Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Распространение лакказ и их физиологическая роль 9
1.1.2. Растительные лакказы 11
1.1.3. Грибные лакказы 17
1.1.4. Бактериальные оксидазы с лакказной активностью 21
1.2. Структура и свойства каталитического центра 28
1.3. Механизм катализа 32
1.4. Ингибирование лакказной активности 37
1.5. Биохимические свойства лакказ 43
1.6. Биоэлектрокаталитические свойства лакказ 47
1.7. Практическое использование лакказ 55
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 57
2.1. Изучаемые ферменты 57
2.2. Стадии очистки ферментных препаратов 58
2.3. Реактивы, использованные в работе 59
2.4. Аналитические методы 60
2.4.1. Определение концентрации белка 60
2.4.2. Контроль каталитической активности 60
2.5. Определение молекулярной массы 61
2.6. Кинетические измерения 61
2.6.1. Исследование рН-зависимости реакций и кинетические исследования 61
2.6.2. Регистрация окисления хелатированных ионов Мп2+ до Мп3+, катализируемого лакказами 62
2.6.3. Определение констант ингибирования активности лакказы Т. hirsuta 63
2.7. Электрохимические методы исследования ферментов 63
2.7.1. Подготовка и модификация графитовых электродов 63
2.7.2. Подготовка и модификация стеклоуглеродного электрода 63
2.7.3. Вольтамперометрические исследования 64
2.8. Исследование продуктов окисления вератрового спирта интермедиатами, образующимися при ферментативном окислении хелатированных ионов двухвалентного марганца 65
2.9. Получение электропроводного комплекса панияіампс 66
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 68
3.1. Получение гомогенных препаратов лакказ 68
3.2.Эффективность биокаталитического окисления цианидных комплексов переходных металлов лакказами Т. hirsuta и R. vernicifera 69
3.3. Окисление ионов мп2+, хелатированных тартратными и оксалатными анионами, в присутствии грибных и древесной лакказ 76
3.4. Сравнение рн-зависимости реакций окисления субстратов-доноров электронов и доноров атомов водорода высоко и низко редокс-потенциальными лакказами 87
3.5. Возможность синтеза электропроводящего полианилина с участием высоко и низко редокс-потенциальных лакказ 91
3.6. Биоэлектрокаталитическое восстановление молекулярного кислорода на углеродных электродах с участием лакказ Т. hirsata,C. maxima И R. vernicifera 96
3.7. Электрокаталитические свойства бактериальной голубой медьсодержащей оксидазы Bacillus halodurans 104
3.8. Безмедиаторное электровосстановление молекулярного кислорода на электродах с иммобилизованной бактериальной лакказо-подобной оксидазой 110
3.9. Результаты исследования возможности использования лакказ для создания катода биотопливного элемента 113
Выводы 115
Список литературы 116
- Распространение лакказ и их физиологическая роль
- Ингибирование лакказной активности
- Изучаемые ферменты
- Получение гомогенных препаратов лакказ
Введение к работе
Уникальные каталитические свойства ферментов обеспечили им применение в
самых разных областях биотехнологии: от научных исследований до промышленных процессов. К настоящему времени охарактеризовано большое число ферментов, для многих из которых получены трехмерные структуры с высоким разрешением, достаточно подробно описаны их биохимические и каталитические свойства и предложен вероятный механизм проявления биологической активности. Кроме того, на основе полученных данных, используя метод направленного мутагенеза, создаются ферменты с повышенной стабильностью и каталитической эффективностью. Все вышеперечисленное расширяет сферу практического использования ферментативного катализа.
Семейство лакказ, первый представитель которых впервые был обнаружен более столетия назад в соке японского лакового дерева Rhus vernicifera, по-прежнему остается предметом интенсивных фундаментальных исследований. Ферменты этого семейства найдены не только в растениях, но также в грибах, бактериях и насекомых. Лакказа [КФ 1.10.3.2] обладает способностью непосредственно катализировать окисление различных соединений молекулярным кислородом, включая о- и я-дифенолы, аминофенолы, полифенолы, полиамины, арилдиамины, фенольные подструктуры лигнина, а также некоторые неорганические ионы. Кроме того, фермент способен осуществлять прямой биоэлектрокатализ реакции восстановления молекулярного кислорода по механизму прямого безмедиаторного переноса электрона с электрода на активный центр лакказы с последующим восстановлением кислорода до воды. Физиологические функции лакказ разнообразны: участие в процессах
формирования пигментов и образования плодовых тел грибов, биодеградация
лигнина и детоксификация фенолов. В связи с вышеперечисленными особенностями данного семейства ферментов они интенсивно используются в различных отраслях биотехнологии.
