Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. 12
1.1. Строение фоторецепторов: палочки и колбочки. , 12
1.2. Структура и свойства зрительных пигментов 15
1.3. Фотолиз родопсина палочек. 21
1.3.1. Быстрые стадии фотолиза родопсина 23
1.3:1.1. Фотородопсин 23
1.3.1.2. Батородопсин 24
1.3.1.3. BSI-родопсин 24
1.3.1.4. Люмиродопсин 25
1.3.1.5. Метародопсин 1 25
1.3.2. Медленные стадии фотолиза родопсина 26
1.3:2.1. Метародопсин II 27
1.3.2.2. Метародопсин III 28
1.3.2.3. Транс-ретиналь иопсин 28
1.4. Фотолиз колбочковых зрительных пигментов. 29
1.5. Методы исследования процессов фотолиза в иптактпых клеткахУІ
1.6. Электрический ответ фоторецептора на свет: 35
1.7. Каскад фототрансдукции 37
1.7.1. Активация и выключение каскада фототрансдукции 37
1.7.2. Регуляция каскада фототрансдукции 42
1.8. Темповая адаптация и цикл зрительного пигмента: 45
1.8.1. Понятие темновой адаптации. 45
1.8.2. Роль медленных стадий фотолиза и других этапов зрительного цикла в темновой адаптации ...48
1.8.3. Реакции зрительного цикла в палочках 50
1.8.3.1. Образование в фоторецепторе транс-ретинола 52
1.8.3.2. Транспорт транс-ретинола в пигментный эпителий 53
1.8.3.3. Образование в пигментном эпителии 11-цис-ретиналя 54
1.8.3.4. Транспорт 11-цис-ретиналя в фоторецептор 55
1.8.3.5. Рекомбинация 11-цис-ретиналя с опсином 56
1.8.4. Реакции зрительного цикла в колбочках 56
Глава 2. Материалы и методы 58
2.1. Экспериментальные животные 58
2.2. Микроспектрофотометрия 59
2.2.1. Приготовление препарата 59
2.2.2. Процедура измерения 59
2.2.3. Обработка экспериментальных данных 61
2.3. Электрофизиологические исследования 62
2.3.1. Приготовление препарата 62
2.3;2. Метод всасывающей микропипетки 63
2.3.3; Процедура измерения. 64
2.3.4. Обработка данных и математическое моделирование 65
Глава 3. Результаты исследования 67
3:1. Фотолиз зрительных пигментов палочек 67
3.1.1.1. Медленные стадии фотолиза родопсина палочек амфибий: пример подхода к исследованию 67
3.1.1.1. Спектры поглощения наружных сегментов родопсиновых палочек 67
3.1.1.2. Конечные продукты фотолиза родопсина 74
3:1.1.3. Временной ход изменения концентраций фотопродуктов 77
3.1.1.4. Кинетическая схема медленных стадий фотолиза родопсина 80
3.1.2. Медленные стадии фотолиза порфиропсина палочек карася 83
3.1.2.1. Спектры поглощения наружных сегментов порфиропсиновых палочек 83
3.1.2.2. Временной ход изменения концентраций фотопродуктов и кинетическая схема медленных стадий фотолиза порфиропсина 86
3.2. Фотолиз колбочкоподобных и колбочкоеых зрительных пигментов 89
3.2.1. Медленные стадии фотолиза зрительного пигмента зеленых палочек лягушки 89
3.2.1.1. Спектры поглощения наружных сегментов зеленых палочек..89
3.2.1.2. Спектры поглощения метапигментов I и IIзеленых палочек 92
3.2.1.3. Образование в зеленых палочках метапигмента III. 96
3.2.1.4. Конечные продукты фотолиза пигмента зеленых палочек 96
3:2,1.5. Временной ход изменения концентраций фотопродуктов 97
3.2.1.6. Кинетическая схема медленных стадий фотолиза зрительного пигмента зеленых палочек 100
3.2.2. Медленные стадии фотолиза зрительного пигмента красных колбочек карася 102
3.2.2.1. Спектры поглощения наружных сегментов красных колбочек 102
3.2.2.2. Временной ход изменения концентраций фотопродуктов 105
3.2.2.3. Кинетическая схема медленных стадий фотолиза зрительного пигмента красных колбочек 110
3.3. Продукты фотолиза зрительных пигментов и темповая адаптация фоторецепторов 112
3.3.1. Восстановление чувствительности палочек после значительного обесцвечивания 112
3.3.1.1. Свойства фотоответов палочек 112
3.3.1.2. Математическое моделирование сигнальной активности каскада фототрансдукции в палочках 117
3.3.2. Восстановление чувствительности колбочек после значительного обесцвечивания 121
3.3.2.1. Свойства фотоответов колбочек. 121
3.3.2.2. Математическое моделирование сигнальной активности каскада фототрансдукции в колбочках 124
Глава 4. Обсуждение результатов 126
4.1. Поляризационная мшроспектрофотометрия как метод исследования процессов фотолиза in situ 126
4.2. Отличие между процессами фотолиза in vitro и in vivo 129
4.3. Особенности фотолиза палочковых и колбочковых зрительных пигментов in vivo 131
4.4. Образование транс-ретинола в интактных фоторецепторах: лимитирующая стадия 135
4.5. Роль долгоживущих продуктов фотолиза в темновой адаптации фоторецепторов 140
