Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Структура, ферментный состав и функции плазматических мембран 9-20
1.2. Изменение активности мембраносвязанных ферментов и фосфолипидов плазмолеммы в
процессе онтогенеза 20-27
1.3. Влияние радиации на маркерные ферменты и фосфолипиды плазматических мембран 27-34
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материал исследования 35-36
2.2. Методики исследования 36
2.2.1. Методика выделения плазматических мембран 36-40
2.2.2. Определение белка 40
2.2.3. Электронно-микроскопический метод 40
2.2.4. Определение 5»-нуклеотидазы 40
2.2.5. Определение АТФ-аз мембран 41
2.2.6. Методика экстракции липидов 42
2.2.7. Методика тонкослойной хроматографии . 42
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Изменение активности нуклеотидазы в процессе эмбрионального развития 44
3.2. Влияние облучения в дозе 0,05 Гр на активность АТФ-аз и 5'-нуклеотидазы плазматических мембран печени 45-50
3.3. Влияние облучения в дозе плазматических мембран печени эмбрионов 50-53
3.4. Исследование содержания фосфолипидов плазматических мембран клеток печени
кур в процессе эмбриогенеза и при облучении в дозе 0,05 Гр 53-61
3.5. Изучение содержания фосфолипидов плазматических мембран эмбрионов кур
при облучении в дозе 6,5 Гр 61-67
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 69-87
ВЫВОДЫ 88-89
ЛИТЕРАТУРА 91-122
- Структура, ферментный состав и функции плазматических мембран
- Материал исследования
- Изменение активности нуклеотидазы в процессе эмбрионального развития
- ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Введение к работе
Изучение плазматических мембран имеет важное значение в решении основных проблем эмбриологии, биохимии, физиологии, иммунологии, радиобиологии и других биологических наук.
В последние годы достигнуты большие успехи в изучении структуры и ферментного состава плазматических мембран. Установлено, что плазмолемма заметно отличается от других мембран клетки не только по набору ферментов, содержанию фосфолипидов, но и по функциональным свойствам (В.В.Сова, Ю.П.Чугуев, 1979; Е.М«Крепе,1981; В.Ф.Антонов,1982; Л.Д.Бергельсон,1982; Р.Н. Calcott, A.H.Rose,1982; J.R.Silvihg, R.N.McElhaney,I982).
Число ферментов, обнаруженных на плазматической мембране, превышает несколько десятков. Среди них наиболее характерными являются 5'-нуклеотидаза и На+, к+,к^2+-АТФ-азы. Многолетними исследованиями установлено, что Na+,K+- АТФ-аза является важнейшим компонентом На+- насоса и обеспечивает перенос ионов через клеточные мембраны. Соотношение натрия и калия внутри клетки оказывает влияние на такие важные процессы, как дыхание, гликолиз, синтез белков и др.
5*-нуклеотидаза также имеет важное значение в функционировании плазматических мембран, участвует в поддержании гема-тоэнцефалического барьера, синтезе мембран и деградации РНК (С.Т.Рыскулова,1979; А.И.Дворецкий с соавт.,1981).
Известно, что мембранные фосфолипиды и белки, обеспечивая специфическую проницаемость биомембран, участвуют в регуляции метаболизма клетки и ее жизнедеятельности. Липидное окружение мембраносвязанных ферментов является важной состав-
ной частью их регуляторного аппарата (CD.Linden et al.,I974; Л.Д.Бергельсон,1975; Е.Б.Бурлакова,1978). Изучение фосфоли-пидного состава биологических мембран имеет существенное значение в выяснении механизмов их функционирования.
В связи с этим, изучение мембраносвязанных ферментов и их липидного окружения в процессе эмбрионального развития представляет несомненный интерес в понимании механизмов регуляции гистогенеза органов и тканей. Однако, к сожалению, биохимическое изучение плазматических мембран в эмбриональном развитии по существу только начинается.
