Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
Белки-ингибиторы сериновых протеиназ у растений семейства злаковых 8
1.1. Распространение и локализация 8
1.2. Аминокислотный состав и физико-химические свойства 15
1.3. Первичная структура 23
1.4. Физиологические функции 36
2. Материалы и методы исследований 43
2.1. Материалы 43
2.2. Аффинная хроматография 45
2.3. Гель-хроматография 46
2.4. Изоэлектрическое фокусирование 47
2.5. Электрофорез в полиакриламидном геле 48
2.6. Аминокислотный анализ 49
2.7. Восстановление дисульфидных связей и их алкилиро-вание 50
2.8. Определение содержания сульфгидрильных групп . 50
2.9. Спектры кругового дихроизма 51
2.10. Спектры поглощения и собственная флуоресценция . 52
2.11. Диссоциация комплекса фермент-ингибитор 52
2.12. Определение активности ингибиторов 53
3. Результаты исследований 55
3.1. Содержание ингибиторов протеолитических ферментов в семенах растений семейства злаковых 55
3.2. Ингибиторы химотрипсина и трипсина из семян кукурузы 61
3.2.1. Выделение и очистка 61
3.2.2. Аминокислотный состав 67
3.2.3. Физико-химические свойства 70
3.2.4. Особенности структурной организации. Действие денатурирующих факторов . 82
3.2.5. Взаимодействие с ферментами 97
4. Заключение 108
5. Выводы 114
Список цитированной литературы 116
- Аминокислотный состав и физико-химические свойства
- Определение активности ингибиторов
- Содержание ингибиторов протеолитических ферментов в семенах растений семейства злаковых
- Особенности структурной организации. Действие денатурирующих факторов
Введение к работе
Протеолитические ферменты выполняют разнообразные физиологические функции в живом организме, начиная с переваривания белков пищи и запасных белков семян до специфических регуляторних процессов, таких как активация зимогенов, образование гормонов и других физиологически активных пептидов из их предшественников, транспорт белков, защитные реакции /1-4/. В связи с этим изучение механизмов регуляции активности протеолитических ферментов приобретает особую актуальность. Один из таких механизмов связан с наличием в органах и тканях специфических белковых веществ, действующих как ингибиторы протеолитических ферментов /5,6/.
В целом ингибиторы протеиназ представляют обширную группу белковых веществ, общим свойством которых является способность образовывать с ферментами соединения (комплексы), в которых субст-ратоподобное связывание в активном центре фермента приводит к конкурентному ингибированию всех каталитических функций. Несмотря на разнообразие встречаемых ингибиторов, все они могут быть сгруппированы в небольшое число классов или типов. Каждый тип или класс соответствует тому или иному классу протеолитических ферментов. Различают ингибиторы сериновых протеиназ, цистеиновых и аспар-тильных протеиназ и металлопротеиназ /7,8 /.
Широкое распространение ингибиторов сериновых протеиназ в различных органах и тканях животных, в растениях и микроорганизмах подчеркивает их биологическую значимость, что может быть связано с возможностью временных и локальных ограничений ферментативной активности.
В настоящее время накапливаются данные, указывающие на активную роль белков-ингибиторов протеиназ в защите растений от поражения насекомыми и фитопатогенными микроорганизмами. В 1954 году
5 в семенах сои был впервые обнаружен специфический ингибитор пищеварительного протеолиза насекомых рода Triboiium /9/, а затем из сои выделили два белка, подавляющие активность s Н-зависимых серинОБЫХ протеиназ ЛИЧИНОК жука Tribolium constaneum и Triboiium confusum /10,11,12/. Подобный белок-ингибитор обнаружен и в семенах пшеницы /13/. Одновременно из пищеварительного тракта насекомого Tenebrio moiitor очищена /б -протеиназа, активность которой подавлялась рядом ингибиторов трипсина и химо-трипсина, полученных из растений /14/; а в 1979 году появилось сообщение о том, что ингибитор трипсина из вигны угнетает процесс
развития жука Collosobruchus maculatus /15/.