Большое число работ посвящено поиску и изучению новых штаммов базидиальных грибов - продуцентов лигнинолитических ферментов, и нахождению ферментов с новыми физико-химическими свойствами, что связано с возможными широкими прикладными аспектами их использования. Примерами применения лакказ являются получение биосвязующих для экологических древесно-стружечных плит [Болобова с соавт., 2002], создание биотопливных элементов [Heller et al., 2003; Heller, 2006; Coman et al., 2008], биодеградация ксенобиотиков [Johannes et al., 1996; Shintaro et al., 2001], производство антимикробных [Johansen et al., 2003], синтетических моющих [Boutique et al., 2004; Gardner et al., 2006] и косметических средств [Onuki et al., 2000; Aaslyng et al., 2002; Lang & Cotteret, 2006], использование ферментов в органическом синтезе [Echido et al., 2001; Karamyshev et al., 2003], аналитических системах [Kruus, 2000; Duran et al., 2002; Ярополов с соавт., 2005; Shleev et al., 2006; ], а также текстильной [Barfoed et al., 2004; Damkhus et al., 2002], пищевой [Huang et al., 2001; Si, 2001] и целлюлозно-бумажной промышленностях [Cheng et al., 2003; Pedersen et al., 2001; Lund & Felby, 2003; Jetten et al., 2004].
Интерес к изучению этих ферментов обусловлен, прежде всего, их каталитическими характеристиками и субстратной специфичностью. В последнее время все большие масштабы приобретает использование биокаталитических технологий в промышленности, что, возможно, связано с экологической безопасностью производства на их основе [Call and Мьске, 1997; Kruus, 2000;
Mayer and Staples, 2002; Couto and Herrera, 2006]. Промышленное получение биокатализаторов с использованием технических ферментных препаратов является экономически выгодным. Об этом свидетельствует возрастающий объем продаж технических препаратов ферментов на мировом рынке, который в 2007 году составил около 2.3 миллиарда долларов.
Помимо использования лакказ в качестве биокатализаторов различных биотехнологических процессов, они представляют большой интерес с точки зрения фундаментальных исследований их структуры и механизма катализа. Интерес связан с особенностями строения активного центра лакказ, в который входят четыре иона меди трех различных типов, координированное взаимодействие которых позволяет осуществлять восстановление молекулярного кислорода непосредственно до воды, минуя стадию образования пероксида водорода. Реакции окисления органических соединений с участием лакказ протекают по свободно-радикальному механизму, который в настоящее время изучен слабо. Кроме того, лакказа является одним из важнейших компонентов лигнолитического комплекса дереворазрушающих грибов белой гнили, осуществляющих разложение (а в некоторых случаях и синтез) одного из наиболее распространенных природных полимеров - лигнина, и роль лакказы в этих процессах до конца неизвестна.
В связи с вышесказанным, актуальным является проведение сравнительного исследования лакказ из различных источников с целью выяснения сходства и различий в механизмах их действия, что, в свою очередь, является основой для их дальнейшего практического использования в таких областях, как ферментативный синтез, биоэлектрокатализ и биодеградация ксенобиотиков. В зависимости от конкретного случая практического использования, к ферментам предъявляются
весьма различные требования. Поэтому в настоящей работе было проведено сравнение физико-химических свойств лакказ из различных источников с целью определения и прогнозирования возможности их использования в тех или иных областях.
Распространение лакказ и их физиологическая роль
Лакказы - [п-дифенол:кислород оксидоредуктаза, КФ 1.10.3.2.] класс ферментов, широко распространенных в природе в растениях, грибах, а так же некоторых бактериях и насекомых. Первая научная работа, посвященная изучению лакказ, а именно, обнаружению ферментативной активности в соке японского лакового дерева, появилась еще в 1883 году. Этим ферментом была лакказа Rhus vernicifera [Yoshida, 1883]. Впоследствии лакказы были обнаружены в других растениях, например, в клене [Bligny and Douce, 1983], табаке [De Marco and Roubelakis-Angelakis, 1997] и персике [Lehman et al., 1974]. Лакказная активность была обнаружена в ксилеме, где фермент, возможно, участвует в процессах синтеза лигнина на ранних стадиях развития растений [Bao et al., 1993; O Malley et al., 1993; Mayer and Staples, 2002; Gavnholt and Larsen, 2002]. Обнаружение и очистка растительных лакказ часто затруднены, т.к. грубые экстракты растений содержат большое количество других разнообразных ферментов с широкой субстратной специфичностью [Ranocha et al., 1999].
