в течение 45 мин и далее отмывали планшет буфером С в присутствии 0,05% TWEEN-20 три раза по 5 мин. Окрашивание проводили 5 -аминосалициловой кислотой в концентрации 1 мг/мл в 25 мМ Na-бикарбонатном буфере (рН 6,0) в присутствии 0,001 М перекиси водорода. Интенсивность окрашивания измеряли спектр о фотометрически при длине волны 450 нм.
Анализ экспрессии мРНК рековерина в раковых опухолях
В предыдущей главе мы показали, что рековерин способен экс-прессироваться не только в раковых опухолях, но и в нормальных тканях, не относящихся к нервной системе. При этом количество мРНК, определенное нами в образцах нормальных тканей, было в несколько раз меньше количества мРНК в соответствующих опухолях. Отметим, что при наличии в литературе некоторого количества клинических данных о связи аберрантной экспрессии рековерина и пара-неопластического синдрома CAR, встречающегося при раке легких, данные о возможных механизмах этой экспрессии отсутствовали вовсе. В связи с этим возникла необходимость исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе аберрантной экспрессии рековерина в злокачественных опухолях, а именно, определение причин отмеченного нами увеличения количества мРНК рековерина в опухолях: возникает ли она в клетках, до злокачественной трансформации не экспрессировавших рековерин, или подобное увеличение происходит за счет роста популяции клеток, которые экспрессировали рековерин и в нормальном состоянии.
Известно, что увеличение синтеза белков в тканях в процессе развития или при злокачественной трансформации может быть связано с такими процессами, как деметилирование CpG-участков в гене соответствующего белка [124] или ацетилирование гистонов [125]. Также регуляция может осуществляться за счет факторов транскрипции и трансляции. При этом процесс экспрессии гена может регулироваться как исключительно одним, так и несколькими механизмами одновременно. Ген рековерина человека локализован на коротком плече хромосомы 17р13.1 [25, 126]. Промотор гена рековерина относится к классу промоторов, бедных CpG-парами. Известно, что тканеспецифичные гены с промоторами такого типа часто демонстрируют высокий уровень метилирования в тканях, где они не экспрессируются, по сравнению с тканями, в которых осуществляется их экспрессия [127].
Нами было выбрано 13 CpG-участков из области промотора и первого экзона гена рековерина, метилирование которых потенциально могло быть причиной «молчания генов», реализующегося в нормальных тканях. Для того, чтобы выяснить, вовлечено ли деметили-рование выбранной нами области промотора и первого экзона гена рековерина в возникновение аберрантной экспрессии гена рековерина в раковой опухоли, необходимо было определить статус метилирования области промотора и первого экзона гена рековерина в нормальных тканях и раковых опухолях, а также в клеточных линиях, экс-прессирующих рековерин. Кроме того, мы попытались ответить на вопрос, принимает ли участие в регуляции экспрессии гена рековерина деацетилирование гистонов.
Анализ уровня метилирования участка промотора и первого экзона гена рековерина в нормальных и трансформированных тканях проводили, используя метод бисульфитного сиквенса [120], В основе этого метода лежит тот факт, что обработка ДНК бисульфитом приводит к трансформации всех цитозинов в урацилы; в случае же если цитозин метилирован, то превращения его в урацил не произойдет, что и выявляется при последующем сиквенсе.
Мы исследовали уровень метилирования в нормальных тканях легких, кожи, почки, кишечника, периферических лимфоцитов крови (ПЛК) и семенников. Амшшфицированные фрагменты ДНК, обработанной бисульфитом, клонировали и 9-11 клонов для каждой ткани были секвенированы. По результатам сиквенса был построен профиль метилирования промотора и первого экзона гена рековерина в нормальных тканях (рис. 10). Из рисунка видно, что изучаемый участок ДНК в области промотора гена рековерина в каждой из проанализированных здоровых тканей сильно метилирован.
Мы определили уровень метилирования исследованного локуса для каждого CpG-участка. Результаты представлены в виде диаграммы (рис. 11). Как видно из рисунка, практически все сайты CpG во всех проанализированных клонах метилированы более чем на 80%. Исключением являются динуклеотиды CpG в позициях 44, 56 и 84 клонов легких и кишечника, где было найдено лишь 55% метилирования (отметим также, что уровень метилирования всех CpG-участков легких и кишечника, в целом, был меньше уровня метилирования в остальных проанализированных тканях, однако эта разница статистически недостоверна).
Таким образом, область промотора и первого экзона гена рековерина в нормальных тканях сильно метилирована, причем уровень метилирования, очевидно, не зависит от типа ткани. Следовательно, метилирование может быть одной из причин чрезвычайно низкого уровня экспрессии мРНК рековерина в нормальных тканях, отмеченного нами в главе 1.
Анализ статуса метилирования области промотора и первого экзона гена рековерина в нормальных тканях и раковых опухолях
Как уже говорилось выше, возможность экспрессии рековерина в опухолях МККЛ была описана в литературе еще до начала настоящей работы [121]. Однако данные по экспрессии рековерина в опухолях НМККЛ в литературе отсутствовали, а число проанализированных случаев МККЛ было незначительным: в общей сложности 2 ре-ков ерин-положительных и 3 рековерин-отринательных [121, 44]. Отсутствие статистики не давало возможности сделать вывод о частоте экспрессии рековерина в опухолях легких.
