Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Материалы и методы 43
I.Объекты исследования 43
2. Облучение животных и культуры клеток
Б.Дифференцировка и созревание клеток тимуса .... 15
В.Препаративные методы разделения клеток тимуса и биологические характеристики фракций 19
Г.Влияние радиации и глюкокортикоидных гормонов на лимфоциты тимуса 25
2.Краткие сведения о структурно-функциональной организации генома высших организмов 30
Глава II. Материалы и методы 43
I.Объекты исследования 43
2. Облучение животных и культуры клеток 43
З.Выделение и фракционирование тимоцитов 43
4.Определение количества тимоцитов находящихся в стадии метафазы 44
5.Оценка адгезивной способности тимоцитов 44
6.Анализ сулерспиральной структуры ядерной ДНК тимоцитов методом вискозиметрии 45
7.Включение %-тимидина и *%-уридина в фракциони рованные тимоциты 45
8.Выделение ядер 46
Э.Выделение РНК 47
а.Получение суммарной РНК 47
б.Экстракция РНК из ядер 47
в.Выделение цитоплазматической РНК 48
10.Очистка препаратов РНК от примесей ДНК 48
а.Обработка РНК ДНКазой I 48
б.Выоаливание высокомолекулярной РНК 49
II.Выделение поли(А)-содержащей РНК 49
а.Синтез поли(У)-сефарозы 49
б.Хроматография РНК на поли(У)-сефарозе 49
12.Определение концентрации РНК 50
ІЗ.Аналитическое фракционирование РНК 50
а.Электрофорез высокомолекулярных РНК 50
б. Регистрация результатов электрофореза РНК 51
в.Определение молекулярной массы РНК 51
14.Выделение ДНК 52
15.Фрагментация ДНК 53
16.Синтез гранулированного оксиаппатита 53
17.Выделение уникальной ДНК 54
18.Иодирование ДНК 55
19. Реассоциация уникальной ДНК 56
20.Гибридизация 1251-унДНК с избытком РНК 56
21.Получение 1251-мДНК и 1251-нДНК 57
22.Изучение кинетики реассоциации и гибридизации методом хроматографии на колонке с ГАВГ 57
23.Определение концентрации белка 58
24.Определение концентрации ДНК 58
25.Статистические методы 58
26.Реактивы, используемые в работе 58
Глава III. Результаты 59
I. Фракционирование тимоцитов в градиенте фиколл-пакаи их характеристика 59
а.Связь плавучей плотности клеток с их биологическими параметрами
б. Исследование влияния гидрокортизона и радиации на фракции тимоцитов 70
2.Влияние рентгеновского облучения на биосинтез и созревание РНК в субпопуляциях тимоцитов 80
3.Изучение генетической сложности ядерной и полиаденилированной цитоплазматической РНК фракций тимоцитов 91
Глава 17. Обсуждение результатов 105
В ы в о д ы 120
Форма внедрения 122
Литература 123
- Облучение животных и культуры клеток
- Облучение животных и культуры клеток
- Фракционирование тимоцитов в градиенте фиколл-пакаи их характеристика
Введение к работе
Актуальность исследования. Тимус является одним из центральных лимфоидных органов, которому принадлежит ведущая роль в формировании иммунной системы организма (Брондз Б.Д., Рохлин О.В., 1978). Процесс созревания периферических Т-лш$оцитов, ответственных за клеточный иммунитет включает ряд стадий протекающих в пределах тимуса ( Burton et ai»t 1976). Именно этим определяется значительная гетерогенность лимфоидных клеток тимуса. Претимоци-ты, делящиеся и зрелые кортикальные клетки, медуллярные тимоциты представляют собой последовательные этапы формирования Т-лимфоци^ тов (Брондз Б.Д., Рохлин О.В.,1978). Однако не все кортикальные тимоциты проходят подобный путь развития, значительная их часть не участвует в иммуногенезе и погибает в органе, претерпевая летальную дифференцировку.( Burton et ai„, 1976). Физиологическая роль летальной диффвренцировки остается неизвестной. Морфологически она проявляется в постоянном присутствии в тимусе клеток с пикнотизированными ядрами ( schreck, 1955). Значительное возрастание числа клеток с пикнотизированными ядрами обнаруживается при воздействии лимфолитических агентов, таких как глюкокортико-идные гормоны и ионизирующее излучение (Schreck, 1955, Ханоон К.П.,1979). В основе механизма действия этих агентов,по-видимому, лежит их способность ускорять естественный процесс терминальной диффвренцировки и клеточной гибели (Хансон К.П.,1979).
Лимфоциты тимуса являются одной из наиболее радиочувствительных клеточных популяций организма, гибель которых происходит по так называемому интерфазному типу (Окада Ш.,1974). Известно, что интерфазная гибель клеток лежит в основе таких специфических - 7 -проявлений лучевого поражения, как лимфопения и инволюция лимфо-идных органов (Хансон К.П., Комар В.Е.,1977). Поэтому выяснение механизмов интерфазной гибели имеет важное значение для понимания закономерностей радиационного поражения организма.
Следует, однако, отметить, что имеющиеся в настоящее время радиобиологические данные о молекулярных событиях, развертывающихся в интерфазно гибнущих клетках,.получены в основном на суммарной популяции лимфоцитов и тимоцитов,что затрудняет их конкретную интерпретацию (Евтушенко В.И.,1980; Водолазская Н.А. и др.,1981). Очевидно, что дальнейшее изучение молекулярных основ дифференци-ровки тимоцитов, а также понимание природы клеточной гибели под действием радиации и других лимфолитических агентов становится проблематичным без разработки методов препаративного разделения клеток тимуса,находящихся на разных стадиях созревания. Наряду с простыми удобными методами разделения клеток,не менее важно располагать комплексом методов, которые позволяли бы надежно характеризовать уровень дифференцировки и степень зрелости клеток в составе фракций, полученных в результате препаративных процедур. Несомненно, что наиболее полное представление о дифференцировке может быть получено на основании данных об экспрессии генома на разных СТадИЯХ СОЗреваНИЯ КЛеТОК ( Britten, Davidson, 1969; Galau et al,, 1976).
Таким образом, выделение из тимуса субфракций тимоцитов,находящихся на различных стадиях дифференцировки, изучение их радиочувствительности и исследование особенностей экспрессии генетической информации в каждой из них является важной и актуальной задачей, как биохимии, так и радиобиологии. . Основной целью настоящего исследования являлось изучение особенностей экспрессии генетической информации на разных стали- - 8 -ях дифференцировки клеток тимуса и выяснение взаимосвязи между уровнем дифференцировки и радиочувствительностью тимоцитов.
Для достижения указанной цели решались следующие конкретные экспериментальные задачи:
I.Разработать простой метод изоплотностного центрифугирования в градиенте фиколл - пака позволяющий разделить клетки тимуса на фракции, различающиеся до степени зрелости.
2,На основании цитологических, биохимических и радиобиологических критериев оценить уровень дифференцировки клеток находящихся во фракциях,
3.Изучить генетическую сложность информационных РНК, представленных в ядре и цитоплазме выделенных субподуляций тимоцитов.
Научная новизна и теоретическое значение работы. Впервые с помощью упрощенного метода изоплотностного центрифугирования в градиенте фиколл - пака получены три фракции тимоцитов, находящихся на различных стадиях дифференцировки. При изучении генетической сложности суммарных препаратов ядерной и цитодлазмати-ческой доли(А+)-РНК, выделенных из фракционированных тимоцитов, впервые доказано, что уровень эксдресоии генетической информации в клетках нижней радиочувствительной фракции выше. Установлено также, что такое характерное для лимфоцитов пострадиационное нарушение процессинга рРНК, как усиление "утечки" 18 s рРНК наиболее выражено в нижней фракции, что коррелирует с её повышенной радиочувствительностью.
Полученные результаты вносят существенный вклад в понимание особенностей экспрессии генетической информации в тимоцитах, находящихся на разных стадиях дифференцировки. Они способствуют также пониманию взаимосвязи процессов дифференцировки клеток с их радиочувствительностью.
Практическое значение. Разработан упрощенный, эффективный метод изоплотностного центрифугирования тимоцитов в градиенте фиколл-пака, позволяющий разделить лимфоидную популяцию клеток тимуса на фракции, различающиеся по степени зрелости. Результаты молекулярно-биологических, цитологических и радиобиологических исследований этих фракций могут иметь практическое значение для обоснования путей поиска средств защиты критических органов, богатых лимфоидными клетками.