Выводы 145
Список литературы. 147
- Структура и свойства зрительных пигментов
- Реакции зрительного цикла в палочках
- Спектры поглощения наружных сегментов родопсиновых палочек
- Поляризационная мшроспектрофотометрия как метод исследования процессов фотолиза in situ
Введение к работе
Актуальность проблемы
Зрительная система человека и животных способна функционировать в чрезвычайно широком диапазоне интенсивностей света и обеспечивать восприятие объектов в разное время суток, от ночи со слабым светом звезд до яркого солнечного дня. Одним из проявлений этой способности является феномен темновой адаптации - восстановление чувствительности зрительной системы к слабому свету после пребывания под действием высоких освещенностеи, характерных для дневного времени. Темновая адаптация происходит как на уровне фоторецепторов и нейронных сетей сетчатки, так и на уровне центральных структур нервной системы. Однако именно изменения свойств фоторецепторов определяют поведение последующих звеньев обработки сигнала. Таким образом, адаптация на уровне фоторецепторных клеток (палочек и колбочек) является ключевым моментом для всего процесса.
Возбуждение фоторецепторов начинается с поглощения квантов света молекулами зрительного пигмента, которые находятся в наружных сегментах этих клеток. Зрительные пигменты принадлежат к классу семиспиральных трансмембранных рецепторных белков, передающих сигнал через ГТФ-связывающие белки (G-белки), к которым также относятся рецепторные белки обонятельной системы и некоторые рецепторы гормонов и нейромедиаторов. Из всех систем сигнализации через G-белки наиболее изучен механизм фототрансдукции - процесса, путем которого квант света, поглощенный зрительным пигментом, приводит к генерации электрического ответа фоторецепторной клетки. Поглощение кванта вызывает переход хромофорной группы пигмента (11-г/ис-ретиналя) в транс-форму и инициирует серию конформационных переходов, приводящих к появлению активной конформации - метапигмента II, который связывается с G-белком.
6 Последующие превращения приводят к фотолизу зрительного пигмента -отделению транс-хромо фора от апобелка опсина. При этом хромофорное место на опсине делается доступным для связывания новой молекулы 1\-цис-ретиналя, что обеспечивает восстановление исходной (темновой) структуры зрительного пигмента.
Фотолиз зрительного пигмента палочек - фоторецепторов сумеречного зрения - исследован достаточно хорошо как в детергентных экстрактах, так и в интактных фоторецепторах. Процессы фотолиза зрительных пигментов колбочек - фоторецепторов дневного зрения - исследованы значительно меньше, поскольку экспериментальные возможности ограничены трудностью получения достаточного количества колбочковых пигментов для исследований in vitro. При этом данных о фотолизе колбочковых пигментов в интактных фоторецепторах {in situ) почти нет, а имеющиеся в этом отношении немногочисленные работы выполнены с использованием методик, которые не позволяют надежно идентифицировать все продукты фотолиза в колбочках.
В настоящее время предполагается, что в папочках процесс темновой адаптации определяется течением медленных реакций, связанных с распадом долгоживущих продуктов фотолиза и регенерацией темнового зрительного пигмента (родопсина). Известно, что метародопсин II инактивируется за несколько секунд путем множественного фосфорилирования родопсинкиназой и последующего связывания с белком аррестином. Однако предполагается, что остаточная каталитическая активность инактивированного метародопсина II и других фосфорилированных и связанных с аррестином метапигментов (метародопсинов I и III) может стимулировать постоянное возбуждение каскада и снижать чувствительность фоторецептора. В таком случае для устранения следовой сигнальной активности, окончательного выключения каскада и достижения темноадаптированного состояния фоторецептора необходим полный распад
накопившихся на свету метародопсинов на ретиналь и опсин. Из психофизических экспериментов известно, что в колбочках темновая адаптация происходит как минимум на порядок быстрее, чем в палочках. Возможно, что такое различие в скоростях адаптации связано с разными скоростями фотопреврашений: палочкового и колбочкового пигментов, но прямое подтверждение этого при анализе in vivo пока отсутствует.
