Содержание к диссертации
Введение
1. Векторы дрожжей в изучении организации решшкативного аппарата у дрожжей-сахаромицетов 9
1.1. Векторы дрожжей-сахаромицетов 10
I.I.I. Интегративные векторы ......... 10
I.I.2s. Векторы, способные к автономной репликации 14
1.1.2.1. Векторы эпиеомного типа .... 14
1.1.2.2. Репликативные векторы 15
1.1.2.3. Центромер-содержащие векторы 17
1.1.2.4. Линейные векторы 18
I.I.3. Проблема определения копийности автономно-реплицирующихся векторов дрожжей . . 19
1.2. Организация последовательностей ДНК у дрожжей,
функционально значимых для репликации . .... 22
1.2.1. Свойства хромосомных репликаторов дрожжей » ....22
1.2.2. Репликатор плазмидной омикронной ДНК 27
1.2.3. Центромерные последовательности хромосом дрожжей ..............29
1.3. Заключение. Постановка задачи исследования 35
Экспериментальная часть
2. Материалы и методы 36
2.1. Штаммы микроорганизмов ......36
2.2. Среды и условия культивирования микроорганизмов 39
2.3. Генетический анализ штаммов дрожжей ...... 40
2.4. Выделение ДНК 40
2.4.1. Выделение бактериальных плазмид ... 40
2.4.2. Выделение плазмидной ДНК из дрожжей 41
2.4.3. Выделение общей ДНК из дрожжей . .... 42
2.5. Анализ ДНК 43
2.5.1. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции . 43
2.5.2. .Цитирование фрагментов ДНК с помощью ДНК-лигазы фага Т4 . . . . 45
2.5.3. Разделение фрагментов ДНК в агарозном геле 46
2.6. Генетическая трансформация .....46
2.6.1. Трансформация бактерий 47
2.6.2. Трансформация дрожжей . 47
2.6.2.1. Трансформация дрожжей с использованием сферопластов . . 47
2.6.2.2. Трансформация дрожжей с использованием интактных клеток ... 49
2.6.3. Определение митотической стабильности гибридных плазмид ........... 50
3. Результаты исследований 51
3.1. Конструирование гибридных центромерннх плазмид, несущих различные репликаторы дрожжей . .... 51
3.1.1. Конструирование плазмиды Yip-СЕЫЗ t содержащей хромосомный репликатор арпЗ 51
3.1.2. Конструирование плазмиды YEP-CEN3 , содержащей репликатор омикронной ДНК ... 54
3.2. Митотическая стабильность гибридных центромерннх плазмид в различных штаммах дрожжей ... 57
3.3. Определение числа копий центромерннх плазмид в трансформированной клетке дрожжей . . . . . . 60
3.4. Генетическое исследование признака стабильного поддержания центромерной плазмиды Rcp-СЕЫЗ , несущей репликатор рДНК, в штамме ІА-Д38І2 . . 62
3.5. Исследование поведения гибридной плазмиды, несущей репликатор рДНК у моносомиков по хромосоме Г 63
3.6. Математическая модель, описывающая потерю центромерннх плазмид при нитотических делениях трансформантов дрожжей 65
3»7. Конструирование двурепликаторных центромерннх плазмид и изучение их свойств . 69
3.7.1. Конструирование плазмид, содержащих два репликатора рДНК дрожжей 69
З»7.2. Конструирование илазмиды, несущей тандемную дупликацию хромосомного репликатора 72
3.7.3. Митотическая стабильность центромерных плазмид, содержащих два репликатора
рДНК 72
3.7.4. Митотическая стабильность центромерной плазмиды, содержащей два хромосомных репликатора арп I ........... 77
3.7.5. Генетический анализ трансформантов дрожжей, содержащих двурешшкаторные центро-мерные плазмиды ............ 77
3.8. Изучение клеточного контроля функции центромер-ного локуса GEN3 у дрожжей ......... 81
3.8.1. Отбор мутанта с нестабильным поддержали-» ем центромерных плазмид ........ 82
3.8.2. Генетический анализ признака пониженной митотической стабильности центромерных плазмид в штамме P2-GRFIS/I 84
3.8.3. Митотическая стабильность хромосом у мутанта P2-GRF18/1 ...........84
4. Обсуждение полученных результатов ..88
4.1. Использование гибридных центромерных плазмид для изучения свойств хромосомных репликаторов дрожжей ... ................. 88
4.2. Проблема создания амплифипибельных векторов у дрожжей .................... 93
4.3. Нестабильность центромерных векторов и их кольцевая структура ................ 95
4.4. Изучение работы центромерных локусов дрожжей с использованием гибридных плазмид 97
Выводы .....100
литературный указатель 103
- Векторы дрожжей-сахаромицетов
- Штаммы микроорганизмов
- Конструирование гибридных центромерннх плазмид, несущих различные репликаторы дрожжей
- Использование гибридных центромерных плазмид для изучения свойств хромосомных репликаторов дрожжей ...
