Содержание к диссертации
Введение
ПОЛИОКСИАЛКАНОАТЫ - ЦЕЛЕВОЙ ПРОДУКТ БИОТЕХНОЛОГИИ 7
1 Продуценты, субстраты и способы биосинтеза полиоксиалканоатов 7
2 Технико-экономический анализ основных типов биореакторов, используемых для получения ПГА 14
3 Технико-экономические предпосылки организации промышленного выпуска ПГА 17
4 Технологические основы процесса производства ПГА при исследовании водородокисляющих бактерий 22
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 30
1 Объекты исследования и схемы экспериментальных установок 30
2 Методы определения параметров процесса
биосинтеза полигидроксиалканоатов 36
3 Анализ зависимостей для расчёта гидродинамических и массообменных характеристик в биореакторах с перемешивающими устройствами 47
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 57
1 Гидродинамические параметры биореакторов с турбинной и лопастной мешалками 57
2 Массоотдача в биореакторах с турбинными
и лопастными перемешивающими устройствами 65
3 Кинетические и физические параметры автотрофной культуры Reutropha в режиме аккумуляции полигидроксиалканоатов 75
3.4 Кинетические параметры гетеротрофной культуры R. eutropha в режиме аккумуляции полигидроксиалканоатов 81
3.4.1 Кинетические параметры культуры, аккумулирующей полимеры на фруктозе 81
3.4.2 Факторы, влияющие на процесс синтеза полимера в гетеротрофной культуре 89
Выводы по главе 95
4 ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 99
4.1 Исходные данные для проектирования оборудования ОП 99
4.2 Аппаратурная и технологическая схема опытного производства 100
4.3 Результаты испытаний технологии производства полимера в условиях опытного производства 104
4.3.1 Предферментационная стадия 104
4.3.2 Ферментационная стадия 107
4.3.3 Постферментационная стадия 109
4.4 Материально-энергетические затраты на получение полимера 110
Выводы по главе 114
Основные результаты и выводы по работе 115
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАНГЫХ ИСТОЧНИКОВ 117
ПРИЛОЖЕНИЕ
- Продуценты, субстраты и способы биосинтеза полиоксиалканоатов
- Объекты исследования и схемы экспериментальных установок
- Гидродинамические параметры биореакторов с турбинной и лопастной мешалками
Введение к работе
Создание экологически чистых материалов с полезными свойствами остается одной из ключевых проблем современности. В последние годы все более актуальными становятся работы по полимерам биологического происхождения. Замена не разрушаемых синтетических полимеров, накопление которых в биосфере представляет глобальную экологическую проблему, на биоразрушаемые, имеет огромное экологическое значение.
Среди применяемых и активно разрабатываемых в настоящее время биоразрушающихся полимеров можно выделить: алифатические полиэфиры, полиамиды, сегментированные полиэфируретаны, полимеры молочной и гликолевой кислот (полилактиды и полигликолактиды), силикон, полиэтилентерефталат, поли-/?-гидроксибутират и другие полимеры гидроксипроизводных жирных кислот, так называемые полигидроксиалканоаты [1, 2, 3].
Полигидроксиалканоаты (ПГА) - это класс природных полиэфиров, которые синтезируют прокариотические организмы в специфических условиях несбалансированого роста в качестве эндогенного депо энергия и углерода, используя для этого различные субстраты. Список микроорганизмов, способных с теми или иными выходами аккумулировать полигидроксиалканоаты, быстро пополняется.
Полигидроксиалканоаты по ряду физико-химических свойств сходны с широко применяемыми и выпускаемыми в огромных количествах неразрушающимися в природной среде синтетическими полимерами (полипропиленом, полиэтиленом). Помимо термопластичности, полигидроксиалканоаты обладают оптической активностью, антиоксидантными свойствами, пьезоэлектрическим эффектом и, что самое главное, они характеризуются биоразрушаемостью и биосовместимостью. Возможности получения на основе ПГА композитов с различными природными и синтетическими материалами, позволяющие направленно изменять их структуру, состав и, следовательно, базовые свойства материала - пластичность, механическую прочность, температурные и другие характеристики, еще более усиливает привлекательность ПГА и расширяет возможные сферы применения.
Из ПГА возможно получение гибких пленок, полупроницаемых мембран, нитей, нетканых материалов, различных полых форм (бутыли, контейнеры, коробки и пр.), а также гелей и клеев. Совокупность свойств, характерных для ПГА, делает их перспективными для применения в различных сферах; медицине, фармакологии, пищевой и косметической промышленности, сельском и коммунальном хозяйстве, радиоэлектронике [3-11]. Потенциальная возможность синтеза бактериями разнообразных по составу полимеров дает основания для направленного получения материалов с заданными свойствами [3,12].