Лакказа R. vernicifera - наиболее изученная растительная лакказа, особенно, что касается ее спектральных характеристик [Malmstrom et al., 1970; Woolery et al, 1984]. Этот фермент активно использовался в качестве объекта при исследовании общего механизма катализа лакказами [Battistuzzi et al., 2003; Johnson et al., 2003; Lee et al., 2002].
Среди грибных лакказ наиболее изучены ферменты базидиомицетов, участвующие в процессах деградации лигнина. К известным продуцентам лакказ относятся грибы Agaricus bisporus [Wood, 1980], Botrytis cinerea [Marbach et al., 1984], Chaetomium thermophilum [Chefetz et al., 1998], Coprinus cinereus [Schneider et al., 1999], Neurospora crassa [Froehner and Eriksson 1974], Phlebia radiate [Niku-Paavola et al., 1988], Pleurotus ostreatus [Sannia et al., 1986], Pycnoporus cinnabarinus [Eggert et al.,1996b] и Trametes (Coriolns, Polyporas) versicolor [Rogalski et al., 1991].
Грибные лакказы выполняют различные функции. Например, показано, что лакказы из грибов белой гнили Trametes versicolor и Pycnoporus cinnabarinus участвуют в процессах биологического распада лигнина, где они, главным образом, катализируют окисление фенольных подструктур лигнина [Bourbonnais and Paice, 1990; Eggert et al.,1996a; Thurston, 1994; Hatakka, 2001].
В настоящее время описано лишь несколько бактериальных лакказ или, как их принято называть, лакказо-подобных медьсодержащих оксидаз. Первая бактериальная лакказа была обнаружена в Azospirillum lipoferum - бактерии, обитающей в клубеньках растений [Givaudan et al., 1993]. Предполагается, что одна из функций этого фермента в бактерии заключается в формировании меланина. Причем, A. lipoferum является единственным микроорганизмом, для которого была доказана причастность секретируемых им лакказ к процессам образования меланина [Faure et al., 1994]. Нетипичные, содержащие шесть ионов меди, лакказо-подобные оксидазы, способные катализировать окисление такого субстрата лакказ как катехол, были обнаружены у Marinomonas mediterranea [Solano et al., 1997; Sanchez-Amat et al., 2001]. Данный микроорганизм продуцирует две полифенолоксидазы, одна из которых является тирозиназо-подобной, а другая обладает тирозиназо- и лакказо-подобной активностью, т.е. может катализировать окисление как тирозина, так и серингалдазина. Bacillus subtilis продуцирует стабильную лакказу, которая, возможно, участвует в образовании пигментов оболочки эндоспор [Martins et al., 2002]. Совсем недавно ферменты с лакказной активностью были найдены в Streptomyces cyaneus [Arias et al., 2003] и Streptomyces lavendulae [Suzuki et al., 2003].
Кроме растений, грибов и бактерий лакказы были обнаружены в некоторых насекомых, где они, как считается, участвуют в процессах склерофикации кутикулы [Sugumaran et al., 1992; Dittmer et al., 2004]. Ниже приведена более подробная характеристика трех основных групп лакказ. Как уже было сказано ранее, первая лакказа была выделена из сока японского лакового дерева R. venicifera [Yoshida, 1883]! Иошида обнаружил, что сок этих растений быстро полимеризуется на воздухе. Несколькими годами позже был выделен фермент, катализирующий этот процесс, и этот фермент был назван лакказа [Reinhammar, 1984; Reinhammar В, 1970]. Именно тогда был введен термин «оксидаза» для ферментов, активирующих молекулярный кислород, и предположено, что ионы металлов «составляют неотъемлемую часть ферментов». Однако только в 1939 году Кейлин и Манн [Keilin and Mann, 1939] показали, что лакказа является метал-содержащим ферментом. На протяжении многих лет лакказа R. vernicifera являлась предметом детального изучения. Впоследствии были найдены и другие растительные лакказы, но наиболее изученным является фермент R. vernicifera. Лакказа R. vernicifera - первый фермент, для которого было показано участие в процессе образования лигнина in vitro [Freudenberg et al., 1958], поэтому было высказано предположение, что этот фермент играет ту же самую роль in vivo. В 1959 году Фрейденберг показал, что лигнин может образоваться из мономеров под действием лакказ и пероксидаз [Freudenberg, 1959]. Однако позже, в работе [Nakamura, 1967] было показано, что лакказа Rvernicifera не катализирует окисление мономеров лигнина, т.к. лакказная активность не была обнаружена в зоне одревесневения растений, где наиболее интенсивно идет процесс образования названного полимера [Harkin and Obst, 1973]. Возможно, эти результаты связаны с неустойчивостью лакказы, а так же трудностями в оптимизации условий проведения реакции in vivo [Dean and Eriksson, 1994; Okusa et al., 1996].