Наследственные или приобретенные дефекты зрительного- цикла, включающего фотолиз и восстановление зрительного пигмента, приводят к нарушениям процесса темновой адаптации: и являются причиной многих заболеваний сетчатки. Среди них болезнь -, Штаргардта - одна из распространенных причин потери зрения, в том числе и в молодом возрасте, стационарная ночная слепота, палочко-колбочковая дегенерация, различные формы возрастной макулярной дегенерации и некоторые формы пигментного ретинита [обзоры: Baehr et aL, 2003; Thompson & Gal, 2003]. Поскольку сложные нарушения зрения >. на системном уровне могут вызываться одиночным молекулярным дефектом, необходимо исследовать превращения зрительного пигмента на уровне отдельных реакций в условиях in vivo. Это позволит выяснить, какие стадии определяют ход темновой адаптации фоторецепторов ночного и дневного зрения в нормальных условиях и: при различных патологических состояниях.
Цель и задачи исследования
Процессы фотолиза, играющие ключевую роль в регенерации зрительного пигмента и,, как предполагается, в темновой адаптации фоторецепторов, относительно хорошо изучены лишь для родопсина палочек и совершенно1 не исследованы в интактных колбочках. Соответственно, целью данной работы было сравнение фотолиза палочковых и колбочковых зрительных пигментов ш vivo и анализ роли долгоживущих фотопродуктов в темиовой адаптации палочек и колбочек.
s Использованные в данной работе методы микроспектрофотометрии и
электрофизиологических отведений от одиночных фоторецепторов в
сочетании с математическим моделированием позволили решить следующие
задачи:
1. Исследовать последовательность и кинетику взаимопревращений
долгоживущих продуктов фотолиза в интактных; палочках и колбочках
сетчатки;
2'. Исследовать ход процесса темновой адаптации палочек и колбочек
после контролируемого обесцвечивания зрительного пигмента.
3. Сопоставить отличия? процессов фотолиза палочковых и
колбочковых зрительных пигментов с особенностями временного хода
темновой адаптации палочек и колбочек.
4. На основе проведенного анализа установить роль медленных стадий
фотолиза в процессе темновой адаптации для разных типов фоторецепторов.
Научная новизна результатов исследования
Применение скоростной поляризационной микроспектрофотометрии впервые позволило надежно идентифицировать долгоживущие: продукты: фотолиза колбочковых зрительных пигментов in vivo и. представить кинетическую схему взаимопревращений между ними.
Исследование кинетики фотопревращений зрительного пигмента позволило установить, что в палочках генерация конечного продукта фотолиза: (ретинола) лимитируется образованием ретиналя^ в результате распада метапродуктов, а в колбочках - реакцией восстановления ретиналя в = ретинол, катализируемой ферментом ретинолдегидрогеназой. -
Проведено* сопоставление временного хода выключения каскада фототрансдукции в палочках и колбочках с кинетикой распада долгоживущих продуктов, фотолиза в этих фоторецепторах. При этом впервые показано, что распад метапродуктов является основным фактором,
контролирующим! процесс темновой адаптации как в: палочках, так и: в колбочках, а его более быстрое течение в колбочках обеспечивает высокую скорость темновой адаптации этих фоторецепторов.
Основные положения, выносимые на защиту
Схема: медленных стадий фотолиза; установленная- ранее для-родопсина быка и лягушки, не является универсальной, поскольку образующиеся продукты фотолиза зависят как от вида зрительного пигмента, так и от вида животного:
Скорость. распада кол бочкового зрительного пигмента в процессе: фотолиза" на один-два порядка выше по сравнению с палочковыми пигментами:
3.. Лимитирующей стадиейг в генерации одного из; ключевых продуктов зрительного цикла - /и/эдяс-ретинола — в палочках является образование ретиналя в результате распада метапродуктов, а в колбочках -ретинолдегидрогеназная реакция;
4. Выход фоторецепторов из насыщения после действия ярких стимулов, контролирующий временной; ход темновой адаптации, определяется кинетикой распада фотопродуктов.
5: Быстрый распад колбочковых зрительных пигментов по сравнению с палочковыми является одним из основных факторов, лежащих в основе быстрой темновой адаптации колбочек.
Теоретическая и практическая значимость работы
Выполненное' в данной работе сравнительное исследование фотолиза1 зрительных пигментов и процессов темновой адаптации разных типов; фоторецепторов из, сетчаток рыб и амфибий; позволило прояснить молекулярные механизмы, лежащие в основе темновой адаптации зрения. Кроме того, оно позволило объяснить различия в скорости восстановления
чувствительности палочек и колбочек после воздействия света высокой интенсивн ости; и, следовательно, различия скор остей адаптации дневного и ночного зрения.
