Содержание к диссертации
Введение
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Микрофлора зерна 9
1.1.1 Классификация и характеристика 9
1.1.2 Пути проникновения микроорганизмов в зерновую массу 14
1.1.3 Влияние микроорганизмов на качество зерна 15
1.2 Способы снижения микробной обсемененности зернового сырья 19
1.2.1 Механические способы 19
1.2.2 Физические способы 20
1.2.3 Обработка соединениями антимикробного и микробостатического действия 24
1.3 Водно-тепловая обработка крахмалсодержащего сырья в технологии этилового спирта 28
1.4 Микробная контаминация в спиртовой промышленности 31
1.4.1 Микроорганизмы контаминанты 31
1.4.2 Меры предотвращающие развитие микроорганизмов в бродильных производствах 38
1.5 Летучие органические соединения 45
1.5.1 Образование основных групп летучих органических соединений, сопутствующих спирту 45
1.5.2 Летучие органические соединения, образуемые микроорганизмами контаминантами спиртового производства 57
1.6 Пероксид водорода 64
1.6.1 Антимикробные свойства 64
1.6.2 Применение в пищевой промышленности 67
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 69
2.1 Материалы исследования 69
2.2 Обработка зерна пероксидом водорода 71
2.3 Получение спирта в лабораторных условиях 72
2.4 Получение спирта на пилотной установке 73
2.5 Методы исследования 75
2.5.1 Физико-химические методы 75
2.5.2 Микробиологические методы 76
2.5.3 Хроматографические методы 78
2.5.4 Статистическая обработка результатов экспериментов 80
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 81
3.1 Характеристика микрофлоры зернового сырья 81
3.1.1 Уровень обсемененности зерна поверхностной и внутренней микрофлорой 81
3.1.2 Анализ родового состава сообщества микромицетов зерна 83
3.2 Применение пероксида водорода для обработки зернового сырья в технологии этилового спирта 85
3.2.1 Влияние растворов пероксида водорода и перманганата калия на микрофлору зерна 85
3.2.2 Влияние пероксида водорода на содержание спирторастворимых углеводов в зерне 93
3.2.3 Влияние антимикробной обработки цельного зерна на основные показатели производства спирта 94
3.3 Применение пероксида водорода для обработки зернового замеса на стадии разваривания 102
3.3.1 Антимикробное действие пероксида водорода вносимого на стадии разваривания 102
3.3.2 Влияние антимикробной обработки на изменение кислотности сусла в процессе брожения 109
3.3.3 Влияние антимикробной обработки на содержание несброженных углеводов в зрелых бражках 122
3.3.4 Влияние пероксида водорода на содержание нерастворенного крахмала в зрелых бражках 127
3.3.5 Влияние антимикробной обработки зернового замеса пероксидом водорода на содержание примесей в зрелых бражках 129
3.3.6 Влияние антимикробной обработки на содержание этилового спирта в зрелых бражках 132
ВЫВОДЫ 141
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 142
Введение к работе
Актуальность работы. На современном этапе развития научно-
технической базы спиртовой отрасли активно внедряются способы механико-
ферментативной обработки сырья, исключающие стадию
высокотемпературного разваривания зерна под давлением [1]. Данные
способы позволяют снизить расход теплоресурсов, упростить аппаратное
оформление процесса, уменьшить потери сбраживаемых веществ и улучшить
качество спирта [2].
При применении, низкотемпературного разваривания сырья необходим строгий контроль микробиологических параметров [3-6]. Микроорганизмы-контаминанты утилизируют питательные вещества сусла и образуют метаболиты, токсичные для дрожжей, в результате чего происходит снижение выхода спирта и ухудшение его качества [1,3-11].
Основной причиной микробной контаминации в технологии спирта является недостаточная очистка зернового сырья [3,12,13]. При использовании низкотемпературной схемы разваривания посторонние микроорганизмы сохраняют свою жизнеспособность. В связи с этим актуальным является поиск новых способов обеззараживания сырья в спиртовом производстве.
Для борьбы с микробной контаминацией в спиртовой промышленности применяются различные методы: использование антибиотиков [7-9,14-16]; ультразвукового [4], инфракрасного [6,17] и гамма-излучений [18]. Недостатками этих способов является высокая стоимость антибиотиков и вероятность появления антибиотикорезистентных штаммов бактерий [19]; усложнение технологической схемы, низкая производительность дезинфицирующих установок.
Распространенным способом антимикробной обработки является химическая дезинфекция. В пищевой промышленности в этих целях применяется соединение окислительного действия - пероксид водорода.