Ингибирование лакказной активности
Эффект ингибирования активности лакказ различными соединениями исследовали во многочисленных работах, но многие особенности ингибирования до настоящего времени остаются невыясненными. В основном, в работах рассматривались частные случаи ингибирования конкретной лакказы одним или несколькими соединениями или ионами, в то время как общие закономерности ингибирования активности лакказ рассмотрены не были.
Наиболее полно механизм ингибирования грибной лакказы Polyporus versicolor был описан в работе [Наки с соавт., 1981] на примере галогенид-ионов. В ней было показано, что ион фтора является неконкурентным ингибитором лакказы при катализе реакций окисления субстратов-доноров электронов, т.е. он не влияет на образование фермент-субстратного комплекса. Связываясь с Т2-ионом меди, фторид-анион блокирует перенос электронов на кислород, однако, при этом способность активного центра связывать кислород не только не теряется, но даже увеличивается. Фторид-ион, образуя комплекс с Т2 центром, стабилизирует белковую молекулу, однако практически полностью исключает возможность последующего восстановления молекулярного кислорода. При исследовании ингибирования активности лакказы ионами хлора и брома было показано, что эти ионы также блокируют деятельность фермента, однако, механизм ингибирования отличается от механизма действия ионов фтора. Хлорид- и бромид-ионы являются конкурентными ингибиторами по отношению к субстратам-донорам электронов. Возможно, это свидетельствует о том, что ионы хлора и брома связываются не с Т2 центром, а с другим участком фермента, например, ТІ центром. Различия в местах связывания ионов фтора и хлора (или брома) авторы объясняют тем, что ион меди второго типа находится внутри «электростатического кармана», радиус прохода к которому меньше радиуса хлорид-иона. Поэтому хлорид ион не имеет доступа к этому центру связывания и образует комплек с другим более доступным участком активного центра.
В этой же работе было показано, что константа ингибирования активности лакказы ионами фтора и хлора зависит от рН раствора. При нейтральных значениях рН скорость ферментативного окисления снижается, по сравнению со скоростью реакции в более кислых средах. Исследование рН-зависимости скорости ферментативной реакции показало, что в активный центр фермента входят по крайней мере две кислотно-основные группы. Связывание с этими группами гидроксил-ионов приводит к потере ферментом каталитической активности.
Различные лакказы обладают разной степенью толерантности по отношению к действию ингибиторов, что указывает на различия в доступности для молекулы ингибитора ТІ центра или трехъядерного Т2/ТЗ кластера [Xu, 1996b]. В работе [Spira-Solomon et al., 1986] было высказано предположение, что связывание фторид-иона с Т2/ТЗ центром происходит тогда, когда фермент находится в полностью окисленной форме. Этим можно объяснить тот факт, что самыми эффективными ингибиторами лакказ являются анионы с небольшим радиусом, такие как азид, цианид- и фторид-ионы, которые связываются с Т2/ТЗ центром и, тем самым, блокируют перенос электронов на молекулярный кислород [Solomon et al., 1996; Xu, 1996a; Battistuzzi et al., 2003; Johnson et al., 2003]. Другие ингибиторы лакказ, такие как ЭДТА, кумариловая кислота, являются существенно менее эффективными ингибиторами [Wood, 1980; Bollag and Leonowicz, 1984; Faure et al., 1995; Eggert et al., 1996b; Chefetz et al., 1998; Sethuraman et al., 1999; Xu, 1999; Jung etal.,2002]. Спектральные исследования показали, что азид-ионы также связываются с Т2/ТЗ центром [Xu et al., 1998]. Ниже приведена схема расположения азид-иона в Т2/ТЗ медном центре, а так же показаны расстояния между атомами азота в азиде, ионами меди и аминокислотным остатком глутамина активного центра фермента В. subtilis (Рис. 5).