Как известно, фитопатогенные грибы - обширная группа микроорганизмов, вызывающих различные заболевания растений, - выделяют в окружающую среду протеолитические ферменты /16,17/. Поэтому интерес представляет тот факт, что в семенах фасоли присутствует специфический ингибитор протеаз фитопатогенного гриба Coiieto-trichum lindemuthiamim /18/. Кроме того, протеолитическую активность экзопротеиназ грибов рода Pusarium подавляют очищенные препараты ингибитора трипсина и химотрипсина из фасоли /19, 20/. Экзопротеиназы этого гриба инактивируются также белками-ингибиторами Кунитца и Баумана-Бирк из сои, ингибиторами из лимской фасоли и клубней картофеля /21/. Недавно удалось показать, что ингибиторы химотрипсина и трипсина из семян гречихи способны ин-ГИбировать протеинаЗЫ, секретируемые грибом Alternaria termuis Ness , а также угнетают рост мицелия этого гриба /22/. Приведенные результаты не согласуются с распространенным до сих пор в литературе взглядом на ингибиторы протеиназ, содержащиеся в растениях, только как на вещества, снижающие пищевую ценность растительных продуктов /S3/. Очевидно, эти представления не учитывают зна-
чения ингибиторов для самих растений как фактора повышения их биологической устойчивости. Данные, касающиеся белков из растений семейства злаковых ( Gramineae ), инактивирующих протеиназы микроорганизмов и насекомых, немногочисленны; они будут рассмотрены в разделе 1.4. обзора литературы.
В настоящее время наиболее подробно изучены ингибиторы про-теиназ из растений, принадлежащих к семействам бобовых ( Legumi-nosae ) и пасленовых ( Soianaceae ), Сведения относительно ингибиторов протеиназ у растений других семейств носят отрывочный характер. Это относится и к растениям семейства злаковых. Поскольку семена злаков являются важнейшим источником пищевого и кормового белка, изучение содержащихся в них ингибиторов протео-литических ферментов имеет не только теоретическое, но и большое практическое значение.
В настоящей работе была поставлена задача выделить и детально охарактеризовать ингибиторы сериновых протеиназ из семян кукурузы ( Zea mays. L. ), являющейся важным источником пищевого и > кормового белка.
В ходе исследований проведено количественное определение содержания ингибиторов протеиназ в семенах злаков. Из семян кукурузы выделены S формы ингибитора химотрипсина с pi 4,45, 4,65 и 5,10, а также 2 формы ингибитора трипсина с pi 4,50 и 5,60. Молекула ингибитора химотрипсина с молекулярным весом 19 000 состоит из одинаковых субъединиц. Характерной чертой ингибитора является отсутствие в его составе остатков цистеина. Эта особенность представляет принципиальный интерес, так как ингибиторы протеиназ растительного происхождения обычно характеризуются высоким содержанием дисульфидных связей.
Ингибитор химотрипсина обладает широким спектром действия на
ферменты и подавляет активность субтилизина и ряда других протеиназ микроорганизмов, образуя с ферментом комплексы двух типов 1^ и 12Е. Ингибитор трипсина из кукурузы напротив,отличается весьма узкой специфичностью и не оказывал заметного ингибирующего действия ни на одну из исследованных протеиназ за исключением протеиназ из streptomyces griseus.
Исследованы особенности вторичной структуры ингибиторов с помощью метода ВД. Анализ спектров КД позволяет отнести ингибитор химотрипсина к структурному классу белков (оС + б) и ингибитор трипсина - к классу d/ Ь .
Необходимо отметить, что ингибиторы протеиназ из семян кукурузы оставались до сих пор малоисследованными. Имелись лишь немногочисленные и частично противоречивые данные об ингибиторах трипсина в семенах кукурузы. Что касается ингибиторов химотрипсина и микробных протеиназ, то такие данные полностью отсутствовали. Детальное знание ингибиторов протеиназ, содержащихся в семенах кукурузы, может послужить основой для направленной селекции с целью создания сортов, обладающих как высоким качеством белков, так и повышенной устойчивостью.
Отдельные части диссертации докладывались на Всесоюзной конференции по перспективам использования биоспецифической хроматографии в технологии производства высокоочищенных ферментов (Вильнюс, 1982), ІУ Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология" (Киев, 1983), Международном симпозиуме ФЕМО "Регуляция микробного метаболизма факторами внешней среды" (Пущино, 1983), УІ Всесоюзном симпозиуме "Химия белков и пептидов" (Рига, 1983), ХУТ конференции ФЕБО (Москва, 1984), а также на научных конференциях Института биохимии им. А.Н.Баха АН СССР.