Нарушение биоэнергетики, проницаемости и транспорта ионов в клетках при экстремальных воздействиях, в частности при облучении, во многом обусловлено изменением состояния АТФ-аз, встроенных в плазматическую мембрану. Кроме того, имеются веские доказательства, что липиды мембран являются мишенью при облучении (Б.И.Медведев с соавт.,1975; Ю.Б.Кудря-шев,1979; Д.Мид,1979). Однако, данные о пострадиационных изменениях липидного состава и активности некоторых мембраносвязанных ферментов плазмолеммы клеток печени в процессе эмбрионального развития весьма скудны.
Проблема использования стимулирующего действия малых доз приобретает огромное практическое значение во многих отраслях народного хозяйства, в частности, в птицеводстве (А.М.Кузин, П.А.Хакимов,1967; П.А.Хакимов,1978). На куриных эмбрионах обнаружен эффект ускорения роста и развития при стимулирующих дозах радиации, однако механизмы этого эффекта изучены недостаточно (В.А.Варданян,1964; С.К.Карапетян с соавт.,1965; Х.Ф.Купшер с соавт.,1966; М.С.Найденский,1966; E.Brard,i968;
K.Takao et al.,I968; P.S.Billet et al.,I970; R.W.Oppenheim et al.,I970; S.P.Stearner,1972; А.М.Кузин,І975; П.А.Хакимов, 1978).
Единичные работы посвящены изучению функциональных свойств биомембран при низких дозах, вызывающих стимулирующий эффект на развитие (Л.В.Сложеникина с соавт.,1980; Т.Е.Ушакова с соавт.,1980).
Способность биомембран по-разному реагировать на облучение в болышх и малых дозах, их большая радиочувствительность и вероятность конформациошшх изменений, сопровождаемых изменением активности мембраносвязанных ферментов, позволяют предположить об участии ферментов и фосфолипидов плазматической мембраны в формировании стимулирующих эффектов при облучении организма в малых дозах.
Таким образом, изучение ферментов и фосфолипидов плазматических мембран в эмбриогенезе и при действии различных экстремальных факторов, в частности, малых и сублетальных доз ионизирующей радиации, представляет несомненный интерес в решении неясных проблем биологии развития и радиобиологии.
Целью настоящей работы явилось изучение отдельных мембраносвязанных ферментов и фосфолипидов плазмолеммы клеток печени кур в процессе эмбрионального развития и при облучении в различных дозах ионизирующей радиации. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
I. Изучить динамику изменения активности 5'-нуклеотидазы, Жа+, К+ и Mg2+- АТФ-аз, а также фосфолипидов плазматических мембран клеток печени куриных эмбрионов в различные сроки пренатального онтогенеза.
Е. Изучить влияние малой дозы (0,05 Гр) ионизирующей радиации на ферментативную активность и фосфолипидный состав плазмолеммы гепатоцитов куриных эмбрионов при облучении до инкубации и в различные сроки эмбрионального развития.
3. Выявить, существует ли возможная связь между активностями ключевых ферментов и их фосфолипидным окружением и как сказываются процессы облучения эмбрионов в сублетальной дозе (6,5 Гр) в различные сроки пренатального онтогенеза на свойствах этих компонентов мембран.
В результате проделанной работы получен ряд новых данных и заключений. В частности, показано, что в процессе эмбрионального развития кур увеличивается активность На4*, К+ и Щ -АТФ-аз и происходит изменение в содержании отдельных фракций фосфолипидов плазматических мембран печени. Показано, что изменения в активности этого фермента связаны с изменениями в содержании существенных для Na+, к+-АТФ-азы, фосфатидилсери-на, фосфатидиловой кислоты. Возрастание активности другого ключевого фермента 5*-нуклеотидазы также коррелирует с изменениями фосфолипидного состава плазматической мембраны. Показано, что доинкубационное облучение в дозе 0,05 Гр повышает активность ферментов плазмолеммы печени во все исследуемые сроки развития куриного эмбриона. При изучении влияния сублетальной дозы (6,5 Гр) ионизирующей радиации на ферментативную активность плазматических мембран гепатоцитов куриного эмбриона установлена неодинаковая радиочувствительность различных форм АТФ-аз. Доинкубационное облучение яиц в малой дозе увеличивает содержание фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина и уменьшает содержание сфингомиелина и кислых фосфолипидов
плазмолеммы развивающихся эмбрионов. Эти изменения в фосфоли-пидном окружении исследуемых ферментов непосредственно связаны с изменением их активностей.