Введение к работе
Пекарские дрожжи-сахаромицеты относятся к группе наиболее хорошо изученных эукариотических объектов. В настоящее время у дрожжей охарактеризовано более 200 генетических локу-сов на хромосомах и достаточно полно изучена организация метаболических путей /127/. Как известно, дрожжи-сахаромицеты явля*» щтся одним из классических объектов исследования биохимических процессов.
Прогресс исследований дрожжей последних лет связан с разработкой на этом объекте новых методов молекулярного клонирования. Результаты, полученные при использовании новых методов, значительно расширили наши представления об организации генома у высших. Методы молекулярного клонирования на дрожжах открыли также путь использования дрожжей для решения некоторых прикладных вопросов * производства биологически активных полипептидов и противовирусных вакцин. Использование дрожжей для создания штаммов-продуцентов практически важных полипептидов, по сравнению с бактериями, в частности е.соіі , имеет два важных преимущества. Прежде всего дрожжи-сахаромицеты не патогенны для человека. Не менее важно, что дрожжи - это объект, освоенный микробиологической промышленносты).
Генно-инженерные эксперименты на дрожжах проводят с исполь*-зованием специально сконструированных гибридных плазмид-векто-ров, функция которых заключается в переносе интересующих нас генов в реципиентные клетки дрожжей. К настоящему времени создана целая серия векторов, имеющих в целом сходную схему организации. Шенно с использованием таких векторов удалось создать штаммы дрожжей - продуценты интерферонов человека /85/, соматотропного гормона /85/ и белка вируса оболочки гепатита В чело- века, необходимого для получения вакцин /126/.
Несмотря на большие достижения в разработке методов молекулярного клонирования на клетках дрожжей проблема переноса генов в дрожжевую клетку не является окончательно решенной. Главным недостатком векторов, используемых для трансформации дрожжей является их высокая нестабильность. Самые стабильные векторы дрожжей, сконструированные на основе центромерных локусов хромосом, утрачиваются трансформированной клеткой с частотой 3-5 % на клеточную генерацию /43/. Это означает, что при культивировании трансформантов в неселективных условиях в течение 20-30 генераций доля клеток, сохранивших вектор, будет составлять в популяции всего лишь несколько процентов. Для сравнения можно отметить, что векторы у E.coli утрачиваются с частотой 10-10 /17, 133/, таким образом их стабильность выше более чем на 4-5 порядков стабильности векторов дрожжей.
Цель настоящего исследования - проанализировать основные причины нестабильности векторов у дрожжей-сахаромицетов и попытаться найти возможные пути для стабилизации векторов.
Актуальность исследования проблемы нестабильности векторов у дрожжей диктуется тем, что к настоящему времени в литературе не имеется исследований, посвященных изучению причин митотической нестабильности векторов у дрожжей.
Научная новизна. В работе впервые показано, что основная причина утраты клеткой дрожжей автономнореплицирующихся векторов связана с неупорядоченной сегрегацией. Установлено также, что векторы репликативного типа могут утрачиваться клеткой вследствие дефекта репликации. Впервые в настоящей работе продемонстрировано существование в геноме эукариот генов, контро- лирущих распределительную функцию центромеров* Шказано также, что стабильность вектора может определяться особенностями клетки реципиента*
Практическая значимость* Сконструированные в настоящей работе векторы дрожжей могут быть использованы для клонирования в клетках дрожжей-сахаромицетов различных генов, в частности, генов, контролирующих биологически активные полипептиды, имеющие практическое значение*
Разработанные в настоящей работе методы открывают новые пути для исследования фундаментальных проблем - изучение механизмов репликации и сегрегации хромосом у эукариот.
Векторы дрожжей-сахаромицетов
Схема типичного интегративного вектора представлена на рис.1а. Интегративный вектор состоит из бактериальной плазми-да, обеспечивающей его поддержание в клетках Е.СОІІ И селектируемого маркера /З, ЗІ/. В качестве селектируемого маркера используются проклонированные индивидуальные гены дрожжей, имеющие фенотиішческое проявление. Наиболее часто в качестве селектируемых маркеров используются гены дрожжей, способные к экспрессии в клетках Е.соіі.
Так,, например, ген LEU2 дрожжей, кодирующий jB-изопро-пилмалатдегидрогеназу, комплементирует мутацию іеив у Е.СОІІ /147/. Ген ні S3 дрожжей, кодирующий имидазолглицерофосфатде-гидратазу, комплементирует ротацию hisB у Е.СОІІ/ЮО/ И Т.Д. В таблице I приведен список генов дрожжей-сахаромицетов, фрнк-нионально экспрессирующихся в клетках Е.СОІІ ЭТИ гены наиболее часто используют для маркировки векторов дрожжей. Все указанные в таблице I гены не содержат интронов и, как было показано, их экспрессия в клетках Е.СОІІ контролируется с промоторов бактериальной плазмиды /186, 118/.
Штаммы микроорганизмов
В работе ИСПОЛЬЗОВалИ следующие ШТаММЫ Дрожжей Saccharomyces cerevisiae: А62-ІГ-ПІ88, ІА-П38І2, GRP18 и DC5 , а также их производные,несущие неревертирующую мутацию по гену LEU2 . Два первых штамма были получены из Петергофской генетической коллекции. Штаммы DC5 HGRP18 происходят из американских генетических коллекций. Генотипы используемых штаммов дрожжей даны в таблице 2.