Аминокислотный состав и физико-химические свойства
Протеолитические ферменты выполняют разнообразные физиологические функции в живом организме, начиная с переваривания белков пищи и запасных белков семян до специфических регуляторних процессов, таких как активация зимогенов, образование гормонов и других физиологически активных пептидов из их предшественников, транспорт белков, защитные реакции /1-4/. В связи с этим изучение механизмов регуляции активности протеолитических ферментов приобретает особую актуальность. Один из таких механизмов связан с наличием в органах и тканях специфических белковых веществ, действующих как ингибиторы протеолитических ферментов /5,6/.
В целом ингибиторы протеиназ представляют обширную группу белковых веществ, общим свойством которых является способность образовывать с ферментами соединения (комплексы), в которых субст-ратоподобное связывание в активном центре фермента приводит к конкурентному ингибированию всех каталитических функций. Несмотря на разнообразие встречаемых ингибиторов, все они могут быть сгруппированы в небольшое число классов или типов. Каждый тип или класс соответствует тому или иному классу протеолитических ферментов. Различают ингибиторы сериновых протеиназ, цистеиновых и аспар-тильных протеиназ и металлопротеиназ /7,8 /.
Широкое распространение ингибиторов сериновых протеиназ в различных органах и тканях животных, в растениях и микроорганизмах подчеркивает их биологическую значимость, что может быть связано с возможностью временных и локальных ограничений ферментативной активности.
В настоящее время накапливаются данные, указывающие на активную роль белков-ингибиторов протеиназ в защите растений от поражения насекомыми и фитопатогенными микроорганизмами. В 1954 году в семенах сои был впервые обнаружен специфический ингибитор пищеварительного протеолиза насекомых рода Triboiium /9/, а затем из сои выделили два белка, подавляющие активность s Н-зависимых серинОБЫХ протеиназ ЛИЧИНОК жука Tribolium constaneum и Triboiium confusum /10,11,12/. Подобный белок-ингибитор обнаружен и в семенах пшеницы /13/. Одновременно из пищеварительного тракта насекомого Tenebrio moiitor очищена /б -протеиназа, активность которой подавлялась рядом ингибиторов трипсина и химо-трипсина, полученных из растений /14/; а в 1979 году появилось сообщение о том, что ингибитор трипсина из вигны угнетает процесс развития жука Collosobruchus maculatus /15/.
Как известно, фитопатогенные грибы - обширная группа микроорганизмов, вызывающих различные заболевания растений, - выделяют в окружающую среду протеолитические ферменты /16,17/. Поэтому интерес представляет тот факт, что в семенах фасоли присутствует специфический ингибитор протеаз фитопатогенного гриба Coiietorichum lindemuthiamim /18/. Кроме того, протеолитическую активность экзопротеиназ грибов рода Pusarium подавляют очищенные препараты ингибитора трипсина и химотрипсина из фасоли /19, 20/. Экзопротеиназы этого гриба инактивируются также белками-ингибиторами Кунитца и Баумана-Бирк из сои, ингибиторами из лимской фасоли и клубней картофеля /21/. Недавно удалось показать, что ингибиторы химотрипсина и трипсина из семян гречихи способны ин-ГИбировать протеинаЗЫ, секретируемые грибом Alternaria termuis Ness , а также угнетают рост мицелия этого гриба /22/. Приведенные результаты не согласуются с распространенным до сих пор в литературе взглядом на ингибиторы протеиназ, содержащиеся в растениях, только как на вещества, снижающие пищевую ценность растительных продуктов /S3/. Очевидно, эти представления не учитывают значения ингибиторов для самих растений как фактора повышения их биологической устойчивости. Данные, касающиеся белков из растений семейства злаковых ( Gramineae ), инактивирующих протеиназы микроорганизмов и насекомых, немногочисленны; они будут рассмотрены в разделе 1.4. обзора литературы.