Результаты исследований об активности мембраносвязанных ферментов и фосфолипидов расширили наши представления о становлении структуры и функций мембран в процессе онтогенеза. Сравнительные данные о влиянии стимулирующей и сублетальной доз ионизирующей радиации на биохимические показатели плазмолеммы имеют существенное значение в разработке механизмов действия облучения на биологические мембраны.
Полученные результаты имеют не только теоретическое, но и практическое значение. Данные исследований о влиянии малой дозы радиации на ферментативную активность и содержание фосфолипидов плазмолеммы гепатоцитов могут служить теоретической основой для внедрения метода доинкубационного облучения яиц в промышленное птицеводство. Они могут быть также использованы в научно-исследовательских лабораториях, занимающихся изучением мембран в процессе онтогенеза и при экстремальных воздействиях.
Структура, ферментный состав и функции плазматических мембран
Клетки животных окружены плазматической мембраной. Плазматическая мембрана клетки является той физической границей, которая отделяет внутреннее содержание клетки от внешней среды. Такое расположение поверхностной мембраны определяет ее важную роль в осуществлении целого ряда самых разнообразных клеточных функций. Плазматическая мембрана регулирует поступление молекул и ионов в клетку и их выход из клетки наружу (Л.Д.Бергельсон,1975). Все те внешние стимулы, которые клетка воспринимает как информацию, должны либо проникать через мембрану, либо взаимодействовать с ней. Подобным же образом все воздействия клетки на окружающую среду либо передаются через мембрану, либо инициируются ею. Этим и обусловлен неослабевающий интерес исследователей к изучению молекулярной организации и функциональных свойств плазматической мембраны.
Молекулярная организация биологических мембран одна из актуальных проблем современной биологии. Биологическая мембрана сложна гигантским многообразием молекул ее составляющих, своей полифункциональностью и изменчивостью.
Как уже говорилось, основная функция клеточных мембран -это ограничение клеток от окружающей среды, отдельных клеточных компонентов друг от друга. Но роль мембран далеко не ограничивается разделительной функцией. Клеточные мембраны поддерживают концентрационные и электрохимические градиенты, обеспечивают перенос питательных веществ и продуктов обмена в клетку и из клетки. Плазматические мембраны служат местом прикрепления антигенов, участвуют в генерации и передаче нервного импульса и выполняют еще ряд других функций. Прохождение через мембрану различных веществ зависит от свойств, составляющих их молекул и характеристики мембран.
На сегодняшний день среди многочисленных моделей плазмо-леммы наиболее распространенной является модель С.І.Сингера и Г.Л.Николсона (S.J.Singer, G.L.Nicoison,l972). Основными структурными компонентами клеточных мембран являются липиды и белки. В состав мембран входят также углеводы, сиаловая кислота. Мембраны состоят примерно на 40$ из липидов и на 60$ из белков (W.T.Narton, S.E.Poduslo,I97I; Y.Tamai et al.,I97I; J.В. Pinean,I973; E.M.Bailyes et al.,I98I).
Для сохранения ультраструктуры мембран, существенное значение имеет нативность липидов. Важнейшее свойство липидов мембран - это их способность спонтанно принимать упорядоченную структуру, благодаря наличию в них полярных и неполярных группировок (И.Ш.Вайсман,1966; Y.Kawai, R.G.Spiro,I977). Мембранные липиды необходимы для осуществления транспортных функций таких ферментных систем, как АТФ-аза (R.Colетап,1973; G.Lenas,I974; Х.Микельсар с соавт.,1974). Липиды участвуют в регуляции метаболизма клетки и ее жизнедеятельности. Они играют фундаментальную роль в процессах передачи информации, передачи и хранения энергии (D.Е.Weiss,1973). Липиды являются как бы матрицей, изменения в которой определяют конформацию ферментов и их микроокружения.
