Регио- и стереоспецифическое гидроксилирование дегидроэпиандростерона в положении 7 мицелиальными грибами Лобастова Татьяна Геннадьевна

Содержание к диссертации

1. ВВЕДЕНИЕ 5

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11

2.1 Микробиологическое гидроксилирование стероидных соединений 12

1. 7(а/р)-гидроксилирование стероидных соединений мицелиальными 13 грибами

2. Дигидроксилирование стероидов в положения 7а и 15а 20 мицелиальными грибами

3. Функционализация кольца D мицелиальными грибами

2.2 Дегидроэпиандростерон и его производные

4. Дегидроэпиандростерон и его производные, их роль человека и животных

5. Гидроксилирование ДГЭА мицелиальными грибами

6. Способы получения дегидроэпиандростерона гидроксилированных производных

7. Получение ДГЭА

8. Химический синтез 7(а/р)-гидроксипроизводных ДГЭА

9. Преимущества микробиологического метода гидроксилированных стероидов.

2.2.4 Ферменты, катализирующие процессы гидроксилирования 32
дегидроэпиандростерона

2.3 Факторы, влияющие на процесс гидроксилирования стероидов 33
мицелиальными грибами

10. Влияние состава питательной среды 33

11. Влияние возраста культуры и величины биомассы 34

12. Влияние рН и температуры 34

13. Влияние способа внесения стероида в трансформационную среду 35

14. Индукция стероидных гидроксилаз 38

2.4 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 39

3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 40
3.1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 40

15. Реактивы 40

16. Микроорганизмы и их культивирование 40

17. Трансформация ДГЭА грибными культурами 40

18. Биоконверсия ДГЭА Fusarium graminearum F-159 в ростовых условиях 41

19. Биоконверсия ДГЭА Gibberella zeae ВКМ F-2600 41

20. Выращивание G. zeae ВКМ F-2600 и биоконверсия ДГЭА отмытым 41 мицелием

21. Выращивание G. zeae ВКМ F-2600 и биоконверсия ДГЭА в ростовых 42 условиях

22. Оптимизация условий 7а-гидроксилирования ДГЭА G. zeae ВКМ F- 42 2600

23. Трансформация ДГЭА G. zeae ВКМ F-2600 в ферментере АНКУМ 2М 44

6. Аналитические методы 44

7. Масс-спектрометрия 46

8. 'Н-ЯМР- и ¹³С-ЯМР спектроскопия 46

9. Химический синтез Зр-гидроксиандроста-5,7-диен-17-она (7-дегидро- 47 ДГЭА) из 7а-ОН-ДГЭА

1. Получение 0-Зр-трет-бутилдиметилсилилокси-7а-гидроксиандрост-5- 47 ен-17-она и его характеристика

2. Получение 0-ЗР-трет-бутилдиметилсилилокси-7а-хлор-андрост-5-ен- 47 17-она и и его характеристика

3. Получение о-Зр-гидроксиандроста-5,7-диен-17-она (7-дегидро-ДГЭА) 48

и его характеристика 3.1.9.4 Методы анализа стероидных соединений, полученных при химическом 49

синтезе

3.2 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 50

3.2.1 Трансформация ДГЭА мицелиальными грибами 50

4. 7а-Гидроксилирование ДГЭА 50

5. 7|3-Гидроксшіирование ДГЭА 54

6. 7<х,15а-Дигидроксилирование ДГЭА 56

3.2.2 Связь 7-гидроксилирования с сопутствующими реакциями 61
трансформации дегидроэпиандростерона: 17р-восстановлением,
окислением 3-гидроксигруппы и Д^5->4-изомеризацией, лактонизацией

по кольцу Д

3.2.3 Оптимизация процесса 7<х,15а-дигидроксилирования ДГЭА штаммом 76

F. graminearum F-159 в ростовых условиях

7. Особенности процесса 7а,15а-дигидроксилирования ДГЭА при 76 различных способах внесения субстрата

8. Биоконверсия ДГЭА штаммом F. graminearum F-159 в присутствии 78 МЦД

9. Влияние времени внесения субстрата на 7а,15а-дигидроксилирование 80 ДГЭА F. graminearum F-159

10. Трансформация ДГЭА штаммом F. graminearum F-159 в ферментёре 81 АНКУМ 2М

3.2.4 Химико-микробиологический синтез Зр-гидроксиандроста-5,7-диен- 84
17-онаизДГЭА

3.2.4.1 Оптимизация процесса получения 7а-ОН-ДГЭА из ДГЭА отмытым 85
мицелием G. zeae ВКМ F-2600

3.2.4.1.1 Влияние источников углерода и азота на 7а-гидроксилирование ДГЭА 86

G. zeae ВКМ F-2600

2. Зависимость 7а-гидроксилазной активности G zeae ВКМ F-2600 от 87 значения рН

3. Зависимость 7а-гидроксилазной активности G. zeae ВКМ F-2600 от 88 возраста и величины биомассы