На защиту выносятся следующие положения: при изоплотностном центрифугировании тимоцитов в градиенте фиколл-пака получены три фракции клеток, различающиеся между собой по уровню дифференцировки и по радиочувствительности; тимоциты нижней фракции являются наиболее радиочувствительными; такое пострадиационное нарушение процессинга рРНК, как усиление "утечки" I8spPHK наиболее выражено в нижней фракции, что коррелирует с её радиочувствительностью; генетическая сложность препаратов ядерной и цитоплазмати-ческой поли(А+)-РНК нижней радиочувствительной фракции на Ь% выше, чем у РНК верхней и средней фракции.
Г Я А В A I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
I.Характеристика клеточного состава тимуса млекопитающих
А. Структура и функции тимуса
Как известно, важнейщую роль в выполнении иммунной функции организма млекопитающих играет лимфоидная система, состоящая из лимфоидных клеток различных типов, распределенных между периферическими и центральными лимфоидными органами (Николаева Н.В. и др.,1981).
К периферическим лимфоидным образованиям обычно относят лимфатические узлы, селезенку (белая пульпа) и лимфоидную систему кишечника.
К числу центральных лимфоидных органов в первую очередь относится костный мозг - источник полипотентных стволовых клеток для всех ростков кроветворения, включая и лимфопоэз. У млекопитающих костный мозг также является местом образования В-лимфо-цитов (В-клеток).
Другим центральным лимфоидным органом является тимус. У большинства млекопитающих он расположен в грудной полости, за грудиной, и состоит из широкого коркового слоя и мозгового вещества, занимающего центральную часть органа. Ткань тимуса образована, в основном, клетками двух типов, лимфоидными и ретикулярными.
К лимфоидным клеткам относятся клетки с плотным круглым ядром и узкой каймой цитоплазмы (Миллер Д., Дукор П.,1967). Большая часть этих клеток (около 85$) сосредоточена в корковом веществе и включает в себя несколько различных субпопуляций лимфо- - II - цитов (рис.1,2). Так, около трех процентов кортикальных тимоци-тов обладает повышенными размерами и высокой пролиферативной активностью. Эти клетки расположены в субкапсулярной зоне кортикального слоя и рассматриваются как предшественники тимоцитов (Брондз Б.Д.,Рохлин О.В.,1978).Большая часть кортикальных клеток (более 8$) имеет небольшие размеры и расположена по всему периметру коркового слоя. Они,в свою очередь, подразделяются на ряд субпопуляций, соответствующих определенным стадиям зрелости тимоцитов (рис,1,2).
Лимфоциты медуллярной зоны тимуса (около 15% всех тимоцитов) состоят в основном из клеток средних и больших размеров. По мнению ряда авторов ( Burton et ai., 1976; Брондз Б.Д., Рохлин О.В. ,1978), эти клетки являются конечными формами дифференцирующихся тимоцитов. Здесь же, в медуллярной зоне, особенно отчетливо видны ретикулярные элементы тимуса. Обычно это крупные клетки со слабоокрашивающейся цитоплазмой и овальным рыхлым ядром (Миллер Д., Дукор П.,1967). Большинство ретикулярных элементов, имеющих эпителиальное происхождение, образуют рыхлую сеть (строму) тимуса, в петлях которой находятся лимфоциты. Другие ретикулярные клетки оказываются типичными макрофагами мезенхи-мального происхождения (Миллер Д., Дукор П., 1967; Николаева Н.В. и др. ,1981). Для мозгового вещества взрослых животных характерны так называемые тельца Гассаля - концентрические скопления уплощенных и веретеновидних эпителиальных клеток.
У ряда млекопитающих (мыши, крысы) в корковом веществе тимуса в течение первых недель жизни обнаруживают четко очерченную субкапсулярную краевую зону, содержащую крупные незрелые лимфобластоподобные клетки с высокой митотической активностью. В более позднем возрасте эта зона уже.
Рис.1.Схема расположения различных групп фракционированных тимоцитов в тимусе ( Droege et ai«, 1975), - ІЗ -не обнаруживается (Миллер Д., Дукор П.,1967; Брондз Б.Д., Рохлин 0.В.,1978). Другой характерной чертой коркового вещества является наличие ШИК - положительньк клеток, появляющихся у животных с возраотом.Эти,по-видимому,ретикулярные элементы с объемистой, заполненной гранулами цитоплазмой, расположены преимущественно субкапсулярно: диаметр этих клеток 7-26 мкм.
Отмеченные выше различия между корковым и мозговым веществом тимуса можно суммировать следующим образом:
I.Наибольшее количество лимфоидных элементов (8Ь%) сосредоточено в корковом веществе. Мозговой слой содержит их значительно меньше. Различаются эти зоны и по степени зрелости представленных в них тимоцитов (рис.1).
2.Делящиеся клетки сосредоточены главным образом в кортикальном слое, и лишь незначительное число митозов приходится на мозговое вещество.
З.ШИК - положительные гигантские клетки встречаются лишь в корковом слое, а тельца Гассаля - только в мозговом веществе.
Тимус, как орган лимфоидной системы, отличается от других лимфатических структур наличием следующих, только ему свойственных особенностей: а)Такие ретикуло-эпителиальные образования, как тельца Гассаля и ШИК - клетки, обнаруживаются только в тимусе, их нет ни в лимфатических узлах, ни в лимфатических структурах кишечника, ни в белой пульпе селезенки (Миллер Д.,Дукор П.,1967). б)Митозы встречаются в тимусе примерно в 7 раз чаще, чем в прочих лимфатических органах (Николаева Н.В. и др.,1981).
Для тимуса характерна также значительно более высокая по сравнению с другими лимфоидными органами чувствительность к действию радиации и стероидных гормонов (Миллер Д., Дукор П., - 14 -1967; Окада 111., 1974).
Функционально тимус является органом, в котором происходит созревание Т-лимфоцитов (Т-клеток) - одной из основных клеточных форм иммунной системы. Для этих клеток характерна способность дискриминировать свои и чужие антигены, что приводит к возникновению набора лимфоцитов, способствующих образованию антител и регулирующих иммунный ответ. Вместе с тем Т-клетки не образуют антитела и не выполняют функцию предшественника анти-телообразующих клеток (ПАОК), которую осуществляют В-клетки (малые лимфоциты костно-мозгового происхождения) (Брондз Б.Д., Рохлин О.В.,1978).
Наряду с формированием Т-клеток ткань тимуса вырабатывает и гормональные факторы (в основном полипептиды). К тимусным гормонам, вырабатываемым клетками стромы, относятся: тимозин, гуморальный фактор тимуса (ГФТ), тимин, циркулирующий фактор тимуса (ЦФТ) и другие (Медуницын Н.В. и др.,1980; Брондз Б.Д., Рохлин О.В.,1978). Действие этих веществ направлено в основном на процесс созревания и дифференцировки тимоцитов и Т-клеток. Так, например, при воздействии тимозина часть лимфоцитов костного мозга дифференцируется в тимоциты и в Т-клетки. Тимин обладает способностью индуцировать на поверхности костно-мозговых клеток антигенные маркеры, свойственные только тимоцитам. ГФТ ускоряет дифференцировку тимоцитов в сторону зрелых форм Т-клеток (хел-перов) (Медуницын Н.В. и др.,1980).
Таким образом, тимус - центральный орган лимфоидной системы, в котором под воздействием тимусных гормонов происходит процесс превращения тимоцитов в Т-лимфоциты. - 15 -Б.Дифференцировка и созревание клеток тимуса
Известно, что иммунокомпетентные Т-лимфоциты формируются в результате многоэтапной дифференцировки клеток тимуса (Брондз БД., Рохлин О.В.,1978). Каждый этап созревания тимоцитов протекает в определенной последовательности и связан с приобретением и утратой клеткой предшественником определенных поверхностных маркеров. Было установлено, что и В, и Т-клетки являются потомками одной стволовой кроветворной клетки костного мозга (СКК), т.е. имеют единого предшественника, общего о предшественниками всех кроветворных клеток (Чертков И.Л.,Фриденштейн А.Я.,1977). Первой лимфобластной клеткой, общей для Т и В-лимфоцитов, является потомок СКК, так называемая полустволовая лимфоидная клетка (ПСЛК), обнаруженная в костном мозге мышей ( Goldschneider, 1976,1977).
Клетки следующего этапа дифференцировки Т-лимфоцитов, предшественники тимоцитов (ПТ), локализованы в основном в костном мозге и селезенке (Брондз БД., Рохлин О.В.,1978). На миграцию этих клеток в ткань тимуса указывают обнаруженные в тимусе мышей особые категории транзитных резервных ПТ, характеризующихся высокой радиорезистентностью и обеспечивающих восстановление структуры ТИМуса В Течение ПврВЫХ ДНЄЙ ПОСЛе ОбЯучеНИЯ (Kadish,Bash, 1975).