Бесплазмидный вариант штамма DC5 был получен по методу, предложенному Эрхартом и Холенбергом, основанному на вытеснении оДНК гибридной плазмидой, несущей репликатор оДНК /58/.
В экспериментах по клонированию фрагментов ДНК использовали штамм НВІ0ІЕ.СОІІ ( p ieuBthi lao pro recA endi rj mj ) /33/. Мутация leuBB ЭТОМ ШТаММе КОМПЛемеНТИруеТСЯ ГЄНОМ ДрОЖЖеЙ LEU2
/147/. Кроме того мы использовали бактериальные штаммы, несущие плазмиды PBR322 /29/, PBR325 /28, 146/, плазмиду YEp13 /36/ (схема этой плазмиды, содержащей ген LEU2 дрожжей и фрагмент оДНК дана на рис.6), плазмиду pYe(CEN3)4i /43/ (схема этой плазмиды, несущей центромерный локус хромосомы ТІЇ, дана на том же рис.6)и плазмиду Rcp2i/n /9/ (схема этой плазмиды, содержащей репликатор рДНК, дана на рис.6).
Конструирование гибридных центромерннх плазмид, несущих различные репликаторы дрожжей
Для изучения особенностей репликаторов дрожжей МЫ ИСПОЛЬЗО-вали несколько гибридных плазмид, объединяющих данные репликато ры с центромерным локусом СЕИЗ , выделенным Кларк и Карбоном из хромосомы Ш дрожжей /43/. Две плазмиды: плазмида рУе(сшз)41, несущая репликатор арп I, и плазмида Rcp-СЕЫз , несущая репликатор арп рДНК, были сконструированы ранее /43, 10/ (рис 7), Вами были сконструированы две новые центромернне плазмиды YIP-СЕИЗ и YEp-CEN3 , несущие хромосомный репликатор арп 3 /43/ и репликатор оДНК /37/ соответственно. Все гибридные плазмиды были маркированы геном LEU2 дрожжей, выделенным в составе Psti -фрагмента длиной 4,3 кв /36/..
Конструирование плазмиды Yip-СЕііз , содержащей репликатор арп 3,
Источником для конструирования плазмиды Yip-свиз послужили две гибридные плазмиды їірі /9/ и плазмида pYe(cEN3)4i /43/. Плазмида їірі представляет собой интегративный вектор, состоящий из бактериальной плазмиды pBR 325 со встроенным в нее Pst -фрагментом, несущим ген ЬЕЇЇ2 дрожжей. Схема вектора ірі дана на рис 7.
Использование гибридных центромерных плазмид для изучения свойств хромосомных репликаторов дрожжей
В экспериментах по генной инженерии на дрожжах используется большой набор сконструированных гибридных векторов. Общим признаком векторов у дрожжей, отличающих их от аналогичных векторов у бактерий, является их высокая митотическая нестабильность, достигающая нескольких десятков процентов на генерацию (см.разд.1.1.2).
Утрата автономно-реплицирующихся векторов дрожжей при клеточных делениях может происходить либо за счет дефекта их репликации, либо за счет их неупорядоченной сегрегации.
В настоящем исследовании мы предлагаем новый метод исследования репликации плазмид, содержащих различные репликаторы дрожжей, основанный на сравнении митотической стабильности производных этих плазмид, несущих центромерную последовательность. Объединение центромерной последовательности с репликатором в составе плазмиды обеспечивает упорядоченную сегрегацию плазмиды при клеточных делениях. Ошибка работы данной центромерной последовательности, включенной в состав автономно реплицирующихся плазмид, несущих различные репликаторы, очевидно, должна быть одинакова для всех плазмид. Таким образом, если две центромерсодержащие плазмиды, несущие различные репликаторы, имеют различную митоти-ческую стабильность, это различие будет определяться включенным в состав плазмиды репликатором.
Мы установили, что четыре исследованных нами репликатора дрожжей: репликатор рДЖ, репликатор оДНК и хромосомные репликаторы арп I и арп 3 - обеспечивают различную митотическую стабильность центромерных плазмид (табл.3). Наибольшая митотическая стабильность зарегистрирована для центромерных плазмид, содержащих репликатор арп I, наименьшая для репликатора арп 3 (более 90 % и менее 5 % соответственно). Митотическая стабильность центромерных плазмид, несущих два других дрожжевых репликатора, репликатор оДНК и репликатор рибосомальной ДЖ дрожжей, соответствовала промежуточному значению для репликаторов арп I и арп 3 ( 20 % для репликатора рДНК и около 80 % для репликатора оДНК). Все сконструированные центромерные плазмиды, судя по данным генетического анализа, поддерживались в трансформированной клетке в числе одной копии (табл.4). Это означает, что повторного раунда репликации этих центромерных плазмид в пределах одного периода не происходит. Очевидно, что это наиболее общее свойство всех хромосомных репликаторов дрожжей арантирующее сбалансиро-ванную репликацию хромосом дрожжей.
