Содержание к диссертации
Список использованных сокращений 6
ВВЕДЕНИЕ 7
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1 История создания бифункциональных антител и области
их применения 12
2 Тестирование бифункциональных антител 16
3 Взаимодействие антител с антигенами в растворе и на твердой фазе
4 Антигенсвязывающие свойства бифункциональных моноклональных антител 19
5 Применение бифункциональных антител в иммуногистохимии, иммуноблоттинге и твердофазном иммуноферментном методе 23
6 Заключение 29
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 30
1 Клеточные линии 30
2 Очистка моноклональных антител с помощью ионообменной хроматографии 30
3 Определение антипероксидазной активности антител 31
4 Определение антигенсвязывающей активности антител 32
5 Определение активности бифункциональных антител 33
иммуноферментным методом с двумя антигенами (doubl antigen ELISA-test)
6 Сэндвич-метод тестирования миоглобина 33
7 Приготовление аффинных носителей 34
8 Аффинная очистка моноспецифических антител 34
9 Аффинная очистка бифункциональных антител 35
10 Определение концентрации белка 35
11 Приготовление антигенов и антител, меченых 1251 45
12 Определение концентрации меченых 1251 антител после аффинной очистки 37
13 Анализ связывания меченых 1251 антител с антигеном, адсорбированным на твердой фазе 37
14 Определение равновесной константы ассоциации при связывании антител с иммобилизованными антигенами 37
15 Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия 38
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 40
1 Очистка монофункциональных и бифункциональных
антител 40
1.1 Очистка моноклональных антител с помощью ионообменной хроматографии 40
1.2 Очистка бифункциональных моноклональных антител с помощью аффинной хроматографии 41
Оценка чистоты полученных антител 45
1.4. Оценка антигенсвязывающей активности антител 45
Антигенсвязывающие свойства антител при связывании
с антигенами, сорбированными на твердой фазе 47
2.1. Анализ характера взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном радиоиммунологическим методом
1 Получение антител, меченых 1251 48
2 Анализ взаимодействия меченых 1251 антител с иммобилизованным антигеном методом Скэтчарда 49
3 Анализ взаимодействия бифункциональных антител со специфичностью антимиоглобин/антипероксидаза с иммобилизованным миоглобином 54
Модель бивалентного связывания бифункциональных
антител при одновременной сорбции на твердую фазу
смеси двух антигенов
Эффективность бифункциональных антител, как
детектирующих антител в твердофазном ИФА 57
ОБСУЖДЕНИЕ 65
Связывание антител с иммобилизованным антигеном 66
Эффективность бифункциональных антител, как
детектирующих антител в твердофазном
иммуноферментном методе 70
ПРИЛОЖЕНИЕ
Теория связывания антител с антигеном 7
Модель бивалентного связывания антител с антигеном,
иммобилизованным на твердой фазе ™
3 Использование бивалентной модели для предсказания 81
теоретически ожидаемых изменений наблюдаемой
равновесной константы ассоциации (К^) в зависимости
от преимущественного характера связывания антител с иммобилизованным антигеном
Использование бивалентной модели для предсказания 81 теоретически ожидаемых изменений параметров кривых связывания в зависимости от преимущественного характера связывания антител с иммобилизованным антигеном
Определение соотношения антител, связанных с 82 иммобилизованным антигеном бивалентно и моновалентно
ВЫВОДЫ 83
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 84
БЛАГОДАРНОСТИ 99
Введение к работе
Актуальность проблемы. Наряду с обычными моноклональными антителами (МКА) гибридомная технология позволяет получать биспецифические (бифункциональные) антитела1 (БИАТ), несущие сайты связывания двух различных антигенов (АГ) [Milstein and Cuello, 1983]. БИАТ синтезируются гибридными гибридомами (тетрадомами), которые образуются при слиянии двух родительских гибридом (Рис. 1). Молекулы бифункциональных антител образуются в тетрадомах при рекомбинации двух АГ-связывающих сайтов ("полумолекул"). Родительские МКА и соответствующий АГ-связывающий сайт БИАТ имеют одинаковую структуру АГ-связывающих центров (см. Рис. 1) и, как следствие, проявляют одинаковые АГ-связывающие свойства. В работе Алларда с соавторами [Allard et al., 1992], показано, что при связывании с антигеном в растворе аффинность родительских моноклональных антител равна аффинности соответствующего АГ-связывающего сайта БИАТ.