Перемещения ПТ из костного мозга в тимус, очевидно, происходят в течение всей жизни (Weismocu, 1973). ПТ обычно расположены под соединительнотканной капсулой и составляют не более Ъ% всех клеток тимуса ( El-Arini,Osoba, 1979).
Характерными признаками ПТ являются: высокая плавучая плотность (1,069), большие размеры (10-15 мкм), повышенный уровень
Т КЛЕТКИ
Т КЛЕТКИ /V
Рис.2.Гипотетическая схема дифференцировки лимфоцитов в тимусе ( Burton et ai., 1976). Белый и заштрихованный четырехугольники - соответственно кортикальные и модулярные зоны тимуса, ПТ - предшественники Т-клеток, кТ - кортикальные, МТ - медуллярные тимоциты: сі - серия I (3- клеток), расположенных под капсулой больших тимоцитов, имеющих низкую плотность и высокое включение Н-тимидина, содержащих тДт, с2 -серия 2 (65$ клеток промежуточной плотностью и промежуточным включением ^-тимидина, содержат тДт), сЗ - серия 3 (терминальные клетки, погибающие в тимусе с высокой плотностью и низким включением *%-тимидина), о4 - серия 4 (низкая плотность и высокое включение *%-тимидина в клетки) - 17 - биосинтеза ДНК, значительная устойчивость к гидрокортизону и радиации, отсутствие реакции на ФГА, иммунологическая инертность и высокая активность терминальной дезоксинуклеотидил трансферази(тДт) ( Levey,Burleson, 1972; El~Arini,Osoba, 1975; Burton et al., 1976).
В отличив от зрелых Т и В-лимфоцитов ПТ не несут в-антиге- на (гликопротеида с молекулярным веоом 25000), но содержат два антигена мозга, один из которых характерен только для отволовыхклеток (Levey,Burieson, 1972; Bash, Kadish, 1977).
Процесс созревания ПТ в иммунокомпетентные Т-лимфоциты, по наиболее принятому представлению, происходит в два этапа (рис.2). Первоначально ПТ превращаются в иммунокомпетентные тимоциты, составляющие основную массу клеток тимуса, а именно, его корковое вещество. Это маленькие клетки (90 мкм3) с высокой плавучей плотностью. Они быстро разрушаются при воздействии кортизона и радиации ( Droege et al., 1975), не реагируют на ФГА и слабо стимулируются КОНканавалином A ( Sabolovic et al., 1973; Burton et al., 1976). В свою очередь, кортикальные тимоциты неоднородны по своему составу и могут быть разделены в градиенте фиколл-изопака по меньшей мере на четыре фракции ( Burton et ai., 1976). Как видно из рис.2, наибольшая фракция кортикальных тимоцитов (6ЗД кТс 2 содержит антигены лимфоцитов костного мозга (rbula ), фермент терминальную дезоксинулеотидил трансферазу (тДт) и характеризуется промежуточной плотностью. Другой отличительной чертой этого класса тимоцитов является их низкая электро-форетическая подвижность, обусловленная малым поверхностным зарядом клеточных мембран ( Despont et al., 1975).
Маркерами данного этапа дифференцировки является наличие на поверхности клеток большого количества е - антигена, тимус- - 18 -лейкемического антигена (tl), антигенов различных субкласоов Т-клеток ( Ly), а также углевода Yr - ответственного за чувствительность тимоцитов к цитотоксическому действию нормальных антител морской свинки в присутствии комплемента (Брондз Б.Д#, Рохлин О.В.,1978). Содержание антигена тканевой совместимости (Н-2) на поверхности кортикальных тимоцитов невелико ( Schie-einger, 1972). В то же время они несут вое три ьу антигена ( іу - 1,2,3). Итак, антигенный фенотип этих клеток выглядит следующим Образом: 9++%TL++,Itf-1,2,3+++.Yr++,H-2+.
На втором этапе дифференцировки кортикальные тимоциты превращаются в зрелые медуллярные формы (рис.2, кТс 4 и МТ). Эти клетки, составляющие не более 5-1( всех тимоцитов, обуславливают всю иммункомпетентность тимуса. Они расположены в медулляр-ной зоне и обычно имеют большой объем (125 мкм ), низкую плавучую плотность и высокую электрофоретическую подвижность. Для них также свойственна устойчивость к гидрокортизону и высокая чувствительность к конканавалину А и ФГА ( Schiesinger, 1972; Despont et al., 1975).
Характерными поверхностными маркерами этого этапа развития являются низкое содержание и ьу - антигенов, исчезновение tl- антигена и увеличение содержания Н-2, т.е. антигенный фено тип медуллярных тимоцитов может быть представлен следующим обра зом: e,TlT,Ly -1,2,3+,Yr+.H-2++ (БроНДЗ Б.Д., /Рохлин О.В., 1978; Scoiacy et al., 1980). Особый интерес представляет обнаруженный в медуллярных тимоцитах крыс специфический антигенный маркер ( rMTA), свойственный периферическим Т-лиМфоцитам ( Goldshneider, 1976; Burton et al., 1980). Что касается дальнейшей судьбы медуллярных тимоцитов, то предполагается, что они являются предшественниками циркулирующих - 19-Т2-клеток (рис.2). В пользу этого предположения свидетельствуют данные о способности медуллярных тимоцитов мигрировать преимущественно в лимфоузлы подобно Т2~клеткам ( Scalesinger, 1973). Наряду с этим, не исключена альтернативная возможность, т.е. формирование Т2-клбток из ПТ не последовательно, а двумя независимыми путями (рис.2). Это предположение подтверждается данными о независимой кинетике включения %-тимидина в популяции тимоцитов, разделенных по содержанию е- антигена ( shortman et ai., 1975; Droege et ai., 1975). Существует также предположение, что часть кортикальных тимоцитов крыо является источником периферических короткоживущих, нециркулирующих, кортизоночувствительннх лимфоцитов (T-j-), локализованных преимущественно в селезенке (рис.2) (Брондз БД., Рохлин О.В.,1978).
В. Препаративные методы разделения клеток тимуса и биологические характеристики фракций
Как известно, клетки различаются между собой по таким интегральным показателям, как размеры, плотность, электрический заряд мембран, свободная энергия поверхности и т.д., причем различие в величине этих физических характеристик очень часто коррелирует с различиями в структуре и функции клеток. Это обстоятельство делает весьма перспективным применение методов разделения клеточных суспензий на основе различия их физических показателей.
К методам, основанным на данном принципе, относятся:изо-плотностное осаждение (разделение по плавучей плотности), изо-скоростное осаждение (разделение по клеточным размерам), электрофорез (разделение по величине 1Ґ -потенциала, обусловленного поверхностным зарядом клеточных мембран, а также различные адгезивные методы (Сунгуров А.Ю., 1983). - 20 -Наиболее широко для фракционирования клеток лимфоидного ряда ИСПОЛЬЗУЮТ МеТОД ИЗОПЛОТНОСТНОГО ОСаждеНИЯ ( Shortman,
1968). Суть метода состоит в том, что клетка, будучи помещенной в градиент плотности и, находясь под действием центробежной силы, движется сквозь градиент, пока не достигнет слоя плотности, равного ей или, соответственно, большего. В этом положении равнодействующая сил, действующих на клетку, равна нулю и клетка будет постоянно находиться в данном слое градиента.
Часто используют следующие схемы деления клеток по плотности:
А, Осаждение двух типов клеток, имеющих плотность < J. на слое вещества с плотностью У3 , причем $< J < 2 В результате после центрифугирования клетки с плотностью ^ оказываются в осадке, а клетки о плотностью ij сверху в ин-терфазе. Примером такого разделения может служить широко применяемый метод выделения мононуклеарных клеток крови на ступеньке фиколл-пака ( BByum, 1974; ХейриП., Андерсон Л.С, 1980).
Б. Для получения нескольких субпопуляций клеток, как правило, применяют градиент плотности, состоящий из нескольких ступенек, соответствующих плотностям клеток различных фракций. В этом случае клетки определенной плотности задерживаются на границе ступеньки, соответствующей плотности, образуя видимый глазом слой. Примером применения такого метода может быть разделение тимоцитов на субпопуляции в ступенчатом градиенте фиколл - веро-графина и альбумина ( Sabolovic et ai., 1973; Burton et al.f 1976).
Применение градиента плотности бычьего сывороточного альбумина (БСА) для получения субпопуляций лимфоидных клеток различного происхождения было впервые предложено Шортманом (Shortman, кол кл.
IS 10. 5.
А БСА-2$ A In.