В настоящее время наиболее подробно изучены ингибиторы про-теиназ из растений, принадлежащих к семействам бобовых ( Legumi-nosae ) и пасленовых ( Soianaceae ), Сведения относительно ингибиторов протеиназ у растений других семейств носят отрывочный характер. Это относится и к растениям семейства злаковых. Поскольку семена злаков являются важнейшим источником пищевого и кормового белка, изучение содержащихся в них ингибиторов протео-литических ферментов имеет не только теоретическое, но и большое практическое значение.
В настоящей работе была поставлена задача выделить и детально охарактеризовать ингибиторы сериновых протеиназ из семян кукурузы ( Zea mays. L. ), являющейся важным источником пищевого и кормового белка.
В ходе исследований проведено количественное определение содержания ингибиторов протеиназ в семенах злаков. Из семян кукурузы выделены S формы ингибитора химотрипсина с pi 4,45, 4,65 и 5,10, а также 2 формы ингибитора трипсина с pi 4,50 и 5,60. Молекула ингибитора химотрипсина с молекулярным весом 19 000 состоит из одинаковых субъединиц. Характерной чертой ингибитора является отсутствие в его составе остатков цистеина. Эта особенность представляет принципиальный интерес, так как ингибиторы протеиназ растительного происхождения обычно характеризуются высоким содержанием дисульфидных связей.
Ингибитор химотрипсина обладает широким спектром действия на ферменты и подавляет активность субтилизина и ряда других протеиназ микроорганизмов, образуя с ферментом комплексы двух типов 1 и 12Е. Ингибитор трипсина из кукурузы напротив,отличается весьма узкой специфичностью и не оказывал заметного ингибирующего действия ни на одну из исследованных протеиназ за исключением протеиназ из streptomyces griseus.
Исследованы особенности вторичной структуры ингибиторов с помощью метода ВД. Анализ спектров КД позволяет отнести ингибитор химотрипсина к структурному классу белков (оС + б) и ингибитор трипсина - к классу d/ Ь .
Определение активности ингибиторов
В обзоре литературы отмечалось, что семена и другие части многих растений отличаются достаточно высоким содержанием белков, действующих как ингибиторы протеолитических ферментов. Однако, сведения о содержании ингибиторов протеиназ в семенах растений семейства злаковых носят отрывочный характер, причем, данные по количественному содержанию ингибиторов субтилизина полностью отсутствуют. В связи с этим было проведено определение содержания ингибиторов трипсина, химотрипсина и субтилизина в экстрактах из покоящихся семян ряда злаков.
Для определения использовались семена следующих культур: кукурузы (днепровский 247 урожая 1980 г.), озимая пшенипа (Одесская 51 урожая 1981 г.), рожь (Харьковская 55 урожая 1980 г.), просо (Мироновское 51 урожая 1981 г.), тритикале (Амфидиплоид 206 урожая 1978 г.) и ячмень (днепровский 425 урожая 1981 г.).
По 5 г семян каждого сорта измельчали на электромельнипе и просеивали через сито с диаметром отверстий 0,5 мм. Экстракцию белков проводили водой в отношении 1:4 (вес на объем) в течение ночи при +4С. В прозрачном фильтрате определяли содержание белка по методу Лоури /222/у а также активность ингибиторов трипсина, химотрипсина и субтилизина. Результаты опытов представлены в таблице I.
Как видно из представленных данных, во всех исследованных культурах уровень ингибиторов трипсина и химотрипсина относительно высок. Исключение составляют семена проса. С другой стороны, если содержание ингибиторов трипсина колеблется в небольших пределах (удельная активность 0,0045-0,0066 ИЕ/мг), то содержание ин 56 гибиторов химотрипсина и субтилизина колеблется в более широком интервале. Наибольшим содержанием ингибиторов химотрипсина отличаются семена ячменя и тритикале. В целом содержание ингибиторов химотрипсина коррелирует с общим содержанием белка в культурах, что соответствует данным, полученным Кирси /103/ для ячменя.
Во всех исследованных культурах выявлена значительная активность ингибиторов субтилизина, которая наиболее велика в семенах тритикале, ячменя и озимой пшениш. Интересно, что удельная активность и общее содержание ингибиторов субтилизина у всех исследованных растений были выше, чем удельная активность и общее содержание ингибиторов трипсина и химотрипсина.