Одним из наиболее перспективных промышленных продуцентов ПГА являются водород окисляющие бактерии Ralstonia eutropha, которые способны использовать для роста разнообразные субстраты; водород и сахаросодержащие продукты природных углеродсодержащих материалов, включая отходы переработки древесины, растительных биомасс, бурых углей и др. Масштабы применения полигидроксиалканоатов сдерживаются достаточно высокой их стоимостью. Для расширения выпуска и сфер применения полигидроксиалканоатов в настоящее время проводится интенсивная работа, ориентированная на уменьшение стоимости ПГА за счет внедрения более продуктивных бактериальных штаммов, в том числе транс генных, расширения спектра применяемого углеродного сырья, t снижения его стоимости, совершенствования синтеза процессов и выделения полимера из бактериальной биомассы. Для выбора оптимальной стратегии оптимизации технологии необходимо совершенствование аппаратуры, в особенности ферментационных аппаратов с высокими массообменными характеристиками для обеспечения высокопродуктивных процессов ферментации, инженерная реализация и сравнительная оценка различных вариантов процессов синтеза ПГА. Для перехода к промышленному уровню производства необходимым этапом является масштабирование лабораторного процесса до уровня Опытного и исследование его технико-технологических характеристик.
Ключевой проблемой при создании Опытного производства является разработка аппаратуры, технологической схемы, её реализация и исследование. Для обеспечения высоких выходов в биотехнологическом производстве, в частности, полимера необходимы всесторонние знания кинетики процесса ферментации, гидродинамических, тепло - и массообменных характеристик и технологических параметров основного ферментационного оборудования.
Это определяет цель настоящей работы, ориентированной на технико технологическое исследование процессов биосинтеза полигидроксиалканоатов, получение исходных данных для проектирования и реализации Опытного производства их получения.
Автор благодарит своих руководителей Николая Александровича Воинова и Татьяну Григорьевну Волову за помощь в работе, сотрудников Института биофизики СО РАН Н.О.Жила, О.Г. Беляеву, В.Ф. Плотникова, Г.С. Калачеву за помощь в проведении экспериментов.
Продуценты, субстраты и способы биосинтеза полиоксиалканоатов
К настоящему времени описано свыше 100 типов полимеров. Известно более чем 300 представителей микроорганизмов, синтезирующих полигидроксиалканоаты, однако, в качестве реальных кандидатов для промышленного использования активно изучают и рассматривают небольшое число продуцентов. Это Alcaligenes eutrophus (Ralstonia eutropha), Alcaligenes lotus, Azotobacter vinelandii, Pseudomonas oieovorans, Methylomonas (таблица 1.1). Данные организмы обладают свойствами, необходимыми для промышленного продуцента. Среди таковых - способность синтезировать ПГА в плотных культурах с высокими выходами при относительно небольших затратах времени, высокая валовая продуктивность на единицу объема биореактора, способность усваивать различные источники углерода с высокой степенью конверсии субстрата в продукт, необходимые физико-химические свойства синтезируемого полимера (молекулярная масса, кристалличность, температура плавления, механическая прочность и др.).
Бактерии, используемые для получения ПГА, по применяемым методам культивирования подразделяют на две группы. К первой относятся организмы, эффективный синтез полимеров у которых происходит при избытке источника энергии и углерода в среде, но при лимитировании роста одним из биогенных элементов (азотом, серой, фосфором, калием, магнием или кислородом). К этой группе относятся Alcaligenes eutrophus, Azotobacter vinelandii, Pseudomonas oleovorans и другие.
Ко второй группе относятся микроорганизмы, характеризующиеся способностью эффективно синтезировать ПГА при высоких скоростях роста, без ограничения роста каким либо лимитирующим фактором. Это Alcaligenes latus и рекомбинантные организмы.
Одним из наиболее перспективных промышленных продуцентов ПГА являются хемоорганоавтотрофные водородокисляющие бактерии Ralstonia eutropha, синтезирующие высокомолекулярные ПГА различной химической структуры с высокими выходами на различных субстратах - смесях С02 и Н2, спиртах и органических кислотах. Способность бактерий Ralstonia eutropha синтезировать ПГА в автотрофных условиях, на водороде и диоксиде углерода, то есть без дорогостоящих органических сред, представляет особый интерес для индустрии ПГА. Наличие среди водородокисляющих бактерий организмов, резистентных к монооксиду углерода, позволяет ставить вопрос о привлечении для будущих крупнотоннажных производств ПГА техногенных источников водорода - водородсодержащих продуктов конверсии природного газа и углей, и других природных углеродсодержащих соединений.