8 6СА - 23%
С БСА-26Х
А БСА - 29Х
0.5 1,0
ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКАЯ подвижность
1,5 ,/"п S V cm/
Рис.3.Электрофоретичеекая подвижность фракционированных тимоцитов мышей, разделенных в ступенчатом градиенте бычьего сывороточного альбумина БСА 20-29^ ( Sabolovic et ai., 1973). В правом углу рисунка процентный выход клеток с градиента - 22 -1968). В этих работах подробно изучено влияние на результаты фракционирования таких параметров, как осмотическое давление (Williams et al., 1972), рН среды ( Williams et al., 1972), a также количественное распределение тимоцитов по градиенту.
Оказалось, что большая часть выделенных с градиента лимфоцитов тимуса (80-9ТО представляет собой плотные ( 3 - 1,070-1,080) небольших размеров (5-8 мкм) клетки. Остальная доля клеток делится на большие (8-Ю мкм) и легкие ( S -1,060-1,080) тимоциты ( Shortman, 1968; Sabolovic et al., 1973; Сорокина Н.И. И др., 1981). В последующих исследованиях фракционированных тимоцитов о помощью метода электрофореза было выявлено различие фракций по величине поверхностного заряда. Наибольшей электрофоретической подвижностью (1,09/113-1^1 см ) обладали легкие, крупные клетки, в то время, как мелкие и плотные тимоциты имели в среднем незначительную подвижность ( 0t82/MAS~^ v~1cm ). При этом, чем выше плотность клеток, тем меньше их электрофоретичеекая подвижность (рис.3) ( Droege et al,, 1975; Shortman et al., 1975; Sabolovic et al., 1973).
Характерной чертой лимфоцитов тимуса является наличие в их составе пула клеток (10-15^), обладающих пролиферативной активностью и характеризующихся высоким уровнем синтеза ДНК (Миллер Д., Дукор П.,1967; Shortman et al,, 1975). При разделении суспензии тимоцитов в градиенте плотности, пролиферирующие клетки обычно концентрируются в верхних слоях градиента. Они характеризуются большими размерами и повышенным уровнем включения меченных предшественников синтеза нуклеиновых кислот ( Reves et al,, 1977; Betel et al.,I979).
Изоплотностное разделение тимоцитов дает возможность получить популяции клеток, различающихся по чувствительности к кон- -23- канавалину А и ФГА, что, как известно, позволяет.отличать медул лярные тимоциты от кортикальных ( Jacobson et al., 1975; Elliot et ai.f 1977). Так, например, при разделении тимоцитов в линей ном градиенте бычьего сывороточного альбумина индекс стимуляции для клеток низкой и промежуточной плотности составлял 4-9, а для наиболее плотных клеток 1-2 ( Saboiovic et al,, 1973).
Специфическим биохимическим маркером клеток тимуса является наличие в них активной терминальной дезоксинуклеотидил трансферази (тДт) - уникальной ДНК полимеразы, катализирующей процесс концевого присоединения нуклеотидов ( Bollum et al., 1974,1975). В настоящее время терминальная дезоксинуклеотидил трансфераза обнаружена в тимусе различных животных, в костном мозге человека, а также в периферических лимфоцитах больных острой лимфобластичес-кой лейкимией ( Chary, 1971; McCaffery et al., 1973). Важно отметить, что фермент отсутствует в зрелых ти в - лимфоцитах ( Bollum et ai.,1975). Было выдвинуто предположение, что тДт участвует в процессе созревания тимоцитов ( Chary, 1971). Колеман с сотрудниками ( Coleman et al., 1974) при разделении тимоцитов в ступенчатом градиенте бычьего сывороточного альбумина установил, что тДт-активные клетки как у крыс, так и у мышей, обнаруживаются лишь во фракции с промежуточной плотностью. Изучение тДт-активности и некоторых других свойств тимоцитов, фракционированных с помощью ступенчатого градиента фиколл-изопака, позволили Бартону с сотрудниками ( Burton et al,, 1976) соотнести полученные фракции (табл.1) с определенными этапами диф-ференцировки лимфоцитов тимуса (рис.1).
Как упоминалось ранее, каждому этапу развития тимоцитов соответствует определенный набор поверхностных антигенных маркеров (Брондз Б.Д., Рохлин О.В.,1978), в связи с этим при изуче-
Таблица I
Некоторые биологические параметры тимоцитов фракционированных на градиенте фиколл-изопака ( Burton et al., 1976) нии фракций тимоцитов, различающихся по плотности, ряд исследователей наряду с такими параметрами, как включение метки, активность тДт определяли также антигенный фенотип клеток ( shortman et al., 1975; Burton et al., 1976). Было установлено, что большая часть лимфоцитов тимуса с низкой и промежуточной плотностью обладает антигенным набором, присущим медуллярным тимоци-там. Этим клеткам свойственна незначительная концентрация - 25 -в -антигена и высокое содержание R МТА. В отличие от этого, более плотные (кортикальные) клетки содержат значительное количество антигена лимфоцитов костного мозга крыс (rbmla ) и е-антигена ( Burton et ai., 1976; Брондз Б.Д., Рохлин О.В., 1978).
Таким образом, исследование клеточного состава тимуса с помощью изоплотностного ооаждения и изучение ряда биологических свойств полученных фракций способствовало пониманию организации тимуоа (рис,1,2), Кроме того, применение этого метода позволяет получать различные субпопуляции тимоцитов в препаративных количествах.
Г.Влияние радиации и глюкокортикоидных гормонов на лимфоциты тимуса
В настоящее время установлено, что лимфоциты представляют собой весьма чувствительные к облучению клетки ( Dunlap et al.f 1972), А так как ткань тимуса богата лимфоцитами, то он является одним из наиболее чувствительных к облучению органов. Известно, что даже небольшая доза облучения (0,1 Гр) вызывает значительную инволюцию тимуса (Романцев Е.Ф.,1972), тогда как рети-куло-эпителиальная часть этого органа устойчива к действию ионизирующей радиации в дозе до 50 Грей ( Kalman et al., 1955; Troweii, 1961). Картина морфологических событий, происходящих в гибнущих тимоцитах была довольно полно описана в работе Щрека ( Schreck, 1955).
Одним из первых пострадиационных изменений является вакуолизация ядра. Затем изменяется форма ядерной и клеточной поверхности. Внутри ядра появляются большие вакуоли, окруженные темным кольцом хроматина, которые впоследствии разрываются с образованием подковообразных или полусферических глыбок. Далее развива- - 26 -вается пикноз и фрагментация ядер. Особо следует отметить различие в выраженности данного процесса в ткани коркового и мозгового вещества тимуса. Так, в тимусе морской свинки уже через 4 часа после общего облучения в дозе 1,7 Гр наблюдается пикноз ядер и фагоцитоз, главным образом, в корковом веществе ( Harris, 1958). В работе Троувела ( Troweii, 1961) было показано, что после облучения пикнотические изменения в корковом веществе более выражены, чем в мозговом. Так ЛД7(3 для малых лимфоцитов коркового вещества, составляла 0,46 Гр, а для лимфоцитов мозгового вещества 1,8 Грея.
Другими тимолитическими агентами являются глюкокортикоидные гормоны (Миллер Д., Дукор П.,1967). Четкая связь между повышением секреторной активности коры надпочечников и острой инволюцией тимуса была впервые установлена Г.Селье ( Seiye, 1936). Морфологически действие гормонов выражается в отпочковании и отбрасывании участков цитоплазмы с последующим разрушением ядра ( Dougherty et ai., 1945).
Методом электронной микроскопии установлено, что в первые часы после воздействия кортизола в тимоцитах наблюдается значительное диспергирование хроматина и разбухание ядра. Далее происходят разрывы ядерной и клеточной мембраны, развиваютоя пикно-зы и фрагментация ядер ( Burton et ai., 1967). Следует отметить, что, как и при радиационном поражении, клетки коркового слоя тимуса более подвержены действию стероидных гормонов, чем тимоциты МОЗГОВОГО вещества ( Dougherty, I960; Lundin,Garplid, 1975).
В экспериментах по изоплотностному осаждению тимоцитов были выделены и охарактеризованы субпопуляции тимоцитов с повышенной чувствительностью к действию тимолитических факторов (радиации и глюкокортикоидов). Так, при изоплотностном разделении тимоцитов, - 27 -подвергнутых обработке гидрокортизоном, количество клеток с высокой плотностью и малой электрофоретической подвижностью (кортикальные тимоциты) уменьшалось на 30-4С$ через 24 часа после введения препарата ( Shortman et al.,I975; Droege et al., 1975). Повышенная радиочувствительность клеток с низкой электрофоретической подвижностью и высокой плотностью показана в работах Дроежера ( Droege et al., 1972), Сорокиной (Сорокина Н.й. И др.,1981), Ямады ( Yamada et al., 1979) и другими исследователями.