Как продолжение данных исследований было проведено сравнительное определение множественных форм ингибиторов субтилизина, химотрипсина и трипсина из семян кукурузы с помощью метода изо электрического фокусирования в колонке с последующим определением активности ингибиторов в отдельных белковых фракциях. Для фокусирования использовали обессоленные препараты белков, полученных на стадии аффинной хроматографии с применением субтилизин-, химотрип-син- и трипсин-сефарозы 4В. Полученные данные графически изображены на рисунках 1-3.
Как видно на рисунках, ингибитор химотрипсина и ингибитор трипсина при изофокусировании в широком интервале рН 3,5-10 представлены каждый двумя формами с изоэлектрическими точками (pi) 4,60, 5,10 и 4,50, 5,60 соответственно. В случае ингибитора химотрипсина обе формы обладали также способностью подавлять активность субтилизина.
Препарат белка, полученный элюпией с субтилизин-сефарозы 4Б, состоял из большого числа активных форм с изоточками в области рН 4,03-7, причем, в препарате присутствуют белки с изоточками, лежащими в интервале рН 4,60-5,10 и соответствующими обеим формам ингибитора химотрипсина.
Полученные нами данные позволяют заключить, что в семенах кукурузы присутствуют 3 типа различных белков-ингибиторов серино-вых протеиназ : ингибиторы химотрипсина, активные также по отношению к субтилизину и ряду других протеаз микроорганизмов, специфический ингибитор субтилизина и ингибитор трипсина. Результаты указывают на сходство системы ингибиторов протеиназ в семенах ячменя /90,108,132/ и кукурузы.
Содержание ингибиторов протеолитических ферментов в семенах растений семейства злаковых
Вторым этапом выделения ингибиторов химотрипсина и трипсина была аффинная хроматография с использованием соответственно иммобилизованного химотрипсина и иммобилизованного трипсина. Применение данного метода позволило получить препараты белков-ингибиторов практически в одну стадию с высокой степенью очистки (табл.2 и 3). Причины, объясняющие низкий количественный выход ингибитора химотрипсина на стадии аффинной хроматографии, будут рассмотрены позд 64 нее.
Для дальнейшей очистки выделенных из семян кукурузы ингибиторов использовали гель-хроматографию, что позволило отделить неактивный материал - возможно, результат неспецифической сорбции на аффинной колонке.
При очистке белок, элюированный с биоспецифического сорбента, тотчас нейтрализовали с помощью сухого "трис" и концентрировали методом ультрафильтрации через мембрану им-Ю в ячейке фирмы "Амикон". Затем белковые растворы наносили на колонку с сефадек-сом G -75. Результаты гель-хроматографии ингибитора химотрипсина представлены на рисунке 4А.
Как видно из данных, показанных на рисунке 4А, ингибитор химотрипсина элюируется в виде трех пиков, объемы элюции которых соответствуют значениям молекулярного веса 19000, 39000 и 70000. Все три пика обладают ингибиторной активностью по отношению к хи-мотрипсину, присутствует также минорное количество низкомолекулярного материала, лишенного активности. Основная активность сосредоточена во фракциях, соответствующих молекулярному весу 19000. Наличие ингибиторной активности у компонентов с молекулярным весом 39000 и 70000 позволяет предположить, что они представляют собой ди- и тетрамеры основной формы ингибитора. Такое заключение подтверждается результатами рехроматографии компонента с молекулярным весом 19000. При этом было вновь обнаружено присутствие более тяжелых компонентов с теми же значениями молекулярного веса (рис.4Б).
Б отличие от ингибитора химотрипсина, ингибитор трипсина при гель-хроматографии элюируется в виде одного симметричного пика, обладающего высокой антитриптической активностью (рис.5).
Материал, соответствующий активным фракциям ингибитора трип 67 сина, а также фракциям, ингибитора химотрипсина, отмеченным на рисунке 4А горизонтальной чертой, высушивали лиофильно. Выход сухого белка в случае ингибитора химотрипсина составлял 10,06 мг из I кг семян, в случае ингибитора трипсина - 7,53 мг на 100 г семян. Ингибитор химотрипсина был очищен в 138 раз (табл.2), ингибитор трипсина в 160 раз (табл.3).