Весьма вероятно, что полученные' выводы также: справедливы, и: для фоторецепторов млекопитающих, включая человека, поскольку принципиальное отличие между палочками и колбочками, заключающееся в более высокой; скорости фотолиза зрительного пигмента и темновой адаптации последних, согласуется' с физиологическим: отличием дневного зрения от ночного как у холоднокровных, так и у теплокровных позвоночных. Эти результаты могут оказаться;полезными w при изучении других клеточных систем передачи сигнала через G-белки, о- которых известно значительно меньше, чем о передаче сигнала в; каскаде фототрансдукции.
Связь, установленная между определенными: стадиями фотолиза и? этапами; темновой адаптации, позволила определить те критические стадии фотолиза, которые могут быть мишенью при различных заболеваниях сетчатки, связанных с нарушениями темновой адаптации.
Апробация работы и публикации результатов исследования
Основные материалы диссертации, доложены и обсуждены на следующих научных конференциях:
XII ^ Международном совещании: и V школе по эволюционной: физиологии (Санкт-Петербург, 2001);
V Всероссийской медико-биологической конференции молодых
исследователей (Санкт-Петербург, 2002);
VI Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 2002);
VII Путинской конференции молодых ученых (Пущино, 2003);
II Международном симпозиуме "Visionarium" (Твярминне, Финляндия, 2003);
«I
11 VII Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (Санкт-Петербург, 2004);
III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004);
III Международном симпозиуме "Visionarium" (Твярминне,
Финляндия, 2004);
Международном симпозиуме по физиологии клетки (Санкт-Петербург, 2004);
XXVIII Европейской конференции по зрительному восприятию (Ла Корунья, Испания, 2005);
IV Международном симпозиуме "Visionarium" (Твярминне,
Финляндия, 2005).
По материалам диссертации опубликовано 11 тезисов докладов на российских и международных конференциях и 4 научные статьи в рецензируемых журналах, 2 из которых - в международных изданиях.
Структура и свойства зрительных пигментов
Молекула зрительного пигмента поглощает свет в некоторой характерной области длин волн. После поглощения кванта она запускает фоторецепторный процесс и генерирует нервный сигнал. Структуре и свойствам зрительных пигментов посвящено большое количество обзоров, из которых дальше будет использоваться только несколько наиболее современных [Островский и Говардовский, 1992; Шуколюков, 1999; DeGrip & Rothschild, 2000; Hofmann, 2000].
Зрительный пигмент представляет собой хромопротеин. Эта сложная молекула содержит хромофорную группу и водонерастворимый мембранный апобелок (опсин). Ее размеры относительно небольшие: молекулярная масса родопсина палочек составляет около 40 кДа. Опсины фоторецепторных клеток различных видов позвоночных и беспозвоночных происходят от общего предка, но все же отличаются неконсервативными участками. Хромофорной группой; (лигандом) у всех зрительных пигментов позвоночных служит Н-цис изомерная форма ретиналя (альдегида витамина Ai) или 3,4-дегидроретиналя (альдегида- витамина А2), отличающегося наличием одной дополнительной двойной связи v в /3-иононовом (триметилциклогексеновом); кольце (см. рис; 3). Иногда: все зрительные пигменты; первого типа относятся- к классу родопсинов, второго типа - к классу порфиропсинов, однако более корректно: использовать такую номенклатуру только для палочковых: пигментов; У беспозвоночных в качестве хромофора может также выступать 4-дегидроретиналь [Kito et al;,. 19 8 6] ил и: 3 -оксиретиналь [Isono et al;, 1988]. Хромофорная . группа: может изомеризоваться. В связи: с этим молекула зрительного пигмента . обладает способностью перестраиваться после поглощения кванта света: сначала меняется конформация хромофора, а затем - белка. Одно из переходных состояний взаимодействует с участвующими в механизме ф ототрансдукции белками и: запускает биохимический каскад преобразования и передачи сигнала. Топография молекулы зрительного пигмента в фоторецепторной мембране представлена на рис. 4. Полипептидная цепь молекулы опсина, изгибаясь, пронизывает липидный матрикс мембраны, образуя семь трансмембранных а-спиралей. Хромофор расположен в гидрофобной области мембраны почти параллельно ее поверхности. Между альдегидной группой хромофора и є-аминогруппой лизина-296 в седьмой спирали образовано шиффово основание. С-конец полипептидной цепи опсина располагается на внешней (цитоплазматической) поверхности мембраны диска фоторецептора, N-конец обращен внутрь диска. В наружном сегменте колбочки, у которого диски незамкнуты, N-конец полипептидной цепи опсина обращен во внеклеточное пространство. Молекулы зрительного пигмента свободно движутся в липидном бислое, совершая поступательное и вращательное броуновское движение, но не переворачиваются в нем [Brown, 1972; Poo & Cone, 1974]. Возможность быстрой диффузии молекул в мембране важна для увеличения выхода первой реакции каскада фототрансдукции - активации трансдуцина [Calvert et aL, 2001] (см. пункт 1.7).