В практическом плане БИАТ, несущие сайты связывания с тестируемым антигеном и ферментом, (например пероксидазой хрена [ПХ]) могут выполнять роль меченых2 молекул и заменять традиционные конъюгаты (антитела, ковалентно связанные с ферментом). Такие БИАТ могут успешно использоваться в иммуногистохимии, иммуноблоттинге и иммуноферментном анализе (ИФА), и их называют биоконъюгатами нового поколения - см. обзор: [Cao and Sures (1998)]. Другим важным приложением БИАТ,
включающих сайты связывания с антигеном злокачественной клетки и
» биологически активным веществом, может быть направленный
транспорт лекарств к опухолевым клеткам (направленная химиотерапия)
[Webb at al., 1985].
Весьма важной как с практической, так и с теоретической точки
зрения, является проблема взаимодействия антител (AT) с
поверхностными АГ клеток и вирусов, а также с АГ, адсорбированными
на твердой фазе. Молекула иммуноглобулина класса IgG несет два АГ связывающих сайта и может связываться с поверхностными и
иммобилизованными АГ как одним антигенсвязывающим сайтом
(моновалентно, см. Рис. 2, а), так и двумя антигенсвязывающими
сайтами одновременно (бивалентно, см. Рис 2, б). БИАТ несут два сайта,
специфичных к различным антигенам, и, таким образом, могут
связываться с адсорбированным АГ только моновалентно (см. Рис. 2, в).
При этом следует принять во внимание, что структура молекулы БИАТ,
исключая один АГ-связывающий сайт (как первичная, так и третичная),
тождественна структуре родительских AT. Таким образом,
сравнительный анализ связывания монофункциональных AT и БИАТ с
иммобилизованным АГ позволяет корректно оценить характер
взаимодействия МКА (моновалентное или бивалентное). Отметим, что
до сих пор характер взаимодействия AT с иммобилизованным АГ
оценивали путем сравнения параметров связывания нативной молекулы
AT и ее Fab-фрагментов [Greenwood et al., 1963]. Эти фрагменты
включают антигенсвязывающий сайт и образуются из молекулы IgG
после обработки папаином (Рис. 2, г). Очевидно, что для оценки
характера взаимодействия AT с АГ Fab-фрагмент AT является гораздо
менее полноценной молекулой, чем БИАТ.
Бесспорно, что бивалентное связывание AT с антигенами
существенно прочнее, чем моновалентное. Следовательно (по крайней
мере, теоретически), обычные МКА должны обеспечивать более
чувствительную детекцию иммобилизованного антигена по сравнению с БИАТ. Вместе с тем, большой массив публикаций свидетельствует об успешном применении БИАТ как меченых молекул в иммуногистохимии, иммуноблоттинге и твердофазном ИФА (эти данные суммированы в обзоре [Cao and Sures, 1998]). Однако постулируемые преимущества БИАТ как меченых молекул по сравнению с обычными конъюгатами представляются весьма спорными. На сегодняшний день, на наш взгляд, отсутствуют работы, в которых бы корректно сравнивались свойства БИАТ и обычных МКА, конъюгированных с ферментом, как меченых молекул.
Цели и задачи исследования. Цель исследования - изучение типа взаимодействия AT с иммобилизованными АГ (моновалентное или бивалентное) путем сравнительного анализа связывания МКА и БИАТ, содержащих тождественные сайты связывания с АГ, а также сопоставление двух типов меченых молекул: традиционных конъюгатов МКА с ферментом и БИАТ, несущих сайт связывания с ферментом.
В задачи работы входило:
1) для определения типа взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном (моновалентное или бивалентное) соотнести равновесные константы связывания родительских антител и тождественного антигенсвязывающего сайта бифункциональных антител;
2) для анализа характера взаимодействия сравнить антитела к антигенам различной молекулярной массы и структуры: миоглобину (мол. масса» 18,6 кДа), пероксидазе хрена (мол. масса«40 кДа) и IgG человека (мол. масса«160 кДа).
3) сравнить два типа меченых молекул: конъюгаты антимиоглобиновых антител с пероксидазой хрена и бифункциональных антител, несущих тождественный сайт связывания с миоглобином и
пероксидазой хрена в твердофазном ИФА и сделать вывод о чувствительности анализа.
Научная новизна и научно-практическая значимость исследования. Для оценки характера взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном (моновалентное или бивалентное) предложен оригинальный подход, который предполагает сравнительный анализ параметров связывания родительских моноклональных антител и бифункциональных моноклональных антител, несущих тождественный сайт связывания с антигеном
Проведен сравнительный анализ двух типов меченых молекул антител: антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (традиционного конъюгата) и БИАТ, несущих тождественный сайт связывания с тестируемым антигеном и пероксидазой хрена. Показано, что бифункциональные антитела в качестве меченых молекул не дают выигрыша в чувствительности иммуноферментного анализа в сравнении с традиционными конъюгатами.
Полученные результаты могут представлять интерес для возможного использования этого нового класса биомолекул.