Выделенные из семян кукурузы ингибиторы: ингибитор химотрипсина и ингибитор трипсина - значительно различаются по аминокислотному составу. Результаты определения аминокислот, входящих в состав данных белков, представлены в таблице 4. Минимальный молекулярный вес, рассчитанный на основании данных аминокислотного состава, равен - 8500 для ингибитора химотрипсина и ингибитора трипсина.
Как видно из данных, представленных в таблице 4, ингибитор химотрипсина и ингибитор трипсина различаются прежде всего по содержанию цистина. Так, в молекуле ингибитора трипсина обнаружено 6 остатков полуцистина, которые образуют 3 диоульфидных мостика. Это подтверждают результаты титрования по Эллману, при котором не было обнаружено свободных сульфгидрильных групп в молекуле белка. В отличие от ингибитора трипсина, в ингибиторе химотрипсина цистин и цистеин полностью отсутствуют.
Аминокислотный состав ингибитора трипсина характеризуется высоким содержанием пролина и глицина. В молекуле ингибитора трипсина содержится I остаток лизина и полностью отсутствует ме-тионин. В отличие от ингибитора трипсина, ингибитор химотрипсина имеет высокое содержание валина и лизина. В разных формах данного белка определяется 1-2 остатка метионина на молекулу. Оба белка характеризуются относительно низким содержанием ароматических аминокислот, которое составляет 4,2 и 2,3% от общего числа аминокислотных остатков соответственно для ингибитора химотрипсина и ингибитора трипсина.
Содержание аминокислотных остатков, боковые цепи которых способны принимать участие в образовании водородных связей /224/, составляет 2Ь% в молекуле ингибитора химотрипсина и ингибитора трипсина. Оба белка также характеризуются одинаковым и значительным содержанием гидрофобных аминокислот. Доля неполярных боковых цепей ( NPS ) у исследуемых белков, рассчитанная по методу Bige-low/225/, составляет 0,35. Это позволяет поставить полученные ингибиторы в один ряд с белками, характеризующимися высокой степенью гидрофобности /225/.Можно предположить,что гидрофобные взаимодействия наряду с водородными связями являются определяющими в формировании третичной структуры ингибитора химотрипсина и вносят существенный вклад в поддержание нативной конформации ингибитора трипсина.
Таким образом, на основании изложенного необходимо отметить, что наиболее характерной чертой аминокислотного состава ингибитора химотрипсина из семян кукурузы является полное отсутствие цис-тина. Это коренным образом отличает его от большинства других ингибиторов протеиназ из растений, прежде всего от низкомолекулярных ингибиторов из семян бобовых и некоторых ингибиторов из злаков /149/. Б то же время по аминокислотному составу ингибитор химотрипсина из кукурузы близок к ингибитору химотрипсина из семян ячменя /108/. В связи с этим можно отметить, что ингибитор химотрипсина и микробных протеиназ из ячменя был первым ингибитором протеиназ, выделенных из растений, молекула которого не содержала остатков цистина /52,108/.
Особенности структурной организации. Действие денатурирующих факторов
В характере спектра КД ингибитора трипсина в дальней УФ-об-ласти наблюдаются черты сходства с ингибиторами протеиназ из плазмы крови, особенно с антитромбином Ш. Спектры КД ингибитора трипсина и антитромбина Ш близки как по положению полос КД, так и по величине эллиптичности /237-240/.
Спектр КД ингибитора химотрипсина (рис.13) существенно отличается от спектра КД ингибитора трипсина. В дальней УФ-области для ингибитора характерно наличие отрицательной полосы при 206 нм ([-6 2 =-9600 00) и плеча при 220-222 нм (ej 222= 4050±150) Наличие плеча при 222 нм является отличительной чертой спектра КД ингибитора из кукурузы по сравнению со всеми другими исследованными ингибиторами из растений /229,230,232/. В ингибиторе химотрипсина по расчетам содержание «/-спиральных участков составляет 16/6 (табл.7). В большинстве других ингибиторов из растений /,-спирали полностью отсутствуют или их содержание составляет несколько процентов /229-232/. В молекуле ингибитора химотрипсина из кукурузы на долю & -структуры приходится 13%, а участки неупорядоченной полипептидной цепи составляют 48% (табл.7).