7 Пероксид водорода обладает бактерицидным и фунгицидным
действиями и не загрязняет обрабатываемые материалы продуктами своего
разложения [20,21].
Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы заключалась в
повышении выхода и улучшении качества пищевого этанола путем
дезинфекции зернового сырья и полупродуктов спиртового производства
пероксидом водорода.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
- выбор условий антимикробной обработки зернового сырья
пероксидом водорода;
определение влияния пероксида водорода, добавляемого на стадии подготовки сырья, на качественные показатели полупродуктов спиртового производства и выход этилового спирта;
исследование влияния пероксида водорода, вносимого на этапе тепловой гидродинамической ферментативной обработки зернового замеса, на микробную контаминацию полупродуктов;
изучение влияния процесса обеззараживания зернового замеса на показатели спиртового брожения, выход и качество этилового спирта;
- разработка принципиальных технологических схем применения
пероксида водорода с целью снижения микробной контаминации в
технологии этилового спирта
Научная новизна. Исследовано влияние пероксида водорода на микробную контаминацию разваренной массы в производстве пищевого этилового спирта. Впервые предложен способ антимикробной обработки зернового замеса пероксидом водорода на стадии разваривания, позволяющий отказаться от термической стерилизации.
Установлено, что подавление пероксидом водорода посторонних микроорганизмов приводит к ингибированию образования органических кислот, которые в ходе брожения негативно действуют на дрожжи.
Научно обосновано положительное влияние пероксида водорода на
8 содержание в зрелых бражках несброженных углеводов, нерастворенного крахмала, а также выход этилового спирта.
Методами хромато-масс-спектрального и газохроматографического анализов установлено, что в результате обработки зернового замеса пероксидом водорода наблюдается снижение содержания примесей в бражном дистилляте, что приводит к улучшению качества этилового спирта.
Практическая значимость. Предложены принципиальные схемы получения этилового спирта, предусматривающие дезинфекцию зернового сырья или разваренной массы растворами пероксида водорода.
Разработаны технологические основы производства этилового спирта из крахмалсодержащего сырья с антимикробной обработкой зернового замеса пероксидом водорода на заключительном этапе стадии разваривания.
Применение пероксида водорода на стадии разваривания позволит перейти на более прогрессивные с точки зрения экономии энергоресурсов «мягкие» режимы тепловой гидродинамической ферментативной обработки зерновых замесов, и отказаться от обязательной в подобных случаях тепловой стерилизации при 105 С.
Применение растворов пероксида водорода для обеззараживания сырья и полупродуктов на различных этапах производства спирта позволит: эффективно предотвращать развитие посторонней микрофлоры, сократить уровень прямых и косвенных потерь углеводсодержащего сырья, снизить риски при переработке дефектного сырья, повысить выход спирта и его качество.
Микрофлора зерна
Зерно является благоприятным субстратом для развития микроорганизмов. Микрофлора зерна отличается большим разнообразием, однако, как правило, одновременно в отдельной партии преобладает ограниченное число видов микроорганизмов [22-24]. В состав микрофлоры зерна входят бактерии, мицелиальные грибы, актиномицеты и дрожжи [22,24-28].
Бактерии - наиболее многочисленная группа микроорганизмов зерна, по разным данным количество бактерий в одном грамме зерновой массы колеблется в пределах 10 -4-Ю колониеобразующих единиц (КОЕ) [22,25]. Микробная обсемененность зерна, при хранении которого были допущены нарушения составила 3,2-10 КОЕ/г, в том числе Bacillus subtilis 4,2-10 КОЕ/г [29]. На свежеубранном зерне часто обнаруживают бактерии родов Flavobacterium, Micrococcus, Lactobacillus, Bacillus, Clostridium, Alcaligenes [23], Xanihomonas (X. phaseolivar. saiense, X. campestris) [24]. Преобладают, как правило, грамотрицательные виды бактерий Erwinia herbicola, Pseudomonas fluorescens - до 90 % от общей численности [22,24]. В условиях повышенной влажности бактерии довольно быстро проникают внутрь зерна [28]. При правильно проведенной сушке и соблюдении условий хранения в составе микрофлоры зерна начинают доминировать грамположительные бактерии, так как грамотрицательные бактерии в силу строения клеточной стенки менее стойки к обезвоживанию, легче отдают влагу и гибнут [22]. Так, среди бактерий хранящегося ячменя было выявлено 13 таксонов в основном грамположительные бактерии: Aureobacterium flavescens, Bacillus spp., Brevibacterium linens, Corynebacterium spp., Clavibacterium iranicum, Microbacterium imperiale, Oerskovia xanthineolytica. Наиболее часто встречались виды Corynebacterium spp. (18 % от общего количества) [24]. Сообщается также, что от 1,6 до 20 % жизнеспособных бактерий хранящегося ячменя относилось к семейству Enterobacteriaceae, преобладали виды, типично связанные с растительными тканями: Enterobacter agglomerans, Serratia odorifera, а содержание молочнокислых бактерий, таких как Lactococcus lactis, Lactobacillus coprophilus, Lb. plantarum, Leuconostoc mesenteroides составляло менее 0,01 % [24].