Объекты исследования и схемы экспериментальных установок
Исследованы водородные бактерии Ralstonia eutropha В5786 (прежнее название Alcaligenes eutrophus 2-1 [64].
Для выращивания бактерий за основу принята солевая среда Шлегеля: Na2HPOrH20 - 9.1; КН2Р04 - 1.5; MgS04-H20 - 0.2; Fe3C6H507-7H20 - 0,025 (кг/м ), Микроэлементы вводили по прописи Хоагланда [70] из расчёта 3 мл стандартного раствора на 1 литр среды. Стандартный раствор содержит: НзВОз - 0.288; СоС12-бН20 - 0.030; CuSOr5H20 - 0.08; МпО24Н20 - 0.008; ZnSOr7H20 - 0.176; NaMoOr2H20 - 0.050; NiCl2 - 0.008 (кг/м3).
В качестве источника азота использовали хлористый аммоний и мочевина, концентрация которых в среде в зависимости от плотности бактериальной культуры составляла 0.2-1 кг/м .
При автотрофном культивировании использовали газовую смесь в соотношении С02: 02: Н2 = 1 : 2 : 7 по объёму.
При гетеротрофном культивировании в качестве источника углерода и энергии была принята фруктоза, концентрация которой в среде варьировала от 0,5 до 14 кг/м3.
Для культивирования бактерий использованы ферментационные комплексы Института биофизики СО РАН.
В качестве основного ферментационного оборудования использовали:
- термостатируемые качалки на 10 и 20 посадочных мест;
- магнитные мешалки типа ММ-5 мощностью 150 Вт;
- ферментёры с турбинными и лопастными мешалками V - 0.01 0.075м3;
-BioFlo 110, ферментёр зарубежного производства. Термостатируемая качалка (рисунок 2.1) состояла из корпуса, платформы, на которой размещались стеклянные колбы, электродвигателя марки 2У4, лабораторного автотрансформатора регулировочного типа ЛАТР 2М для регулирования числа оборотов, вала и маховика, расположенного эксцентрично к оси вала. Для поддержания температуры применялась горелка фирмы STEGO и термостат марки SK310. При варьировании кинетической энергии маховика изменяя плечо г (см. рисунок 2.1) от 0.07 до 0.12 м, а также массу маховика от 0.12 до 0.25 кг.
Гидродинамические параметры биореакторов с турбинной и лопастной мешалками
Большинство аэробных биотехнологических процессов, как правило, лимитированы по кислороду. Это определяет значимость газо-динамических параметров процесса ферментации и делает исследования массообменных характеристик аппаратов одним из первоочередных.
Полученные в ходе исследования опытные величины газосодержания в зависимости от числа оборотов, скорости газа и уровня жидкости в аппарате с лопастной мешалкой представлены на рисунке 3.1, Как установлено, изменение числа оборотов мешалки до 400 об/мин или скорости газа до 0.004 м/с при прочих равных условиях оказывает несущественное влияние на величину газосодержания р. Газосодержание при умеренных нагрузках пропорционально мощности на перемешивание р и скорости газа (р и6, что согласуется с работами [79-89]. Влияние физических параметров среды на величину газосодержания учитывается [85] следующим комплексом fp ґ \0.25
Экспериментальные данные по газосодержанию в аппаратах с лопастной мешалкой при п 400 об/мин и скорости газа щ 0.004 м/с \ 0.25 где ) - газосодержание;
TV - мощность на перемешивание, Вт; V- рабочий объем биореактора, м3; Н- уровень жидкости в аппарате, м; D - внутренний диаметр корпуса аппарата, м; иг - средне расходная скорость газа, м/с; р - плотность суспензии, кг/м ;
ц - коэффициент динамической вязкости суспензии, Пас; 7- поверхностное натяжение жидкости Н/м. Динамика изменения газосодержания в биореакторе с культуральной жидкостью в зависимости от концентрации бактерий (5 - 80) кг/м3 и числа оборотов лопастной мешалки представлена на рисунке 3.2. Получено удовлетворительное согласование расчетных значений (р (точки, рисунке 3.2) с экспериментальными (линии, рисунке 3.2).