Необходимо отметить, что Gly498 принимает участие в формировании канала доступа к трехъядерному медному кластеру, а так же, вероятно, является источником протонов при восстановлении молекулярного кислорода до воды [Bento et al., 2005]. Азид является в семь раз более эффективным ингибитором лакказной активности R. \ernicifera, по сравнению с фторидом [Daniel et al., 2003]. Что касается ионов фтора, то в работе [Xu et al., 1998] было высказано предположение, что они специфически связываются непосредственно с Т2 центром лакказы. При иммобилизации лакказ увеличивается их устойчивость к действию различных ингибиторов. Так, например, лакказа Т. hirsuta в гомогенном состоянии сохраняла приблизительно 50% своей активности при концентрации 50 мМ NaCl, в то время как иммобилизованный на силанизированных аммониевых шариках фермент сохранял половину активности в 85 мМ растворе NaCl [Abadulla et al., 2000]. Имеются данные о других грибных лакказах, сохраняющих половину первоначальной активности при концентрации хлорид-ионов 600 мМ [Хи, 1996а]. В Табл. 5 приведены концентрации различных ингибиторов лакказ, при которой активность фермента снижается на 50% [Abadulla et al., 2000]. По всей вероятности степень ингибирования лакказ галогенид-ионами зависит от доступности ионов меди и поэтому может варьироваться между различными видами лакказ. По-видимому, растительные лакказы имеют более широкий канал доступа к Т2/ТЗ центру по сравнению с грибными лакказами, что может объяснить более сильный эффект ингибирования для растительных лакказ [Abadulla et al., 2000].
Изучаемые ферменты
Объектами исследования являлись лакказы из грибов Trametes hirsuta и Cerena maxima , фермент из сока лакового дерева Rhus vernicifera, медьсодержащий лакказо-подобный рекомбинантный фермент Bacillus halodurans, экспрессированный в Е. соїі. В работе также использовался коммерческий ферментный препарат лакказы Myceliophthora termophila фирмы «Novozymes». Лакказы Т. hirsuta и С. maxima были выделены из культуральной жидкости культивируемых базидиомицетов. Фильтраты культуральной жидкости данных грибов были любезно предоставлены к.б.н. Горшиной Е. С. (МГУИЭ, Москва). Глубинное культивирование штаммов-продуцентов базидиальных грибов Т. hirsuta и С. maxima проводили в ферментационных аппаратах «Marubishi» (Япония) по методу, описанному в работе [Горшина с соавт., 2006]. Биомассу отделяли при помощи полиамидного рукавного фильтра.
Ферментный препарат из латекса лакового дерева R. vernicifera был любезно предоставлен проф. Бенктом Рейнхаммером (Швеция). В дальнейшем он был дополнительно очищен методом гель-проникающей хроматографии до гомогенного состояния по данным ДДС-электрофореза.
Рекомбинантный бактериальный фермент В. halodurans был любезно предоставлен проф. Дитмаром Халтрихом (Австрия) в рамках выполнения совместных исследований. Использовалась следующая последовательность очистки ферментов Т. hirsuta и С. maxima: осаждение белков из культуральной жидкости сульфатом аммония в диапазоне насыщения 0 - 90 %; отделение осадка белков от фильтрата и его перерастворение в деионизированной воде; ионообменная хроматография низкого давления на носителе Сервацел ДЭАЭ 52 («Reanal», Венгрия); рехроматография на носителе DEAEoyopearl 650М («Toyo Soda», Япония). Обе стадии очистки выполняли на колонках, предварительно переуравновешенных 10 мМ фосфатным буфером рН 6.5, а элюирование белков производили 0.2 М фосфатным буфером рН 6.5. Растворы белков, наносимые на колонки, были предварительно отдиализованы против 10 мМ фосфатного буфера рН 6.5. Заключительным этапом очистки всех ферментов являлась стадия жидкостной хроматографии высокого давления на колонке BioSep-SEC-S 2000 Phenomenex (США) с использованием HPLC - системы «Стайер» («Аквилон», Россия). 1 мл очищаемого образца наносили на колонку в 50 мМ фосфатном буфере рН 6.5 при скорости элюции 5 мл в минуту. Все стадии очистки ферментных препаратов проводили при температуре 4С.