Мицелиальные грибы - вторая по численности составляющая микрофлоры зерна. Один грамм зерновой массы может содержать от нескольких сотен до нескольких десятков тысяч спор грибов [22,26]. Грибы считаются основной причиной порчи продовольственного зерна в мире [27]. В зависимости от условий, при которых возможна контаминация зерна, т.е. с экологической точки зрения грибы принято разделять на две группы: полевые грибы и плесени хранения [22,23,26,27].
Полевые грибы контаминируют и инфицируют зерно в поле во время его формирования и созревания [23], как правило, они обладают пигментированным мицелием, что делает их устойчивыми к действию ультрафиолетового излучения Солнца [22]. Полевые грибы являются гидрофитами, для их развития необходимо, чтобы влажность зерна находилась в равновесии с относительной влажностью воздуха 90-95 %, т.е. влажность зерна должна составлять 30-33 % из расчета на сухое вещество [22,23,26,27]. Наиболее распространенные представители данной группы в составе микрофлоры зерна - несовершенные грибы родов Alternaria, Cladosporium, Fusarium, Bipolaris (Helmintosporium, Drechslera), Stemphylium, Trichoderma [22,23,26,27].
Материалы исследования
В работе исследовали влияние растворов пероксида водорода на уровень микробной обсемененности и физико-химические показатели зернового сырья и полупродуктов спиртового производства.
Объектами исследования являлись пшеница и рожь урожаев 2003 и 2004 годов и зерносмесь рожь - пшеница, (7:3), влажностью 12,5 %, крахмалистостью 57 %.
В качестве обеззараживающих веществ использовали пероксид водорода и перманганат калия.
Отбор проб и определение химического состава зерна проводили согласно методикам, принятым в спиртовом производстве [163,164]. Определение проводили в пяти параллельных пробах. Среднее арифметическое определений принимали за окончательный результат. Химический состав исследуемых партий пшеницы и ржи представлен в табл. 2.1.
Контролируемые параметры 1. Содержание крахмала; 2. Содержание спирторастворимых углеводов; 3. Содержание пентоз и пентозанов; 4. Влажность; 5. Микробная обсемененность; 6. Титруемая кислотность; 7. рН; 8. Содержание несброженных углеводов; 9. Содержание нерастворенного крахмала; 10. Содержание уксусной кислоты; И. Содержание молочной кислоты; 12. Содержание спирта; 13. Содержание примесей Рисунок 2.1 - Схема проведения исследований
В работе использовали следующие питательные среды, ферментные препараты, микроорганизмы и реагенты:
картофельно-глюкозный агар (КГА): 200 г очищенного и измельченного картофеля помещают віл водопроводной воды и варят после закипания в течение 30-40 минут, полученную суспензию отфильтровывают через ватно-марлевый фильтр, и доводят объем фильтрата до 1 л водопроводной водой, после этого добавляют 20 г глюкозы и 20 г агара, разливают по колбам и стерилизуют при 0,5 атм в течение 20 минут;
мясо-пептонный агар;
ферментный препарат а-амилаз - Амилосубтилин ГЗХ, активностью 1000 ед/г;
ферментный препарат термостабильных а-амилаз Термамил СЦ (Novozymes);
ферментный препарат целлюлаз - Шеарзим 500 Л (Novozymes);
ферментный препарат амилоглюкозидаз - САН Супер 240 Л, активностью 6000 ед/мл (Novozymes);
сухие дрожжи, промышленный штамм Saccharomyces cerevisiae -Allyeast superstart (Alltech. Inc. Nicholasville. Ky.) 22-25 млрд. клеток в 1 г;
пероксид водорода медицинский по ГОСТ 177-88 (Реахим);
перманганат калия по ГОСТ 20490-75 (Реахим);
карбамид (NH2)2CO;
фосфат аммония однозамещенный NH4H2PO4.