В настоящее время установлено, что большая часть кортикаль ных тимоцитов, обладающих пониженной электрофоретической подвиж ностью и высокой плавучей плотностью, быстро обменивается и раз рушается, не покидая пределов тимуса (Hopper,Shortman, 1976; Брондз Б.Д., Рохлин О.В.,1978). Эти формы клеток были названы терминальными тимоцитами (рис.2) ( Burton et al., 1976). По образному выражению Брондза Б.Д. и Рохлина О.В.:"Тимус - это ин тенсивно работающая фабрика обреченных". По мнению Рейсснера( Reissner et ai#, 1976), одним из вероятных пусковых механизмов превращения лимфоцитов тимуса в терминальные формы с последующей их деградацией может быть реакция организма на чужеродные для него остатки Д-галактозы, обнажающиеся на поверхности клетки в результате уменьшения концентрации сиаловых кислот.
Процесс деградации нормальных тимоцитов впервые был исследован в работах Шрека ( Schreck, 1955,1961). Установлено, что естественная гибель тимоцитов происходит по механизму вакуолизации ядра.
Было сделано предположение, что небольшие дозы радиации
УСКОРЯЮТ НОрМаЛЬНЫЙ ТИП ГИбеЛИ ТИМОЦИТОВ ( Schreck, 1961),
Косвенным подтверждением данного предположения являются резуль- - 28-ТатЫ, ПОЛученНЫе В работе ЯмадЫ С Сотрудниками ( Yamada et al,,
1979). При разделении суспензии тимоцитов в градиенте плотности перкошю было показано, что радиационное воздействие приводит к постепенному возрастанию количества плотных клеток, которые при центрифугировании выпадают в осадок. В осадке, считают авторы, концентрируются погибшие клетки. Одновременно следует отметить, что описанный выше характер гибели тимоцитов ( schreck, 1961) имеет место не при всех дозах облучения (Хансон К.П.,1979).
Б принципе, пострадиационную клеточную гибель разделяют на репродуктивную, когда гибнет потомство облученных клеток после прохождения одного или нескольких митозов и интерфазную, когда облученная клетка погибает, не вступая в деление (Окада Ш., 1974; Хансон К.П.,1979). Различают также два типа интерфазной гибели клеток: наступающие при малых дозах облучения и больших, свыше 40 Гр (Хансон К.П.,1979). Первый тип реализуется преимущественно по механизму вакуолизации ядра и характерен для клеток с ограниченной способностью к делению, к которым относится большинство тимоцитов (Окада Ш,,1974).
Характерные морфологические изменения, свойственные данному типу гибели, начинают проявляться после латентного периода 1-2 часа, а максимальное число гибнущих клеток можно наблюдать через 6-8 часов после облучения ( Schreck, 1965; Trowell, 1958; Голубева Р.В. и др.,1979).
Гибель тимоцитов обычно выявляется с доз 0,1-0,2 Гр и нарастает о увеличением дозы до определенного предела, выше которого скорость накопления нарушения не зависит от силы воздействия (Trowell, 1958; Эйдус Л.Х.,1977).
Сходный характер структурно-морфологических изменений в тимусе при естественной гибели клеток и при воздействии различных - 29 -тимолитических агентов ( Schreck,I96I; Burton, 1966), выдвинул на повестку дня вопрос о биологических механизмах интерфазной гибели. В настоящее время в механизме интерфазной гибели тимоцитов главную роль отводят следующим процессам: а)пострадиационному распаду хроматина, б)нарушению биоэнергетики (митохондри-альное и ядерное окислительное фосфорилирование, гликолиз), в)структурно-функциональным повреждениям мембран (Комар В.Е., Хансон К.П.,1972; Хансон К.П.,1979). В то же время остается неизвестной природа сигнала, запускающего последовательность реакций, приводящих к клеточной гибели. Установление факта существенного сходства структурно-метаболических сдвигов, происходящих в тимоцитах в ответ на воздействие различной природы (радиация, гормоны), послужило основанием для предположения о том,что определенная популяция тимоцитов обладает специфической системой реализации генетической программы клеточной гибели (Хансон К.П., 1979),
Исходя из вышеизложенных представлений, можно полагать, что важным звеном в реализации данной программы являются изменения в экспрессии генетической информации в тимоцитах. Причем,данные изменения могут проявляться как на уровне транскрипции, так и на стадии процессинга и внутриклеточного транспорта РНК (Хансон К.П.,Животовский Б.Д.,1976; Евтушенко В.И. ,1980). Так установлено, что радиация вызывает в тимусе фазовые изменения процессинга РНК. Первая фаза нарушений наступает сразу после облучения, она характеризуется усилением "утечки" 18s рРНК и задержкой процессинга высокомолекулярных гяРНК. Вторая фаза проявляется спустя 1,5-2 часа после действия радиации, она выражается в неспецифической деградации различных видов РНК (Евтушенко В.И., 1980). Кроме того, в ряде работ обнаружено угнетение синтеза - зо -гяРНК (Валькович А,А., Хансон К.П.,1976), изменение времени жизни и нарушение гибридизационных свойств гяРНК (Хансон К.П.,Живо-товский Б.Д.,1976; Валькович А.А.,Хансон К.ЇЇ.,1976).
Здесь же следует отметить, что описанные выше исследования проведены на суммарной популяции тимоцитов и не учитывают особенностей экспрессии генетической информации в тимоцитах, находящихся на различных стадиях дифференцировки. Поэтому использование методов, позволяющих получить в препаративных количествах отдельные субпопуляции тимоцитов ( Burton et ai#, 1976) является необходимым условием выяснения природы пострадиационной гибели лимфо-идных клеток. Это позволяет также изучить вопрос об особенностях экспрессии генома на отдельных стадиях дифференцировки тимоцитов и сопоставить радиочувствительность клеток тимуса со степенью их зрелости.
2.Краткие сведения о структурно-функциональной организации генома высших организмов
Одной из основных задач настоящей работы являлось выяснение особенностей экспрессии генома в клетках тимуса, находящихся на разных стадиях дифференцировки. В связи с этим необходимо рассмотреть кратко, современные данные о структуре и функции генома высших организмов.
В молекулярной биологии термином геном принято обозначать совокупность нуклеотидных последовательной ядерной ДНК клетки (Гречко В.В.,1975). В отличие от ДНК прокариот ядерная ДНК эука-риотической клетки характеризуется значительным разнообразием частоты повторяемости отдельных нуклеотидных последовательностей ( Davidson et al«, 1974; Брыков В.А. и др., 1979). Впервые данные о различной повторяемости нуклеотидных последовательностей ДНК были получены Уорингом и Бриттеном в 1967 году ( Waring,Britten - ЗІ -et аі., 1967). Этот факт послужил основанием для использования метода реассоциации ДНК при изучении ее структурной организации, так как предполагалось, что последовательности, представленные с разной частотой будут обладать неодинаковой скоростью реассоциации. Данный методический подход был теоретически обоснован Бриттеном и Коном ( Britten, Коїш, 1967) и успешно применен ими для изучения структурной организации ДНК высших организмов.
Реассоциация (ренатурация) ДНК протекает в соответствии с кинетикой реакции второго порядка и осуществляется в два этапа.
На первом этапе, лимитирующем общую скорость процесса, происходит спаривание нескольких комплементарных оснований в одном или ряде участков ДНК, с образованием так называемого "ядра". На втором этапе происходит охлопывание комплементарных пар, то есть образование двойной спирали на всем протяжении комплементарных цепей ДНК ( Wetmur, Davidson, 1968).
Каждый конкретный вид ДНК характеризуется вполне определенными кинетическими параметрами реакции ренатурации, наиболее интегральным из которых является величина с ti# Эта величина представляет собой произведение начальной концентрации нуклеоти-дов (С0) на половинное время ( t ) ренатурации ДНК.
На основании данных о скорости ренатурации могут быть выделены несколько дискретных фракций ДНК, различающихся по частоте представительства, входящих в их состав нуклеотидных последовательностей. К наиболее часто повторяющимся относятся нуклеотид-ные последовательности со средней частотой представительства (10 на гаплоидный набор хромосом).Фракция так называемых промежуточных повторов представлена в геноме в виде ICr-IO копий.Нуклеотид-ные последовательности,ветречающиеся однократно или небольшое число раз,не более 10 .принято называть уникальными ( Walker - 32 -et al», 1969; Животовский Б.Д., 1975).
Структурно-функциональные характеристики отдельных кинетических фракций ДНК изучены достаточно полно.