Материал исследования
Объектом исследования служили плазматические мембраны ге-патоцитов развивающихся куриных эмбрионов. Из данных литературы известно, что с 6 дня инкубации начинается синтез гликогена в печени (В.В.Рольник,1968), на 8 день обнаруживаются ферменты, принимающие участие в гликогенезе (M.T.Rinoudo, 1962), на 10 день развития активность глюкозо-6-фосфатазы имеет значительные величины (Л.Г.Лейбсон с соавт.,1963). Дальнейшее нарастание содержания гликогена в печени эмбриона приходится на 10,13,16 и 19 дни эмбрионального развития (В.В. Рольник,1968).
С 9-дневного возраста эмбрионального развития начинается участие печени в жировом обмене, однако до 10 дня печень эмбриона еще не способна расщеплять насыщенные жирные кислоты. На 10 день развития в печени происходит образование желчи и поступление ее в желчный пузырь, а на следующий день желчь поступает в пищеварительный тракт. Постепенное повышение активности липазы с 8 по 14 дни развития эмбриона сменяется резким подъемом и достигает максимума на 16 день. После 17 дня развития эмбриона в печени резко нарастает содержание ли-пидов (В.В.Рольник,1968).
Исходя из вышеизложенного, для определения фосфолипидов и мембраносвязанных ферментов плазмолеммы гепатоцитов нами были выбраны следующие сроки развития куриных эмбрионов: 10, 10, 16 и 19 сутки.
Исследования плазмолеммы гепатоцитов провели при следующих условиях:
1. У нормальных куриных эмбрионов на 10, 13, 16 и 19 дни развития.
2. У 10, 13, 16 и 19-дневных эмбрионов, после доинкубационно-го однократного облучения яиц в дозе 0,05 Гр (5 Р).
3. У 10, 13, 16 и 19-дневных куриных эмбрионов, однократно облученных в дозе 0,05 Гр через час и 24 часа после облучения.
4. У 10, 13, 16 и 19-дневных эмбрионов, однократно облученных в дозе 6,5 Гр, являющейся сублетальной для куриных эмбрионов (Б.Тодоров,1974,1978; П.Г.Дряновски, Б.Тодоров,197 ; С.Туйчиев,1981).
Облучение яиц и эмбрионов проводили на гамма-установке Со60 (мощность 0,0158 Гр/сек.) при Институте ядерной физики АН УзССР.
Изменение активности нуклеотидазы в процессе эмбрионального развития
Результаты наших исследований показали, что в процессе эмбрионального развития кур в плазматических мембранах печени активность исследуемых ферментов постепенно повышается. Действительно, в процессе развития зародышей активность Na+, к+, Mg2+- АТФ-аз плазмолеммы 13-дневных эмбрионов возрастает на 18,2%, Mg2+- АТФ-азы - на 4,7%, 5 -нуклеотидазы - на 7,7% по сравнению с 10-дневными эмбрионами. На 16 день развития у эмбрионов кур показатели активности ферментов увеличиваются -Na+,K+- АТФ-азы на 27,2%, Mg2+- АТФ-азы на 7,1% и 5 -нуклеоти-дазы - на 20,5% по сравнению с 10-дневными.
Активность Яа+,к+- АТФ-азы у 19-дневных эмбрионов увеличивается на 36,4%, Mg2+- АТФ-азы на 9,5% и 5 -нуклеотидазы на 28,2% по сравнению с 10-дневными.
Таблица I Активность ферментов плазмолеммы гепатоцитов в процессе эмбриогенеза (в мкг Р неорг. на I мг белка за I час)
Таким образом, результаты исследования активностей Na+, К+ и Mg2+- АТФ-аз и 5 -нуклеотидазы плазматических мембран печени эмбрионов кур показали равномерное увеличение их в процессе пренатального онтогенеза.
Обсуждение результатов
В последние годы интенсивно изучаются изменения активности ферментов в онтогенезе (А.А.Симонян,1966; J.Pearce, 1972; P.P.Wilson,1972; A.E.Goodridge,I973; A.Base et al., 1975; T.U.Yreta et al.,1975; J.A.Storyetal,I976; D.S.Kilpat-rick, J.L.Stirling,1978; Т.Ю.Коваль,1979). Однако сведения по исследованию мембраносвязанных ферментов плазматических мембран в процессе эмбрионального развития кур в норме и при действии облучения весьма скудны и противоречивы.