Наружный сегмент образован строго упорядоченной стопкой мембранных дисков, поэтому хромофорные моменты всех мембранно-связанных компонентов ориентированы по отношению к оси структуры [например, Harosi & Malerba, 1975; Harosi, 1975; Harosi, 1982]. Ориентацию хромофора можно определить, исследуя зависимость поглощения света наружным сегментом от поляризации измерительного луча (рис. 5). При распространении света перпендикулярно к оси наружного сегмента и направлении электрического вектора параллельно плоскости мембраны (Т) поглощение максимально. Поглощение минимально при направлении электрического вектора перпендикулярно мембране (L). Например, отношение этих поглощений в темновом родопсине » 5 [Denton, 1959; Liebman, 1972; Harosi & MacNichol, 1974; Harosi, 1975; Govardovskii et al., 2000]. Таким образом, дипольный момент поглощения хромофора (А) можно разложить на два компонента, один из которых лежит в плоскости мембраны (Лт), а другой - перпендикулярно к ней (AL) (рис, 5). Поскольку молекулы родопсина свободно вращаются, но не переворачиваются в липидном бислое, в Т-поглощении участвуют только половина Т-компонентов, а в L-поглощении - все L-компоненты [Harosi & Malerba, 1975]. При движении молекулы в мембране ориентация хромофорной группы сохраняется примерно параллельной плоскости мембраны. Почти строгая ориентация хромофора в плоскости мембран дисков обеспечивает в 1.5 раза более высокое поглощение света, распространяющегося в естественном направлении (вдоль оси наружного сегмента), по сравнению с ситуацией в растворе.
Реакции зрительного цикла в палочках
Темновая адаптация зрительной системы происходит как на уровне фоторецепторов и нейронных сетей сетчатки, так и на уровне центральных структур. При этом именно изменения свойств фоторецепторов запускают адаптивные перестройки на последующих стадиях зрительной обработки и служат поэтому ключевыми для процесса в целом. Каждая активированная квантом света молекула зрительного пигмента быстро инактивируется путем фосфорилирования и связывания с аррестином (см. пункт 1.7.1). Однако ее возвращение в исходное темновое состояние происходит намного медленнее, т.к. такая молекула не способна сигнализировать о получении следующего кванта до тех пор, пока ее транс-хромофор не будет замещен на новую молекулу 11-г/мс-ретиналя. В фоторецепторах беспозвоночных обратное превращение хромофора в 11-г/ис-изомер преимущественно достигается путем фотоизомеризации, при этом хромофор постоянно остается ковалентно связанным с опсином [Hamdorf et al., 1971]. Для фоторецепторов позвоночных аналогичное превращение хромофора достигается длинной последовательностью реакций распада и восстановления зрительного пигмента, т.е. в процессе зрительного цикла.
В настоящее время темновая адаптация фоторецептора определяется как результат медленных реакций, связанных с распадом долгоживущих продуктов фотолиза [Leibrock et al., 1994; Leibrock & Lamb, 1997; Leibrock et al., 1998] и регенерацией темнового зрительного пигмента в его цикле [обзоры: Pugh & Lamb, 2000; Fain et al., 2001].
После обесцвечивания значительной фракции родопсина чувствительность палочек понижается на несколько порядков, но затем частично восстанавливается, даже если регенерации зрительного пигмента не происходит, как, например, в сетчатке, отделенной от пигментного эпителия [обзор: Fain et al., 1996]. Попытки сопоставить изменения чувствительности палочек после обесцвечивания родопсина с появлением и распадом метародопсинов Пиделались более 30 лет назад [Donner & Reuter, 1967; Donner, 1973; Donner & НетІШ, 1975], но вопрос не был решен из-за-недостаточного уровня знаний о механизмах фототрансдукции. Следующим шагом стало предположение, что действие долгоживущих продуктов обесцвечивания родопсина по своей сути подобно действию эквивалентного фона, причем интенсивность такого фона находится в линейной зависимости от концентрации этих продуктов [Lamb, 1981]. Эта идея была подтверждена результатами электрофизиологических измерений на изолированных палочках жабы [Leibrock et al., 1994; Leibrock & Lamb, 1997; Leibrock et al.,1998]. Работы Лейброк с соавторами показывают, что эквивалентный фон создается (по крайней мере, при низких уровнях обесцвечивания) долгоживущими продуктами фотолиза родопсина, способными с низкой эффективностью возбуждать каскад фототрансдукции. Следовательно, концентрация метапродуктов контролирует скорость темновой адаптации палочек.
