Введение к работе
Актуальность проблемы. Одна из наиболее перспективных задач современной биотехнологии - создание биокатализаторов на основе иммобилизованных ферментов. Преимущество иммобилизованных ферментов перед растворимыми заключается в большей их стабильности, возможности регенерирования и отделения иммобилизованного фермента от продукта реакции. В качестве таких катализаторов могут использоваться ферменты, включенные в пленочные покрытия.
Современные тенденции при разработке композиционных материалов, как основы для иммобилизации, состоят в придании им ряда положительных свойств: способность подвергаться разложению в естественных условиях среды, низкий уровень неспецифических взаимодействий с примесями и биологически активными веществами, механическая устойчивость, наличие функциональных групп, пригодных для селективной химической модификации; экологическая чистота процесса получения (Новиченко А.Н., Новикова Т.П., Зеленко И.Н., Мазолевский Д.М., Бондаренко А.П., ).
Очевидно, что применение научных подходов, направленных на создание данных материалов с заранее заданными свойствами и функциями на основе иммобилизованных биологических лигандов (ферментов, микробных клеток, антител и нуклеотидов), может способствовать их использованию в медицине, биохимии, фармакологии.
Работы по биоразлагаемым материалам актуальны и востребованы, о чем свидетельствует проведение первой Международной конференции по биоразлагающимся полимерам и соответствующим композитам (Дербишер В.Е., Гермашев И.В., Дербишер Е.В., 2008; Заиков Г.Е., Арцис М.И., 2008; Т.Л., Бирюков А.Л., П.Д., 2008; А.Г., З.А., Рыбкин С.В., О.В., 2008).
Технологии создания композиционных материалов включают в себя ряд открытий последних лет в области химии и физики высокомолекулярных систем и структур (Володькин Д.В, 2005; Тулинов А.Б., Корнеев А.А., Овчаренко Л.В., Гармаш И.И., ; Андрианова Г.П., ; Буниятзаде И.А., Мамедов Г.Г., Азизов А.А., Алосманов Р.М., Магеррамов А.М., 2010; Межиковский С.М., ; Олтаржевская Н.Д., Коровина М.А., ).
Включение ферментов в структуру природных биоразлагаемых полимеров продиктовано необходимостью создания лекарственных повязок нового поколения с регулируемым сроком службы и высоким процентом сохранения активности биологической субстанции (Чернобаева М.В., Салим Хусам, Скатков С.А., Демина Н.Б., ). В отличие от обычных сорбционных перевязочных средств (марлевых, ватно-марлевых, нетканых материалов, полимерных губок), у которых устанавливается динамическое равновесие концентрации микрофлоры на границе «повязка-рана», биологически активные гелевые повязки обеспечивают пластифицирующее воздействие на ткани раны, размягчают некротические образования, диффундируют под них, облегчая механическое удаление нежизнеспособных тканей, и предотвращая развитие инфекции под струпом (Юданова Т.Н., 2004).
В последние два десятилетия отмечается неуклонное увеличение доли острых гнойно-воспалительных заболеваний. Это связано в основном с неудовлетворительным состоянием экологии во многих регионах, низким социально-экономическим уровнем жизни значительной части населения, со снижением факторов неспецифической противомикробной резистентности, с развитием интегральных гормонально-метаболических нарушений в организме на фоне хронических соматических болезней (Легонькова О.А, ; Шавырин В.А., Квасенков О.И., ; Ухарцева И.Ю., ).
На сегодняшний день, параллельно с применением антибиотиков, возрастает число антибиотикорезистентных штаммов бактерий, частота и тяжесть инфекционных осложнений. Таким образом, очевидно, что, несмотря на все достижения современной медицины, инфекция не без основания остается «камнем преткновения» в лечении различных ран. Возникает необходимость в создании принципиально новых препаратов при их лечении.
Альтернативным решением данных проблем могут выступать препараты системной энзимотерапии, относящиеся к группе гидролаз и представленные высокоочищенными протеиназами животного и растительного происхождения, а также фиксированные на различных раневых покрытиях ферментные препараты для местного лечения ран (Ефименко Н.А., 2005).
Цель диссертационной работы: стабилизация биологически активных соединений посредством включения их в структуру природных биоразлагаемых полимерных материалов.