Наиболее часто повторяющиеся последовательности ДНК представлены в значительной степени так называемой сателлитной ДНК, имеющей простой нуклеотидный состав. Так, например, сателлитная ДНК мыши содержит повторяющиеся последовательности ТТТТТЦ ( Southern, 1970; Животовский Б.Д. ,1975). Установлено, что значительная часть сателлитной ДНК сосредоточена в районе центромеры хромосом. Как полагают некоторые исследователи, эти последовательности ДНК принимают участие в процессе митотического расхождения хромосом ( Pardue, Call, 1970; Walker, 1971). Бриттен И др. ( Britten,Kohn , 1968) приписывают сателлитной ДНК эволюционную роль, считая, что они участвуют в образовании новых генов.
Умеренно повторяющиеся последовательности ДНК, в отличие от сателлитов, достаточно равномерно рассеяны по всему геному (Гвоздев В.А.,1978). Они представлены в виде тандемных повторов, локализованных в гетерохроматиновых участках хромосом (Ананьева Л.П. и др.,1968; Прокофьева-Бельгольская А.А.,1972) и повторов, входящих в состав полигенов (Чуриков Н.А. и др.,1978). Предполагается, что этот класс последовательностей участвует в репликации и кросинговере хромосом ( Taylor, 1974). Бриттен и Дэвидсон ( Britten, Davidson, I97S) высказали предположение о важной роли умеренных повторов в регуляции транскрипции генов.
В количественном отношении наиболее представительную часть (5ГО ДНК эукариот составляют уникальные последовательности ( Zimmerman et al#, 1977; Брыков В.А. и др.,1978). Функционально уникальные последовательности соответствуют структурным генам, с которых транскрибируется подавляющая часть информационных РНК - 33 - ( Goiderman et al., 1971; Grouse, 1972).Показано, что уникальная фракция ДНК гибридизируется с широким набором информационных РНК клетки ( Suzuki et al., 1972; Bishop, Rosbash, 1973).
В серии экспериментов с эмбрионами морского ежа Голдберг ( Goldberg et ai., 1973) установил, что практически вся мРНК, содержащаяся в полисомах, транскрибируется с уникальных последовательностей ДНК. Сразу же, однако, следует отметить, что около 10$ мРНК (в основном, гистоновые месенджеры) транскрибируются с повторяющихся последовательностей ДНК (Гайцхоки B.C.,1980).
Нуклеотидные последовательности, отличающиеся по частоте повторяемости, обладают вполне определенным характером линейного расположения в геноме. Так, около половины генома иглокожих, насекомых и растений представлена в виде повторяющихся последовательностей (200-400 пар оснований), чередующихся с участками уникальной ДНК длиной 700-800 пар оснований (п.о.). Несколько менее 25% генома представлены в виде чередований повторов (200-400 п.о.) с неповторяющимися участками длиной 3400 п.о. Примерно 6-8$ ДНК состоит из кластерированных повторяющихся последовательностей, формирующих гомогенную группу повторов длиной 1000 и более пар оснований.Остальная часть ДНК приходится на уникальные последовательности, сгруппированные без заметного присутствия повторов ( Grakonu et al., 1974; Брыков В.А. и др.,1978,1980). В то же время выявлен ряд эукариотических организмов, имеющих некоторые отличия в линейной организации генома. Так, у человека, моллюска и у крыс не обнаруживается чередование высокоповторяющихся и уникальных последовательностей ДНК. Для 80$ ДНК этих эволюционно отдаленных объектов характерно чередование коротких повторяющихся участков с уникальными последовательностями длиной от 2000 до 16000 нуклеотидов (Восток К., Саммер Э.,1980). Другой тип - 34 -линейной организации генома обнаружен у дрозофиллы, пчелы и мотыля, так ДНК этих насекомых содержит повторяющиеся последовательности длиной от нескольких сот до 10000 н.п., а средняя длина уникальных последовательностей составляет 30000 н.п. Не обнаружено в данной ДНК также коротких, повторяющихся нуклеотид-ннх последовательностей, перемежающихся с уникальными (Брыков В.А. и др.,1978).
Существенное сходство структурных организаций нуклеотидных последовательностей ДНК у различных эволюционно отдаленных объектов может свидетельствовать о важной роли взаиморасположения участков ДНК с разной частотой представительства в регуляции генной активности. В частности, при рассмотрении моделей так называемых "единиц транскрипции" Бриттен и Дэвидсон ( Britten, Davidson, 1969,1971), а также Георгиев Г.П.(1977)указывают на присутствие в транскрибируемых участках ДНК, наряду с уникальными последовательностями,повторяющихся, которые по мнению авторов участвуют в регуляции процесса транскрипции.
Одним из важных аспектов функционирования генома высших организмов является работа механизмов, регулирующих экспрессию генетической информации в разных органах одного и того же организма, клетки которого, как известно, содержат идентичный набор нуклеотидных последовательностей ДНК ( Chikaraiski et al,, 1978). Интересен также характер работы этих механизмов в клетках, находящихся на разных стадиях дифференцировки ( Brown,Churk, 1972; Galau et al., 1976).
Основным методическим приемом, с помощью которого изучаютоя особенности экспрессии эукариотического генома, является метод молекулярной гибридизации РНК-ДНК (Гречко В.В.,1975; Galau et al,, 1976; Suppowit et al#, 1981).
Параметры, характеризующие гибридизационную способность РНК, в существенной мере зависят от того, является ли данная молекула РНК транскриптом уникальных или повторяющихся генов. Естественно, что молекулы РНК, транскрибированные с последовательностей, представленных семейством близкородственных генов, будут гибридизироваться с ДНК значительно более эффективно по сравнению с РНК, которая представляет собой продукт уникальных генов. В зависимости от концентрационных соотношений между комплементарными последовательностями ДНК и РНК различают три вида гибридизации: гибридизация РНК в условиях избытка ДНК, при эк-вимолярных соотношениях обоих полинуклеотидов и при избытке РНК (Гречко В.В.,1975).
Исторически гибридизация ДНК с избытком РНК была использована раньше, поскольку доступность высокомолекулярных зондов рибосомных и транспортных РНК позволяли проводить реакцию гибридизации при избытке именно этих видов РНК (Гречко В.В.,1975). Общим результатом этих работ явилось установление факта множественности цистронов, кодирующих рибосомные и транспортные РНК ( Birnstiel et ai., 1971,1968). Последующее развитие препаративных методов получения информационных РНК и их ядерных предшественников (Георгиев Г.ЇЇ. и др.,1968; Гайцхоки B.C.,1979) послужило основой для применения метода молекулярной гибридизации уникальной ДНК с избытком РНК информационной природы. Гибридизация в избытке РНК позволяет определить представительство в ДНК структурных генов соответствующих РНК, выступающих в качестве молекулярных зондов при гибридизации.
Так, при гибридизации избытка ядерной и тотальной РНК различных тканей взрослого организма с высокомеченной уникальной ДНК удалось установить величину транскрибируемой части генома. - 36 -При этом обнаружилось, что в ДНК мозга тридцать процентов структурных генов активно участвуют в транскрипции, а, например, в тимусе и селезенке транскрипционная компонента составляет менее ОДНОЙ десятой части ДНК ( Brown,Churk, 1972; Chikaraiski et al., 1978,1979). Иначе говоря, суммарная РНК мозга по своей кинетической сложности в три раза превосходит набор РНК, представленный в клетках тимуса и селезенки. Близкий порядок различий обнаруживается и при анализе кинетической сложности цито-плазматических поли-А-содержащих РНК, выделенных из клеток данных тканей ( Hahn, laird, 1971).
Метод гибридизации уникальной ДНК с избытком РНК характеризуется высокой разрешающей способностью, что позволяет идентифицировать молекулы РНК, представленные в клетке в виде единичных КОПИЙ ( Chikaraiski et al., 1978,1979).
В ряде работ ( Grouse et al.,1972,1980; Косюк Г.Н. и др., 1974; Beckman et al., 1981) изучался характер изменений кинетической сложности РНК в процессе эмбрионального развития организмов. При этом установлено, что по мере созревания организма постепенно возрастает разнообразив информации, содержащейся в РНК, что обусловлено включением активности все новых генов.
Однако наряду с этим показано ( Brown et al., 1972), что каждой стадии развития соответствует свой совокупный набор последовательностей РНК, а некоторые гены, активные на ранних стадиях развития в дальнейшем транскрибируются очень ела бо, т. е. практически выключаются из процессе транскрипции.