Распад метародопсина II и метародопсина III вполне может являться лимитирующей стадией для регенерации зрительного пигментами темновой адаптации, поскольку место связывания хромофора в этих долгоживущих продуктах фотолиза блокировано транс-ретиналем и недоступно для 1 \-цис-ретиналя [Kolesnikov et al., 2003]. Соответственно, полный фотолиз метапродуктов с отделением /ярдяс-ретиналя и освобождением опсина необходим для последующей регенерации зрительного пигмента, а его скорость приобретает решающее значение для темновой адаптации.
На изолированных фоторецепторах при отсутствии регенерации родопсина было показано, что при значительном уровне обесцвечивания (от 10 до 100% родопсина) десенситизирующий сигнал также создается накоплением свободного опсина, который способен с низким выходом активировать каскад фототрансдукции [Cornwall & Fain, 1994; Fain et al., 1996; Fain et al., 2001]. Для устранения этого сигнала необходима доставка в наружный сегмент 11-г/г/с-ретиналя и его рекомбинация с опсином. Следовательно, при значительном обесцвечивании скорость регенерации зрительного пигмента может стать фактором, определяющим скорость темновой адаптации.
Детальных работ о темновой адаптации на уровне одиночных колбочек почти нет, но из психофизических экспериментов известно, что в колбочках темновая адаптация происходит как минимум на порядок быстрее, чем в палочках (рис. 10). Предполагается, что это различие в скоростях адаптации связано с разными скоростями фотопревращений палочкового и колбочкового пигментов. Это подтверждается спектрофотометрическими экспериментами на детергентных экстрактах зрительных пигментов. Во-первых, в экстракте распад колбочкового метапигмента II (способного активировать каскад фототрансдукции) происходит как минимум на порядок быстрее распада палочкового метародопсина II [Yoshizawa, 1994; Yoshizawa & Imamoto, 1995; Imai et al., 1995; Kojima et al., 1996; Imai et al., 1997]. Во-вторых, регенерация темновых колбочковых пигментов из 1 1-г/ис-ретиналя и опсина происходит на два порядка быстрее, чем регенерация родопсина палочек [Wald et al., 1955; Yoshizawa & Kuwata, 1991; Shichida et al.,. 1994; Yoshizawa, 1994; Yoshizawa & Imamoto, 1995]. Однако данных in vivo о превращениях долгоживущих продуктов фотолиза и регенерации темнового пигмента в колбочках нет, в частности из-за методических трудностей работы с этими фоторецепторами.
Спектры поглощения наружных сегментов родопсиновых палочек
Серия спектров поглощения, записанных от изолированных наружных сегментов палочек лягушки Rana temporaria при двух направлениях поляризации (Т и L) в темноте и через различные интервалы времени после обесцвечивающей вспышки (525 нм, 2 с) при рН 7.5, показана на рис. 13. Далее спектры поглощения родопсина и продуктов его фотолиза будут демонстрироваться на примере палочек R. temporaria или Bufo bufo.
Спектр поглощения родопсина палочек состоит из двух пиков: главной а-полосы, максимум которой у амфибий находится в области 501-503 нм, и меньшей по амплитуде /3-полосы с максимумом около 350 нм (кривые, маркированные «темнота» на рис. 13). Шум на экспериментальных кривых определяется квантовыми флуктуациями измерительного светового зонда [Liebman, 1972; Govardovskii et al., 2000]. Спектры, записанные при двух направленнях поляризации измерительного луча (Т - в плоскости мембран дисков и L - перпендикулярно мембранам), отличаются по амплитуде. Это отличие в поглощениях показывает, что дипольный момент хромофорной группы родопсина ориентирован по отношению к плоскости мембраны и лежит примерно параллельно ей [Denton, 1959; Liebman, 1972]. Для родопсина отношение максимальных значений Т и L спектров (дихроичное отношение, D) в данном случае равно 4,8.
Непосредственно после обесцвечивания а-пик родопсина исчезает, и появляется высокий пик на 380 нм, соответствующий метародопсину II. Субпик около 475 нм соответствует метародопсину I, находящемуся в равновесии с метародопсином II (кривые 0 с на рис. 13). Дальнейшие изменения Т-спектров демонстрируют исчезновение метародопсина II при 380 нм, а также появление и последующий распад метародопсина III — пик около 475 нм, достигающий максимальной амплитуды к 100 с после обесцвечивания (кривая 100 с на рис. 13, Т), Изменения Т- и L-спектров во времени значительно отличаются. На L-спектрах низкий начальный пик при 380 нм в ходе фотолиза возрастает до 900 с, демонстрируя появление трале-ретиналя, ориентированного преимущественно перпендикулярно к плоскости мембраны (кривая 900 с на рис. 13, L). Дальнейшего восстановления траяс-ретиналя в транс-ретинол почти не происходит — пик ретинола, имеющего максимум около 325 нм, практически отсутствует. Причиной этого, по-видимому, является недостаток в изолированных наружных сегментах (без примыкающих к ним внутренних сегментов) кофактора ретинолдегидрогеназной реакции - НАДФ Н2. Частичное уменьшение пика ретиналя между 900 и 2700 с объясняется его постепенным уходом из клетки. Спектр 2700 с (45 мин) состоит из основного пика при » 380 нм (ретинального компонента) и длинноволнового плеча с максимумом поглощения около 440 нм, также ориентированного поперек плоскости мембраны. В дальнейшем этот фотопродукт будет обозначаться Р-440, а его природа и свойства будут специально обсуждаться ниже (пункт 3.1.1.2).