2 Обработка зерна пероксидом водорода
Исследуемое зерно обрабатывали растворами пероксида водорода концентрацией 0,5 %, 1 %, 3 % (масс) и перманганата калия концентрацией 0,05 %, 0,1 %, 0,5 % (масс). Соотношение зерно : раствор составляло 1:2. Обработку проводили в течение заданного времени. В контрольных вариантах зерна выдерживали в дистиллированной воде. Затем определяли уровень микробной обсемененности зерен поверхностной и внутренней микрофлорой.
Получение спирта в лабораторных условиях
При проведении антимикробной обработки на стадии подготовки сырья, зерно, очищенное от посторонних примесей и обработанное раствором пероксида водорода, размалывали на лабораторной мельнице так, чтобы весь помол проходил при просеивании через сито с ячейками диаметром 1 мм. Навеску измельченного зерна помещали в колбу, добавляли ферментный препарат Амилосубтилин ГЗХ из расчета 2 ед. препарата на 1 г условного крахмала, и смешивали с дистиллированной водой (соотношение зерно: вода- 1:3).
В том случае, когда антимикробная обработка проводилась на стадии подготовки сырья, при приготовлении зернового замеса учитывали количество воды, поглощенной зерном во время экспозиции в растворе пероксида водорода.
Разваривание проводили в термостатируемой водяной бане по механико-ферментативному способу. Режим разваривания представлен в табл. 2.2.
Характеристика микрофлоры зернового сырья
На свойства зерна при хранении и дальнейшей переработке значительное влияние оказывает уровень зараженности зерна микроорганизмами.
Содержание бактерий в 1 г зерновой массы может колебаться от 3-Ю3 до 4-Ю КОЕ и выше. В зависимости от условий, способа уборки и своевременности послеуборочной обработки зерна пшеницы зараженность внутренней микрофлорой, а именно мицелиальными грибами, колеблется в пределах от 20 до 100 % [22].
Экспериментальные данные по уровню микробной обсемененности исследуемых партий зерна представлены в табл. 3.1.
Как видно из представленных результатов, зерна, как пшеницы, так и ржи урожая 2004 года были сильно обсеменены микроорганизмами, а исследуемые образцы пшеницы и ржи урожая 2003 года характеризовались незначительной степенью зараженности поверхностной микрофлорой, что вероятно, связано с постепенным отмиранием неспоровых форм микроорганизмов при хранении [22,26,27]. В то же время контаминация зерен внутренней микрофлорой была на высоком уровне для всех исследованных образцов, в некоторых случаях у единичного зерна одновременно отмечались признаки как грибного, так и бактериального поражения (табл. 3.1).
В процессе хранения зерна микрофлора его изменяется: уменьшается или увеличивается общее количество микроорганизмов, изменяется их видовой состав [22,26,27]. С течением времени в зерновой массе начинают доминировать плесени хранения p. Penicillium, p. Aspergillus, р. Мисог, благодаря своей способности расти и размножаться в условиях, неблагоприятных для полевых грибов [22]. Отдельные представители рода Aspergillus являются ксерофитами и способны развиваться при влажности зерна ниже критической, в результате их метаболизма выделяется большое количество тепла и воды, что создает условия для развития гидрофильных микроорганизмов [22,26,27].
По преобладанию того или иного вида микроорганизмов можно судить о качестве зерна, условиях и продолжительности его хранения. Важным показателем, характеризующим технологические свойства и питательную ценность зернового сырья, является родовой состав микромицетов.
Высокий процент зерен, пораженных плесневыми грибами, в особенности представителями родов Penicillium, Aspergillus, Мисог, называемыми также - плесени хранения, может негативно сказаться на выходе и качестве спирта.
Плесени хранения в процессе своей жизнедеятельности синтезируют высокоактивные ферменты, снижают питательную ценность зерна и вызывают накопление низкомолекулярных продуктов распада белков, липидов и полисахаридов, неустойчивых к действию высоких температур. На стадии разваривания данные продукты вступают в реакции взаимодействия, разложения, конденсации с образованием различного рода соединений, [61,96,98] некоторые из них, такие как фурфурол, акролеин, пиразин и др. обнаруживаются в дальнейшем в составе примесей этилового спирта [12]. Продукты реакций меланоидинообразования и термической дегидратации углеводов адсорбируются на поверхности дрожжевых клеток, вызывая их гибель [1,172]. Кроме того, развитие плесневых грибов сопровождается выделением ими в среду микотоксинов также негативно влияющих на жизнедеятельность дрожжей [37-39].