Частично очищенный ферментный препарат растительной лакказы R. vernicifera был дополнительно очищен гель-проникающей хроматографией высокого давления на колонке BioSep-SEC-S 2000 Phenomenex (США) с использованием HPLC - системы «Стайер» («Аквилон», Россия).
Ферментные препараты Т. hirsuta , С. maxima и R. vernicifera были гомогенны по данным ДДС-электрофореза. Бактериальный фермент В. halodurans был частично очищен австрийскими коллегами. Изучение фермента проводилось без его дополнительной очистки. Лакказа М. termophila была получена из коммерческого препарата Deni-Lite путем дополнительной очистки по описанной ранее методике [SolHS-Oba et al., 2005]. Навеску 1 г коммерческого препарата лакказы М. termophila растворилиїв 10 мл воды путем перемешивания в течение 1 часа. Затем раствор отцентрифугировали от нерастворимых частиц и отфильтровали с использованием фильтра Millipore с размером пор 45 микрон. После этого фермент осадили из раствора 100 мл холодого ацетоном, удерживая смесь белка и ацетона на водно-NaCl бане в течение 1 часа. Полученный осадок белков три раза промыли холодным ацетоном, а затем высушили на воздухе в течение суток.
Гомогенные препараты лакказ, кроме бактериального фермента и лакказы М. termophila, хранили в виде высококонцентрированных растворов в 0.1 М фосфатном буфере (рН 6.5) при температуре -18С. Борная кислота, АБТС, виннокислый натрий, вератровый спирт (3,4 диметоксибензиловый спирт), вератровая кислота, вератровый альдегид, ацетонитрил, 3,4-диметоксифенол, КС1, K4Mo(CN)8 («Sigma»,CIIIA); гидрохинон («Roth», Германия); K4Fe(CN)6»3H20 («Alfa Aesar», Германия); NaOH, KH2PO4, Na2HP04, лимонная кислота, КОН («Fluka», Германия); Н3Р04, СН3СООН, NaF, MnS04, щавелевая кислота, пирокатехин, гидрохинон (отечественные препарата марки о.с.ч.); серингалдазин («ICN», Германия); гваякол («Acros Organics», США). K4W(CN)8, K40s(CN)6 были любезно предоставлены проф. Кением Кано (Япония). Все используемые растворы, за исключением растворов для ферментации, готовили с использованием деионизированной воды, полученной на установке «МІШ Q» («Millipore», США).
Определение концентрации белка Концентрацию белка определяли спектрофотометрически по разности оптческой плотности при длинах волн 228.5 и 234.5 нм с использованием соответствующей калибровочной кривой [Ehresmann et al., 1973]. 2.4.2. Контроль каталитической активности Контроль активности лакказ Т. hirsuta, С. maxima и R. vernicifera в процессе их очистки и при дальнейших исследованиях осуществляли спектрофотометрически с использованием спектрофотометра «Hitachi-557» (Япония) в 0.1 М цитратно-фосфатном буфере рН 4.5 при температуре 20 С. Активность бактериальной оксидазы измеряли в 12.5 мМ трис-HCl буфере рН 7.0 в присутствие 1 мМ C11SO4 и 100 мМ NaCl при температуре 45 С. В качестве субстрата для всех исследуемых лакказ использовали 1 мМ раствор АБТС (420 =36000 М см"1). За единицу активности принимали то количество фермента, которое необходимо для окисления 1 мкмоля субстрата за 1 мин. Удельную активность выражали в единицах активности на мг белка. 2.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ Молекулярную массу лакказ определяли методом ДДС-электрофореза в градиенте ПААГ в денатурирующих условиях [Остерман, 2002]. В качестве белков-метчиков использовали маркеры фирмы ООО «Хеликон» (кДа): целлюлазу (94.6), БСА (66.2), овальбумин (45.0), карбоангидразу (31.0), ингибитор трипсина (21.5), лизозим (14.4).