Показанные на рис. 13 спектры после вспышки содержат, кроме фотопродуктов, еще и некоторое количество необесцвеченного зрительного пигмента. Неполное обесцвечивание связано не с недостаточной интенсивностью или длительностью вспышки, а с тем, что повторное поглощение кванта молекулой метародопсина I может приводить к реизомеризации хромофора в 9-цис- или 11-г/ис-форму. В результате при сколь угодно яркой вспышке образуется фоторавновесная смесь, состоящая из метародопсинов I и II, а также стабильных фоторегенерировавших пигментов: родопсина (опсин + 11-г/ис-ретиналь) и изородопсина (опсин + 9-г/ис-ретиналь, Viax = 487 нм) [Hubbard et aL, 1971]. Чтобы определить количество смеси родопсина и изородопсина, образовавшейся в результате фоторегенерации, через 45 мин после первой вспышки, когда все метапродукты распались, подавалась вторая обесцвечивающая вспышка. Она приводила к дополнительному уменьшению поглощения около 500 нм (кривые 1 и 2 на рис. 14). Разность спектров до и после второй вспышки (кривая 3) показывает исчезновение родопсина и изородопсина (положительный пик) и возникновение соответствующего количества метародопсина II (отрицательный пик). Спектр обесцвеченного продукта соответствует стандартному зрительному пигменту с Х = 499 нм (кривая 4) [Govardovskii et al., 2000], При рН 7.5 его количество у R temporaria составляет 9% от исходного темнового родопсина.
Стандартный спектр соответствующей амплитуды вычитался из всех экспериментальных спектров (темнового и серии после обесцвечивания), причем для L-спектров учитывался дихроизм родопсина. В результате получились «чистые» спектры поглощения фотопродуктов при Т- и L-поляризации измерительного луча (рис. 15). Все приведенные в данной работе спектры поглощения скорректированы подобным образом.
Поляризационная мшроспектрофотометрия как метод исследования процессов фотолиза in situ
До последнего времени процессы фотолиза и другие реакции зрительного цикла исследовались преимущественно in vitro на детергентных экстрактах зрительного пигмента, препаратах изолированных фоторецепторных мембран и экстрагированных ферментах. При всех его достоинствах, такой аналитический подход дает лишь ограниченную информацию, поскольку возможные регуляторные механизмы и даже параметры индивидуальных реакций фотолиза могут существенно зависеть от морфологической целостности клетки и нативности мембранного окружения реагирующих молекул [Hofmann et al., 1995; Kliger & Lewis, 1995; DeGrip & Rothschild, 2000; Hofmann, 2000].
Новый методический подход, позволяющий исследовать процессы фотолиза в целых наружных сегментах и интактных клетках (отдельных или в составе сетчатки) появился относительно недавно - это скоростная поляризационная микроспектрофотометрия. Зрительный пигмент и большинство продуктов его фотолиза обладают специфическими спектрами поглощения, что позволяет проводить идентификацию и количественный анализ продуктов с помощью спектрофотометра. Микроспектрофотометр позволяет выполнять подобные спектральные измерения на одиночных клетках. Микроспектрофотометрия давно используется для исследования зрительных пигментов, находящихся в наружных сегментах фоторецепторов, в основном для характеристики свойств цветовых рецепторов сетчатки [например, Harosi, 1975; Bowmaker, 1984]. Однако большинство имеющихся приборов обладают низким быстродействием и дают, по существу, статическую картину. Современная компьютерная техника позволила создать скоростной микроспектрофотометр [Говардовский и Зуева, 2000] (см. пункты 1.5 и 2.2), применимый для анализа кинетики реакций в интактных фоторецепторах (in situ). Этот прибор был использован в данной работе для исследования процессов фотолиза не только палочковых зрительных пигментов, но и для быстрых колбочковых процессов в условиях, максимально приближенных к ситуации in vivo.