В ближней УФ-области спектр КД ингибитора химотрипсина имеет максимум при 208 нм ( [6 203=+68 10) с характерной тонкой структурой (рис.13 Б). Профиль спектра КД ингибитора химотрипсина в некоторых чертах напоминает спектр КД ингибитора химотрипсина I, выделенного из картофеля /158/.
Влияние денатурирующих агентов на пространственную структуру и активность. Устойчивость к денатурации является важным свойством ингибиторов, непосредственно связанным с их функцией и обусловленным, по всей вероятности, особенностями пространственной организации молекул. Как известно, контакт белка-ингибитора с активным центром фермента осуществляется через небольшой участок его молекулы - реактивный центр. Остальная часть молекулы инги битора,очевидно, необходима для поддержания нужной конформации реактивного центра /41/. С другой стороны известно, что простран ственная структура большинства ингибиторов протеолитических фер ментов достаточно жесткая, устойчивая к различным денатурирующим воздействиям /Si/. Однако имеются белки-ингибиторы с лабильной структурой, чувствительной к изменениям рН, температуры и другим воздействиям /5242/. В значительной мере устойчивость конформации ингибиторов определяется содержанием дисульфидных связей. Это преж де всего относится к низкомолекулярным ингибиторам из семян бобо вых и некоторых ингибиторов из злаков /149/. Однако, не всегда обнаруживается прямая зависимость между числом досульфидных мос тиков и устойчивостью к денатурационным воздействиям. В стабили зацию структуры молекул ингибиторов важный вклад вносят и другие факторы, в частности, гидрофобные взаимодействия /43/. В данном отношении представлялось интересным изучение влияния денатурирую щих агентов (повышенная температура, гуанидинхлорид, додецилсуль фат натрия) на конформацию и активность ингибиторов трипсина и химотрипсина, выделенных из семян кукурузы. Как отмечалось раньше, белки характеризуются одинаковой .величиной jfgs. , но раз личаются по содержанию дисульфидных связей. Действие повышенных температур. На рисунке 14 показана зависимость от температуры величины эллиптичности при 222 нм и инги-биторной активности белков: ингибитора химотрипсина (і) и ингибитора трипсина (2) из семян кукурузы. Как видно из этих данных, исследованные белки проявляют разную устойчивость к действию температуры. Заметные изменения полосы КД при 222 нм наблюдаются при нагревании раствора ингибитора химотрипсина выше 60С, а в случае ингибитора трипсина выше 80С. Эти данные коррелируют с результатами, полученными при изучении влияния повышенных температур на активность ингибиторов. Так, нагревание раствора ингибитора химотрипсина до 60С, а ингибитора трипсина до 80С не оказывало влияния на их активность. Дальнейшее увеличение температуры приводило к резкому снижению активности в обоих случаях. Б то же время, если при Ю0С ингибитор химотрипсина полностью теряет свою активность, то в случае ингибитора трипсина наблюдаемая потеря активности при 100С не превышала 40$. На основании полученных нами данных можно отметить, что по сравнению с ингибитором трипсина ингибитор химотрипсина характеризуется большей чувствительностью к тепловой денатурации. Действие гуанидинхлорида. Изменения структуры ингибиторов из кукурузы исследовались, с одной стороны, в зависимости от времени инкубации с денатурирующим агентом (гуанидинхлорид) в концентрации 3,5 М, с другой - от концентрации денатурирующего агента (1-5 М) при постоянном времени инкубации (I ч ). В таблице 8 представлены значения эллиптичности при 222,270 и 280 нм для нативных ингибиторов трипсина и химотрипсина в присутствии 3,5 М гуанидинхлорида.
Как видно из данных, представленных в таблице 8, инкубация обоих белков в присутствии денатурирующего агента вызывает уменьшение интенсивности соответствующих полос. Изменения достигают максимальных значений в течение 24 часов для обоих белков. Однако величина наблюдаемых изменений различна. Так, интенсивность полосы при 222 нм уменьшается в случае ингибитора трипсина на 19$ и в случае ингибитора химотрипсина на 64$. Особый интерес представляют в этом отношении изменения в ближней УФ-области спектра ингибитора химотрипсина.