В главе 1 мы показали, что экспрессия рековерина присутствует как в опухолях МККЛ, так и НМККЛ. Для того, чтобы определить частоту случаев экспрессии рековерина в опухолях легких, нами был проведен анализ серии парафиновых срезов, полученных от пациентов с первичными опухолями, на присутствие в них экспрессии рековерина. Рековерин на срезах выявляли иммуногистохимически с помощью поликлональных моноспецифических антител против рековерина.
Результаты анализа представлены в таблице 5. Из таблицы видно, что из 44 проанализированных образцов срезов опухоли МККЛ 30 являются рековерин-положительными, что соответствует частоте экспрессии рековерина в опухолях МККЛ, равной 68%. Частота экспрессии рековерина в опухолях НМККЛ превышает частоту при МККЛ и равна 85% (34 из 40 проанализированных образцов). Отметим, что разница между частотой экспрессии рековерина при МККЛ и НМККЛ статистически недостоверна (р=0,12 по тесту х2) Следует подчеркнуть, что в нормальных тканях (в том числе и в легких) рековерин отсутствует, о чем свидетельствуют результаты иммунохимического [6] и нашего цитоиммуногистохимического исследования. Добавим, что в исследованную группу НМККЛ входили 11 образцов аденокарциномы, положительными из которых было 9 образцов (82%). Среди 29 срезов плоскоклеточной карциномы легких, проанализированных нами, экспрессия рековерина была обнаружена в 25 из них (частота экспрессии при этом составила 86%), На основании этих данных мы рассчитали общую частоту экспрессии рековерина в опухолях легких, которая составляет 73%.
Для полуколичественной оценки экспрессии рековерина в опухолях легких мы определяли в каждом срезе процент клеток, экспрес-сировавших рековерин (Re). Для отображения различных уровней экспрессии белка использовали следующую шкалу: Re = 0 (клетки, экспрессирующие рековерин, отсутствуют); Re 20%, 20% Re 50%HRC 50%.
Оказалось, что уровень экспрессии рековерина в опухолях МККЛ и НМККЛ различен: в то время как экспрессия рековерина в образцах НМККЛ находится в пределах от 0 до 100%, в опухолях МККЛ максимальный уровень экспрессии рековерина составляет не более 20%). В случае НМККЛ в низкодифференцированных опухолях наблюдался более высокий процент клеток, экспрессирующих рековерин, чем в высокодифференцировапных опухолях (от 20% до 50% для низкодифференцированных и менее 20% для высокодифференци-рованных опухолей). Кроме того, следует отметить корреляцию между наличием в крови пациентов с НМККЛ аутоантител против рековерина и уровнем экспрессии рековерина в опухоли. При наличии аутоантител уровень экспрессии рековерина в опухоли был более высоким (50% - 100%), чем в отсутствие таких антител (20% - 50%).
Серийный анализ образцов сыворотки крови онкологических больных на присутствие аутоантител против рековерина.
Так же, как и в случае экспрессии рековерина в опухолях легких, связь между присутствием аутоантител против рековерина (ААР) в крови и раком легких была отмечена уже давно [35]. Однако, как и в случае экспрессии рековерина в опухолях, отсутствие статистики не давало возможности корректной оценки частоты встречаемости ААР как при раке легких, так и при других онкологических заболеваниях.
В связи с этим нами было проведено определение частот ААР в образцах сыворотки крови пациентов с различными онкологическими заболеваниями. Для анализа применяли метод иммуноблоттинга, в качестве антигена использовали рековерин. Инкубацию блотов рековерина в присутствии сыворотки крови проводили при начальном разведении 1:20. Иммунохимический сигнал регистрировали с помощью диаминобензидина, в некоторых случаях - с помощью хемолюминес-центного метода (ECL-system). (Более подробно метод анализа образцов сыворотки крови методом иммуноблоттинга описан в разделе "Материалы и методы"). Применение различных методов визуализации таких, как диаминобензидиновый или метод ECL, не влияло на количество рековерин-положительных образцов сыворотки. Хотя метод ECL и давал более высокое значение величины титра ААР, в дальнейшем при серийном анализе образцов сыворотки крови пациентов с различными доброкачественными и злокачественными заболеваниями мы использовали диаминобензидиновый метод как более удобный. Пример определения ААР в образцах сыворотки крови представлен на рис. 20. Из рисунка видно, что при начальном разведении 1:20 сыворотка крови ААР-положительных пациентов окрашивает рековерин на иммуноблоте.
С помощью описанного подхода мы проанализировали 229 образцов сыворотки крови пациентов с МККЛ, НМККЛ и пациентов с неопухолевыми легочными заболеваниями на присутствие в них ААР. Оказалось, что ААР обнаруживаются в крови 15 пациентов с МККЛ из 99 (соответствует частоте встречаемости антител 15%), Анализ образцов сыворотки крови пациентов с НМККЛ на присутствие в них ААР выявил их у 9 пациентов из 44, что составляет около 20% случаев. Отметим, что ААР присутствовали в крови представителей всех гистологических типов НММКЛ - плоскоклеточного рака, крупноклеточного рака и аденокарциноми. Ни один из 150 контрольных образцов сыворотки крови, полученных от здоровых индивидов, положительной реакции на ААР не дал. У пациентов с неопухолевыми заболеваниями легких ААР были обнаружены только в двух случаях из 86 (2%). Заметим, однако, что этими пациентами были ликвидаторы последствий аварии на Чернобыльской АЭС и их пульмонологические заболевания могут быть потенциально предраковыми.