Следует отметить, что выяснение деталей транскрипции при тканевой дифференцировке методом гибридизации в избытке РНК затруднено значительным перекрыванием последовательностей РНК, представленных в различных тканях развивающегося и взрослого - 37 -организма. Так, в опытах по гибридизации суммарных препаратов РНК мозга и печени, почек и мозга было показано, что от 60 до 96# последовательностей РНК, характерных для печени и почек представлены также В РНК мозга ( Brown,Churck, 1972; Chikaraiski et al., 1978). Поэтому для изучения тканеспецифических последовательностей РНК был предложен метод рециркуляции уникальной ДНК. Он основан на последовательном насыщении (1-5 раз) высокомеченой уникальной ДНК избытком РНК. При этом на каждом этапе насыщения гибриды ДНК-РНК отделяли от однонитевой ДНК с помощью ГАП. Полученные таким образом фракции уникальной ДНК использовались в качестве партнера при последующих гибридизациях с избытком гомо-и гетерологичной РНК ( Galau et al.J976;Moyzis et al., 1980; Suppowit et al., 1981).
Данный методический подход позволяет идентифицировать специфические последовательности РНК, появляющиеся в процессе развития организма. Так, использование для гибридизации меченой уникальной ДНК, обогащенной последовательностями мРНК гаструлы морского ежа, позволило выявить двадцатипроцентную разницу между набором мРНК гаструлы и других стадий эмбрионального развития. В то же время при гибридизации этих препаратов с уникальной не-рециркулированной ДНК разница практически не выявлялась ( Galau et ai., 1976). При исследовании кинетической сложности полисомальной РНК, выделенной из эмбрионов морского ежа, установлено, что каждый этап дифференцировки организма характеризуется появлением специфических видов информационных РНК ( Galau et al., 1976; Hough-Evans et al,, 1977). При этом, на ранних стадиях онтогенеза (от стадии яйца и до стадии плутеуса) наблюдается снижение сложности цитоплазматичеокой и полисомальной мРНК. Выяснило-лось также, что тотальная РНК незрелого ооцита обладает меньшей - 38 -сложностью по сравнению с РНК зрелого социта. На основании полученных данных авторы ( Galau et al., 1976; Hough-Evans et al,, 1977) считают, что в процессе созревания яйца морского ежа происходит накопление последовательностей РНК, которые будут использоваться на более поздних стадиях онтогенеза.
Другим биологическим феноменом, сопровождающимся появлением новых последовательностей РНК, является компенсаторный и неоплас-тический рост тканей. Так при гибридизации тотальной РНК регенерирующей и нормальной печени с рециркулированной уникальной ДНК было установлено, что в составе РНК регенерирующей ткани на первые и вторые сутки после частичной гепатэктомии обнаруживается около 20$ новых последовательностей РНК. Гибридизация РНК регенерирующей печени с нерециркулированной уникальной ДНК не выявила сколько-нибудь значимых различий ( Grady,1979).
В работе Саповита с сотрудниками ( Suppowit et al,, 1981) исследовался состав поли(А)-содержащих РНК из ткани нормальной молочной железы крысы и ее опухолевого аналога. Для гибридизации использовали высокомеченную уникальную ДНК, насыщенную последовательностями РНК нормальной молочной железы. Анализ полученных результатов показал, что злокачественное перерождение молочной железы приводит к существенному изменению состава поли(А)-содержащих РНК. Оно выражается в появлении 30$ новых последовательностей РНК, не свойственных нормальной ткани. Одновременно выяснилось, что обе ткани содержат класс РНК очень высокой кинетической сложности, который по мнению авторов, играет значитель^-ную роль в определении фенотипа данного вида клеток.
Еще одним методическим приемом, используемым при изучении сложности клеточной РНК, является метод, основанный на анализе кинетики гибридизации избытка поли(А)-содержащей РНК с комплемен- - 39 -тарной ДНК (кДНК), синтезированной в системе обратной транскрипции ( Hereford, 1977 ;Городецкий СИ. и др., 1982). Следует отметить некоторые недостатки этого метода, заключающиеся в том,что с его помощью возможно исследовать только поли(А)-содержащие РНК. Кроме того, он занижает результаты гибридизации последовательностей РНК высокой сложности, которые обычно представлены в клетках в небольших концентрациях ( Ryffel,McCarthy, 1975; Perlman,Rosbash, 1978; Chikaraiski et al., 1978). Так, при анализе кинетики гибридизации кДНК установлено, что популяции поли(А)-содержащих РНК из различных органов и тканей животных -гетерогенны. Они обычно представлены 2-3 дискретными классами молекул, различающихся по относительной концентрации индивидуальных РНК ( Bishop et al., 1974; Hastic et al., 1976).
Первый из упомянутых классов РНК обладает низкой кинетичес-кой сложностью и высокой относительной концентрацией (10-10) копий на клетку. Второй класс последовательностей отличается высокой сложностью и соответственно низкой относительной концентрацией (10-10) копий на клетку. В некоторых случаях обнаруживается промежуточный третий класс РНК (Городецкий СИ. ,1982).
И все же, несмотря на отмеченные выше недостатки, применение данного метода при изучении степени сходства и различия препаратов поли(А)-содержащей РНК дифференцирующихся, регенерирующих и неопластических тканей, позволило выявить некоторые особенности в экспрессируемости этих видов РНК на уровне ядра и цитоплазмы. Так, в работе Фаусто с сотрудниками ( Fausto et al., 1982) изучалась степень гомологичности ядерных поли(А+)РНК полученных из нормальной, регенерирующей и неопластической ткани печени. Препарат кДНК, используемый при гибридизации,синтезировали на матрице РНК выделенной из регенерирующей ткани. Синтезиро- - 40 -ванный препарат кДНК с помощью поэтапной рециркуляции насыщали последовательностями матричной РНК. На каждом этапе рециркуляции двунитевые гибридные молекулы кДНК/РНК гибридизовались с препаратами РНК, полученными из нормальной и неопластической ткани. В результате этих исследований было установлено, что каждый из изучаемых препаратов ядерной поли(А+)РНК включает в свой состав одни и те же последовательности РНК, В то же время было выявлено различие в кинетической сложности этих препаратов (І5-ЗВД. По мнению авторов оно обусловлено варьированием относительного содержания некоторых транскрилтов в общей популяции молекул РНК, каждой из исследуемой ткани. Сходные выводы были сделаны и в работе Мозиса с сотрудниками ( Moyzis et аі.,І980) на основании результатов гибридизации кДНК и уникальной ДНК с препаратами ядерных полиаденилированных РНК, полученных из неопластических (трансформированных с помощью химических канцерогенов) и нормальных клеток. Было показано, что исследуемые препараты ядерной РНК не имеют качественных различий по составу транскрилтов, хотя и различаются по кинетической сложности.
В отличие от вышеописанных работ Вилке с с сотрудниками ( Wilkes et ai.f 1981) исследовал с помощью реакции гибридизации цитоплазматическую поли(А+)РНК полученную из регенерирующей печеночной ткани. В качестве второго компонента реакции гибридизации использовалась кДНК синтезированная на матрице РНК из нормальной печени. Было установлено, что восстановление печеночной ткани сопровождается появлением в составе общей популяции РНК 10-15$ качественно новых видов транскрилтов. Присутствие новых видов РНК в популяции цитоллазштической поли(А+)РНК полученной из регенерирующей ткани печени и отсутствие их в ядерных препаратах, вероятно, можно объяснить опираясь на данные, полученные в - 41 - экспериментах по гибридизации ядерной и цитошгазматической РНК с уникальной ДНК. В этих исследованиях выяснилось, что сложность цитошгазматической РНК составляет всего лишь 10-15% сложностиядерной РНК ( Bantle et al., 1974,1976; Grady et al., 1978; Beckman et al,, 1981).
Все это послужило основанием для представлений о посттранскрипционном механизме регуляции экспрессии генетической информации ( Davidson, Britten, 1979). Согласно ЭТОЙ ГИП0ТЄЗЄ С КОНСТИТУТИВНЫХ транскрипционных единиц транскрибируются общие для разных тканей транскрипты (входящие в оостав гяРНК). Затем эти транскрипты подвергаются дифференциальному процессированию с образованием тканеспецифических наборов МРНК ( Davidson,Britten, 1979).
Таким образом, с помощью вышеописанных методов гибридизации было установлено, что различные фенотипические проявления организма (дифференцировка тканей, неоплаотичвский рост и т.д.) сопровождаются изменением сложности исследуемых препаратов РНК. Эти изменения в ряде случаев носят количественный характер,т.е.связаны с вариацией относительного содержания некоторых транскриптов в общей популяции молекул РНК. В других случаях наряду с количественными изменениями может происходить исчезновение отдельных транскриптов и появление новых. Следует отметить, что некоторые виды РНК представлены в тканях в количестве 10 - 10 * молекул на клетку, т.е. встречаются не в каждой клетке органа. Определение таких редких РНК находится на пределе чувствительности методов молекулярной гибридизации (гибридизация избытка РНК с унДНК и кДНК) с помощью которых обычно анализируют популяции клеточных РНК. В связи с этим были разработаны специальные методические подходы, позволяющие_выявлять редкие транскрипты и таким - 42 -образом более адекватно оценивать изменения в экспрессии генов на разных стадиях дифференцировки клеточной популяции. Наиболее часто ИСПОЛЬЗуетСЯ МвТОД рвЦИркуЛЯЦИИ МеченНОЙ Пробы ( Galau et al.