Результаты проведенных нами исследований показали, что в процессе эмбрионального развития кур постепенно увеличивается активность маркерных ферментов Na+, к+ и Mg2+- АТФ-аз и 5 -нуклеотидазы плазматических мембран печени. Аналогичные данные получены в процессе развития куриного зародыша с 10 по 16 день инкубации при исследовании активности цитохромоксида-зы митохондрий клеток печени (Т.Ю.Коваль,1979).
Значительная часть исследований АТФ-аз в онтогенезе посвящена Na+,K+- АТФ-азе. По данным Р.Б.Бадаляна (1980), в ходе развития куриного эмбриона АТФ-азная активность в гомогенате, интактных митохондриях и супернатанте печени постепенно возрастает с плодного периода до выклева цыпленка.
Исследования, проведенные на различных видах животных, также показали увеличение Па+,к+- АТФ-азы в процессе онтогенеза. Так, в ходе эмбрионального развития у ооцитов лягушки, а также улитки крысы, постепенно увеличивается активность Na+, К+- АТФ-азы (G.A.Morrill,1974). Аналогичные данные получены на изолированных плазматических мембранах эритроидных клеток (L.N.Chan et al.,I978).
В процессе эмбрионального развития кур активность Mg2+-АТФ-азы плазматических мембран печени постепенно возрастает. Сходные результаты получены G.Kaldor, B.K.Min (1975) при исследовании активности фермента в гомогенате мышц развивающихся куриных эмбрионов.
Вместе с тем имеются сведения об ином характере изменения активности фермента в процессе развития. Так, активность Mg2+ -АТФ-азы ядер клеток печени кролика до 23-го дня развития постепенно повышается, а затем в последующие сроки значительно снижается (М.М.Джураева,1983).
Известно, что созревание клеток в процессе онтогенеза сопровождается структурной и функциональной модификацией их мембран, в том числе плазмолемш. Установлено, что в процессе дифференцировки эритроцитов (S.Fischer et al.,I979; D.Piatt, H.Haas,1979) И регенерирующих печеночных клеток (G.H.Wright, 1977) увеличивается активность Na+, к+ и Mg2+- АТФ-аз плазматических мембран. Повышение активности указанных ферментов плазматических мембран гепатоцитов в процессе онтогенеза, по-видимому, связано с увеличением количества дифференцированных клеток в печени развивающегося эмбриона.
Результаты наших исследований показали, что в процессе эмбрионального развития кур в плазматических мембранах печени постепенно повышается активность 5 -нуклеотидазы. Возрастные изменения 5»-нуклеотидазы отмечены и другими исследователями. Так, в печени мышей активность 5 -нуклеотидазы остается повышенной в раннем онтогенезе, затем постепенно снижается и сильно падает у старых особей (P.D.Wiisonl972). Аналогичные результаты получены при исследовании возрастных изменений 5 -нуклеотидазы мембран тимоцитов (L.A.Menahan, R.G.Kemp,1982 ). Удельная активность 5 -нуклеотидазы в мембранах тимоцитов повышается при увеличении возраста.
При изучении активности 5 -нуклеотидазы и аденилатцик-лазы хондриоцитов куриных эмбрионов обнаружено, что в процессе созревания хряща активность 5 -нуклеотидазы возрастает в 10 раз, активность аденилатциклазы не меняется (G.A.Rodan et al.,1977). Авторы предполагают, что 5 -нуклеотидаза является частью связанного с мембранами ферментативного комплекса, влияющего на поток межклеточной информации. Изменение активности этих ферментов, возможно, необходимо для координации генетической и эпигенетической регуляции в процессе цитодиф-ференцировки.
Таким образом, возрастание активности мембраносвязанных ферментов плазмолеммы в процессе эмбрионального развития кур, по-видимому, свидетельствует об увеличении молекул ферментов, что, очевидно, связано с усложнением дифференцированноети мембран клеток печени параллельно с увеличением срока инкубации.
Об увеличении биосинтетических процессов клеток печени с увеличением срока инкубации свидетельствует также усложнение структуры гладкого и зернистого цитоплазматического ретикулу-ма. Кроме того, нарастание активности ферментов в процессе эмбрионального развития связано с накоплением гликогена и жиров в печени.