Важной особенностью использованного микроспектрофотометра является возможность регистрации поглощения объекта при двух направлениях поляризации измерительного светового луча. По изменению поглощения поляризованного света можно проследить изменения ориентации хромофора в процессе фотолиза, которые, в свою очередь, можно использовать для различения продуктов, имеющих сходные спектры поглощения. Важность поляризационного анализа легко оценить при сравнении спектров поглощения при Т- и L-поляризации (рис. 29) со спектрами, полученными после пересчета на ситуацию в неориентированном препарате (рис. 40). Спектр поглощения зрительного пигмента в растворе рассчитывался из измеренных Т- и L-спектров по формуле (1). В отличие от сложной последовательности событий в интактных наружных сегментах колбочек,, наблюдаемой в поляризованном свете (рис. 29, описание см. в пункте 3.2.2.1), измерения в неориентированном образце (рис. 40) показывают значительно упрощенную картину. Постепенное понижение пика, при 400 нм с течением времени после обесцвечивания может быть интерпретировано как распад метапигмента II. При этом появление и последующий распад свободного ретиналя выделить невозможно, поскольку его спектр поглощения практически полностью перекрывается со спектром метапигмента И. Таким образом, проводимые в большинстве работ измерения на неориентированных системах или измерения in situ при одной поляризации и/или на одной/двух длинах волн не позволяют надежно различить эти два продукта. Из последующих изменений спектров на рис. 40 видно лишь то, что к 300 с пик при 400 нм значительно понижается и полностью переходит в пик с максимумом около 330 нм, что соответствует образованию ретинола. Следует отметить, что выявить минорные короткоживущие продукты фотолиза (Р-450 и Р-490) при анализе этих спектров также не удается. Такая последовательность спектров стандартно наблюдается in vitro на детергентных экстрактах зрительного пигмента или суспензии фоторецепторных мембран, где хромофорные группы всех молекул ориентированы хаотично.
Очевидно, что поляризационные микроспектрофотометрические измерения in situ дают несколько преимуществ по сравнению с другими
Спектры зарегистрированы от наружных сегментов при помощи микроспектрофотометра и пересчитаны на ситуацию в неориентированном препарате; каждый спектр - среднее из записей от 13 клеток распространенными методами. Более того, скоростная микроспектрофото-метрия является фактически единственным методом для исследования процессов фотолиза в интактных колбочках, так как до сих пор никому не удалось разработать соответствующий биохимический препарат для работы in situ.
Как уже говорилось, процесс фотолиза чувствителен к окружению молекулы зрительного пигмента, и ход его медленных стадий существенно отличается в препаратах in vitro и интактных клетках. До сих пор медленные стадии фотолиза исследовались в условиях in vitro или in vivo различными методами и на разных видах животных, поэтому не всегда возможно правильно установить соответствия между имеющимися в литературе данными. Характерным примером является обсуждение природы и свойств метародопсина III красных палочек: в течение нескольких десятилетий накопилось множество данных на различных препаратах, однако неизвестно, с каким из долгоживущих продуктов фотолиза имел дело каждый конкретный исследователь.
До конца 60-х гг. XX века считалось, что последовательность продуктов фотолиза in vitro в дигитониновых экстрактах родопсина и in vivo в интактных наружных сегментах палочек одинакова, конечно, за исключением ферментативного восстановления ретиналя в ретинол, которое происходит только в свежевыделенной сетчатке [Bridges, 1962; Matthews et al., 1963; Cone & Cobbs, 1969]. Однако уже в то время разные исследователи описывали быстрый переход метародопсин I — метародопсин II разным количеством параллельных реакций первого порядка: одной [Wald, 1965], двумя [Ostroy et al., 1966] или тремя [Abrahamson et al., 1960]. Эти работы выполнены на детергентных экстрактах, и полученные в них значения констант скоростей расходятся довольно значительно. Кроме того, имеются другие данные о переходе между метародопсинами ІЛІ in vitro — в суспензии разрушенных ультразвуком наружных сегментов, где кинетика перехода оказывается более простой и представляет собой одну реакцию первого порядка [von Sengbusch & Stieve, 1971; Abrahamson & Wiesenfeld, 1972; Applebury et al., 1974].
Существование отличия между процессами фотолиза in vitro и in vivo впервые было отмечено на стадии превращения метародопсина І в метародопсин II [Donner & Reuter, 1969; Фирсов и Говардовский, 1988]. Единственным фотопродуктом, присутствующим в сетчатке лягушки через несколько секунд после обесцвечивания (когда метародопсин III еще не образовался), был метародопсин II [Reuter, 1973; Gyllenberg et al., 1974]. Однако в экстракте родопсина к этому времени формировалась смесь продуктов с максимумами поглощения при 380 и 465 нм (предположительно метародопсин II и метародопсин I, соответственно) [Lythgoe & Quilliam, 1938; Bridges, 1962; Matthews et al, 1963; Abrahamson & Ostroy, 1967]. Более того, в экстракте равновесие метародопсинов I/II сильно сдвинуто в сторону первого состояния, а их распад происходит намного медленнее, чем в целой сетчатке.