Получение гомогенных препаратов лакказ
Для получения ферментных препаратов лакказ использовали культуральные фильтраты базидиомицетов Т. hirsuta и С. maxima, выращенных в условиях глубинного культивирования, частично очищенные препараты лакказы R. vernicifera и лакказо-подобной медьсодержащей оксидазы В. halodurans, а для проведения сравнительных исследований использовали коммерческий препарат фермента М. thermophila фирмы «Novozymes». Полученные препараты грибных и древесного ферментов были гомогенными по данным ДДС-электрофореза (Рис. 7). Бактериальный фермент В. halodurans был частично очищен австрийскими коллегами. Изучение фермента проводилось без его дополнительной очистки. Коммерческий препарат фермента М. thermophila фирмы «Novozymes» был очищен в несколько стадий ацетоном, как описано в работе [SolHS-Oba et al., 2005].
Удельная активность полученных препаратов лакказ составляла 118 и 98 U/мг для лакказ Т. hirsuta и С. maxima, 0.93 и 0.025 U/мг для лакказы R. vernicifera и бактериальной оксидазы В. halodurans в реакции окисления АБТС, соответственно. Коммерческий ферментный препарат фирмы «Novozymes» после очистки ацетоном имел удельную активность 0.221-10" U/мг, измеренную с использованием в качестве субстрата пирокатехина. Одним из основных параметров, от которого зависит скорость окисления субстратов лакказами, является различие значений редокс-потенциалов между субстратом-донором и первичным акцептором электронов — ТІ центром фермента. Непосредственно лакказы катализируют окисление соединений, потенциалы ионизации которых не превышают или превышают незначительно значения редокс-потенциала иона меди ТІ центра. При этом электрон от субстрата-донора переносится через ТІ центр на трехъядерный медный кластер лакказы, на котором непосредственно и происходит восстановление молекулярного кислорода до воды. В некоторых случаях лакказы могут окислять различные соединения с редокс-потенциалами, превышающими значение потенциала ТІ центра фермента [Хи, 1996а; Xuetal., 2000]. Соединения, потенциал ионизации которых превышает значение редокс-потенциала ТІ центра фермента, могут окисляться в присутствии лакказ в случае использования редокс медиаторов. В частности, такие соединения, как феноксазин, N—ОН соединения, комплексы переходных металлов являются эффективными редокс-медиаторами лакказ [Bohmer et al., 1998; Kawai et al., 1989; Sariaslani et al., 1984]. Как было отмечено ранее, разность в редокс-потенциалах окисляемого субстрата и ионов меди ТІ является движущей силой реакций. Однако, помимо термодинамического, надо принимать во внимание и влияние кинетического фактора, когда соединения с потенциалами, близкими к редокс-потенциалам лакказ, не являются их субстратами [Kersten et al., 1990].
Следует отметить, что в работе [Xu et al., 2000] проводилось изучение зависимости эффективости ферментативного катализа для грибных лакказ в реакциях окисления фенольных соединений, включая замещенные фенотиозины и N-OH соединения. Многие из таких соединений плохо раствормы в водных растворах. Поэтому авторы в вышеуказанных исследованиях использовали водно-органические системы: вода-этанол и вода-диметилформамид. Однако, при проведении реакций в этих средах, изменяются каталитические параметры использованных в работах ферментов, коэффициенты экстинции субстратов и ферментов, растворимость молекулярного кислорода, а также проницаемость мембраны кислородного электрода типа Кларка.
В настоящей работе были проведены исследования по влиянию значений редокс-потенциалов субстратов-доноров электронов на эффективность катализа в присутствии высоко редокс-потенциальной лакказы из базидиомицета Т. hirsuta и низкопотенциального фермента из сока лакового дерева R. vernicifera. Редокс потенциалы ТІ-центров высокопотенциальной лакказы Т. hirsuta [Shleev et al., 2005a] и низкопотенциальной лакказы R. vernicifera [Reinhammar, 1972] составляют 780 мВ и 420 мВ (отн. НВЭ), соответственно. В качестве субстратов-доноров были использованы водорастворимые цианидные комплексы переходных металлов IQFe(CN)6, K4W(CN)8, bv40s(CN)6, K4Mo(CN)8, редокс-потенциалы которых варьируют от 435 до 780 мВ (отн. НВЭ) (Табл. 7). Эти соединения являются донорами электронов, обладают обратимостью редокс-превращений и имеют сходную структуру.