Основные задачи исследования:
-
Синтезировать биоразлагаемые пленочные материалы на основе высокомолекулярного природного полисахарида, белкового комплекса и пластификатора.
-
Исследовать свойства полученного пленочного материала (спектры поглощения в УФ - области, предел прочности, влагоёмкость).
-
Разработать метод иммобилизации фермента – гиалуронидазы и исследовать влияние различных факторов (рН среды, температуры) на его активность. Изучить кинетику ферментативной реакции, динамику потери удельной активности при хранении в различных температурных условиях.
-
Иммобилизовать фермент трипсин в пленочные материалы и исследовать влияние некоторых факторов на его активность (рН среды, температуры, количества субстрата), изучить влияние времени постановки реакции, динамику потери удельной активности при хранении в различных температурных условиях.
-
Разработать метод иммобилизации лизоцима и исследовать влияние рН среды, температуры, времени постановки ферментативной реакции и длительности хранения в различных температурных условиях на его активность.
-
Провести апробацию биоразлагаемых материалов с иммобилизованным трипсином на экспериментальных животных.
Научная новизна работы. Впервые получены принципиально новые пленочные материалы, подвергающиеся биодеградации в естественных условиях. Подобран оптимальный состав для получения биоразлагаемых пленок, обладающих следующими преимуществами: прозрачность, пластичность, прочность структуры при разрывном напряжении. Проведена иммобилизация ферментных препаратов в структуру биоразлагаемых пленочных материалов с высоким сохранением удельной активности. Установлены факторы, влияющие на ее снижение. Впервые получены пленочные покрытия с иммобилизованными ферментами – гиалуронидазой, трипсином, лизоцимом, которые могут быть использованы в качестве раневых покрытий в медицине и косметологии. Приоритетность выполненных исследований подтверждена патентом РФ на изобретение.
Теоретическая и практическая значимость работы. Впервые получены биоразлагаемые пленочные материалы с иммобилизованными в их структуру ферментами, способствующими процессу ранозаживления. Разработаны методические приёмы по определению активности ферментов – гиалуронидазы и лизоцима по прототипу определения амилазной активности слюны. Упрощена методика определения активности лизоцима относительно ранее известной. Разработаны технологические основы получения пленочных материалов, обладающих ферментативным действием. Материалы диссертации используются в лекциях и практических занятиях на курсах «Высокомолекулярные соединения» (Лекция «Биоразлагаемые полимерные материалы как основа для иммобилизации фермента»), «Введение в нанотехнологии» (Лекция «Структура и свойства наноматериалов») ФГБОУ ВПО СГУ. В лаборатории микробиотехнологии Научно-образовательного центра «Технологии живых систем и биологические материалы» проведены испытания биодеградируемых пленок (протокол от 28 марта 2008 г.).
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Научно-методические подходы к получению биоразлагаемых полимерных материалов.
2. Методы иммобилизации ферментов в структуру пленочных покрытий.
3. Свойства полученных биодеградируемых пленок и раневых покрытий на основе иммобилизованных ферментов.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены, обсуждены и опубликованы в материалах Московской международной конференции «Мир биотехнологии» (Москва, 2008), XX симпозиуме «Современная химическая физика» (Туапсе, 2008), V съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2008), Московской международной конференции «Мир биотехнологии» (Москва, 2009), V ежегодной научной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр южного научного центра РАН (Ростов-на-Дону, 2009), 54 научно-практической конференции «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2009), 55 научно-практической конференции «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2010), (Ростов-на-Дону, 2011), 56 научно-практической конференции «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2011).
Апробация диссертации состоялась 14 сентября 2011 г. на расширенном заседании кафедры биологической и медицинской химии ФГБОУ ВПО СГУ и базовой кафедры «Технологии живых систем и биологические материалы» ЮНЦ РАН.
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена самостоятельно. Отдельные этапы работы были выполнены совместно с кандидатом биологических наук Воробьевой О.В., аспирантом Ивановой А.М. (ФГБОУ ВПО СГУ).
Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 14 опубликованных научных работах, три из которых опубликованы в журналах, рекомендуемых «Перечнем ВАК», имеется 1 патент РФ на изобретение.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 133 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, двух глав собственных исследований, заключения, выводов и приложения; иллюстрирована 14 таблицами и 33 рисунками. Список литературы включает 148 отечественных и зарубежных литературных источников.