1976). Показано, что его применение позволяет повысить чувствительность реакции гибридизации более чем на порядок ( Galau et al., 1976; Suppowit et al., 1981). В связи с этим, можно полагать, что данный метод может служить тем инструментом, с помощью которого могут регистрироваться те тонкие изменения в экспрессии генетической информации, которые происходят в процессе дифференцировки тимоцитов.
Облучение животных и культуры клеток
Как известно, важнейщую роль в выполнении иммунной функции организма млекопитающих играет лимфоидная система, состоящая из лимфоидных клеток различных типов, распределенных между периферическими и центральными лимфоидными органами (Николаева Н.В. и др.,1981).
К периферическим лимфоидным образованиям обычно относят лимфатические узлы, селезенку (белая пульпа) и лимфоидную систему кишечника.
К числу центральных лимфоидных органов в первую очередь относится костный мозг - источник полипотентных стволовых клеток для всех ростков кроветворения, включая и лимфопоэз. У млекопитающих костный мозг также является местом образования В-лимфо-цитов (В-клеток).
Другим центральным лимфоидным органом является тимус. У большинства млекопитающих он расположен в грудной полости, за грудиной, и состоит из широкого коркового слоя и мозгового вещества, занимающего центральную часть органа. Ткань тимуса образована, в основном, клетками двух типов, лимфоидными и ретикулярными.
К лимфоидным клеткам относятся клетки с плотным круглым ядром и узкой каймой цитоплазмы (Миллер Д., Дукор П.,1967). Большая часть этих клеток (около 85$) сосредоточена в корковом веществе и включает в себя несколько различных субпопуляций лимфо - II цитов (рис.1,2). Так, около трех процентов кортикальных тимоци-тов обладает повышенными размерами и высокой пролиферативной активностью. Эти клетки расположены в субкапсулярной зоне кортикального слоя и рассматриваются как предшественники тимоцитов (Брондз Б.Д.,Рохлин О.В.,1978).Большая часть кортикальных клеток (более 8$) имеет небольшие размеры и расположена по всему периметру коркового слоя. Они,в свою очередь, подразделяются на ряд субпопуляций, соответствующих определенным стадиям зрелости тимоцитов (рис,1,2).
Лимфоциты медуллярной зоны тимуса (около 15% всех тимоцитов) состоят в основном из клеток средних и больших размеров. По мнению ряда авторов ( Burton et ai., 1976; Брондз Б.Д., Рохлин О.В. ,1978), эти клетки являются конечными формами дифференцирующихся тимоцитов. Здесь же, в медуллярной зоне, особенно отчетливо видны ретикулярные элементы тимуса. Обычно это крупные клетки со слабоокрашивающейся цитоплазмой и овальным рыхлым ядром (Миллер Д., Дукор П.,1967). Большинство ретикулярных элементов, имеющих эпителиальное происхождение, образуют рыхлую сеть (строму) тимуса, в петлях которой находятся лимфоциты. Другие ретикулярные клетки оказываются типичными макрофагами мезенхи-мального происхождения (Миллер Д., Дукор П., 1967; Николаева Н.В. и др. ,1981). Для мозгового вещества взрослых животных характерны так называемые тельца Гассаля - концентрические скопления уплощенных и веретеновидних эпителиальных клеток.
Облучение животных и культуры клеток
В работе использовали самцов, белых беспородных крыс, весом 100+5 г. Культуру тимоцитов получали путем ресуспендирования ткани тимуса в среде 199, содержащей 10$ сыворотки телят.Суспен с. с
зию расфасовывали по 5 мл (4x10-5x10 клеток/мл) и инкубировали при 37С в течение 1-6 часов. При более длительной инкубации клеток в суспензию добавляли 100 ед/мл пенициллина и 50 ед/мл стрептомицина. Осаждали тимоциты центрифугированием при 180 g (центрифуга К-70, ГДР).
2.Облучение животных и культуры клеток
Крыс подвергали общему рентгеновскому облучению на аппарате РУМ-І7 при следующих условиях: кожно-фокусное расстояние 0,5 м, напряжение на трубке 200 кВ, сила тока 15 мА, фильтры 0,5 мм Си + 1,0 AI, мощность дозы 0,0015 Гр/с. Облучение животных проводили в условиях, обеспечивающих максимальное обратное рассеивание излучения.
Облучение тимоцитов в суспензии проводили в стеклянных пробирках при 20С на рентгеновской установке РУМ-І7 при расстоянии "источник-поверхность" 50 см и мощность дозы 0,0015 Гр/с.
З.Выделение и фракционирование тимоцитов
Животных забивали декапитацией. Тимус извлекали и помещали в раствор Рингера (130 мМ NaCl 4,4 мМ ксі 1,2 мМ СаС12 рН 7,4). Ткань растирали в слабопритертом стеклянном гомогениза - 44 -торе и фильтровали через два слоя капрона. Клеточную взвесь дважды отмывали в растворе Рингера, центрифугированием при 180 g в течение 7 мин.
Суспензию клеток, разведенную до концентрации 1-4x10 клеток/мл наносили шприцом в объеме 3 мл поверх I мл раствора фиколл-пака ( Parmaсіа, Швеция) с уд.плотностью 1,077. Разделение клеток достигалось центрифугированием при 280g в течение 30 мин. Затем шприцом отбирали три фракции клеток: верхнюю с наименьшей плотностью (меньше 1,077), среднюю - с промежуточной плотностью (равной 1,077) и тяжелую - с максимальной плотностью (больше 1,077). Клетки дважды отмывали в растворе Рингера рН 7,4, центрифугированием при I80g . Затем к 0,4 мл взвеси клеток добавляли 0,2 мл 0,1$ раствора трипанового синего и вно-1/сили в камеру Горяева,где подсчитывали общее количество клеток и определяли число жизнеспособных (неокрашенных) тимоцитов. Радиус клеток определяли с помощью окуляр-микрометра.
Фракционирование тимоцитов в градиенте фиколл-пакаи их характеристика
Одним из распространенных методических подходов, с помощью которого получают субфракции тимоцитов различной степени зрелости, является изоплотностное разделение клеток в градиентах плотности бычьего сывороточного альбумина (БСА), фиколла и некоторых других веществ ( Shortman, 1975; Сунгуров А.Ю., 1983). Применение метода изошютностного осаждения требует соблюдения ряда условий.
1. Минимальное повреждение клеток при разделении. Обычно этого достигают применением щадящих градиент формирующих сред -БСА, фиколл, фиколл-пак, перколл и т.д. ( Shortman, 1968; Burton et al#f 1976; Yamada et al., 1980).
2. Максимальное разделение различающихся по плотности клеток в пределах возможности используемого метода. Для выполнения этого требования предварительно изучается характер осаждения клеток при различных режимах фракционирования, и на основании этого подбирается режим осаждения, позволяющий максимально разделить клетки по их плотности ( Shortman, 1968).
Известно, что для эффективного отделения тяжелых кортикальных тимоцитов от легких клеток медуллярного слоя тимуса достаточно применить среды с плотностью 1,077-1,080 ( Shortman, 1972; Betel et al., 1979). Исходя из этого, мы использовали для раз - 60 деления тимусных клеток одноступенчатый градиент фиколл-пака (плотность ступеньки 1,077). Были получены три фракции тимоцитов.
На рис.4, 5, 6 показан характер изменений изоплотностного осаждения тимоцитов на ступеньке фиколл-пака в зависимости от скорости и времени осаждения (рис.4, 5), а также от концентрации клеток (рис.б). Наиболее стабильное распределение клеток по градиенту наблюдается при 800-1000 об/мин (рис.4), при продолжительности центрифугирования 20-30 мин (рис.5) и концентрации тимоцитов 10 клеток/мл (рис.6).
Таким образом, для фракционирования тимоцитов был выбран следующий режим: клетки осаждали при 1000 об/мин (280g ) в те-чение 30 мин, концентрация тимоцитов составляла I-ЗхІО клеток/мл. Как видно из табл.2, 66% клеток после разделения обна- руживается в осадке, а около 20% клеточных форм с плотностью 1,077 концентрируется четкой зоной ниже интерфазной поверхности. Легкая (верхняя) фракция составляет в среднем 14% от общего выхода клеток с градиента. Индивидуальный разброс результатов достаточно велик, что, очевидно, отражает колебания соотношений различных субпопуляций клеток тимуса у отдельных животных ( Shortman, 1972).