4. 7а-Гидроксилирование ДГЭА G. zeae ВКМ F-2600 в средах с 91 органическими растворителями

5. Влияние ПАВ на 7а-гидроксилазную активность G. zeae ВКМ F-2600 92

6. Влияние концентрации субстрата на 7а-гидроксилирование ДГЭА G. 93 zeae ВКМ F-2600

7. Индукция 7а-гидроксилазной системы штамма G. zeae ВКМ F-2600 94

8. Трансформация ДГЭА штаммом G. zeae ВКМ F-2600 в присутствии 97 МЦД в ростовых условиях

9. Трансформация ДГЭА до 7а-ОН-ДГЭА штаммом G. zeae ВКМ F-2600 97 в ферментёре АНКУМ 2М

10. Химическая конверсия 7а-ОН-ДГЭА в 7-дегидро-ДГЭА 101

4. ВЫВОДЫ 104

5. СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 106

6. ПРИЛОЖЕНИЕ 1: Акт испытаний способа микробиологического дигидроксилирования Зр-гидроксиандрост-5-ен-17-она с образованием Зр,7а,15а-тригидроксиандрост-5-ен-17-она штаммом Fusarium graminearum F-159

7. ПРИЛОЖЕНИЕ 2: Акт испытаний способа микробиологического 7а-гидроксилирования Зр-гидроксиандрост-5-ен-17-она с образованием Зр,7а-дигидроксиандрост-5-ен-17-она культурой G. zeae ВКМ F-2600

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АД - андростендион (андрост-4-ен-3,17-дион)

АДД - андростадиендион (андроста-1,4-диен-3,17-дион)

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГЖХ - газо-жидкостная хроматография

ДГЭА - дегидроэпиандростерон (ЗР-гидроксиандрост-5-ен-17-он)

ДГЭАС - сульфат дегидроэпиандростерона

1а-ОН-ДГЭА-1а-гидроксидегидроэпиандростерон(1а,ЗР-дигидроксиандрост-5-ен-17-он)

7а-ОН-ДГЭА-7а-гидроксидегидроэпиандростерон(Зр,7а-дигидроксиандрост-5-ен-17-он)

7р-ОН-ДГЭА-7р-гидроксидегидроэпиандростерон(Зр,7р-дигидроксиандрост-5-ен-17-он)

7а,15а-ди-ОН-ДГЭА - 7аД5а-дигидроксидегидроэпиандростерон (Зр,7а,15а-

тригидроксиандрост-5-ен-17-он)

7-дегидро-ДГЭА - 7-ен-дегидроэпиандростерон (Зр-гидроксиандроста-5,7-диен-17-он)

11а-ОН-ДГЭА - 11а-гидроксидегидроэпиандростерон (ЗР,11а-дигидроксиандрост-5-ен-

17-он)

7р,11а-ди-ОН-ДГЭА-7РД la-дигидроксидегидроэпиандростерон (ЗР,7Р,11а-тригидрокси-

андрост-5-ен-17-он)

16а-ОН-ДГЭА - 16а-гидроксидегидроэпиандростерон (Зр,16а-дигидроксиандрост-5-ен-

17-он)

16а-ОН-АД - 1 ба-гидроксиандростендион (16а-гидроксиандрост-4-ен-3,17-дион)

ДМСО - диметилсульфоксид

ДМФА - диметилформамид

ДТ - 1(2)-дегидротестостерон (17р-гидроксиандроста-1,4-диен-3-он)

КССВ — константа спин-спинового взаимодействия

МЦД - метилированное производное р-циклодекстрина

МС - масс-спектрометрия

Т - тестостерон (17Р-гидроксиандрост-4-ен-3-он)

ТГФ - тетрагидрофуран

ТСХ - тонкослойная хроматография

ХФ - хлорамфеникол

ЦД - циклодекстрин

ЦГ - циклогексимид

ЯМР — ядерно-магнитный резонанс

Введение к работе

Актуальность проблемы

Стероиды участвуют в осуществлении разнообразных биологических функций организма животных и человека. В основе механизма действия стероидных гормонов лежит их взаимодействие с соответствующими клеточными рецепторами, которые действуют как факторы регуляции транскрипции и модулируют экспрессию соответствующих генов (Tong and Dong, 2009). Исследования последних лет показали, что ряд ЗР-гидрокси-5-ен-стероидов (называемых также нейростероидами) - дегидроэпиандростерон (ДГЭА, 3(3-гидроксиандрост-5-ен-17-он), сульфат дегидроэпиандростерона (ДГЭАС), прегненолон (ЗР-гидроксипрегн-5-ен-17-он) и др. могут являться аллостерическими регуляторами нейротрансмиттерных рецепторов и изменять возбудимость нейронов при прямом контакте с клеточной поверхностью (Rupprecht and Holsboer, 1999). Показано, что ДГЭА и его 7-гидроксилированные метаболиты обладают также антиглюкокортикоидной и антиоксидантной активностью (Kalimi et al., 1994; Hampl et al., 1997; Pelissier et al., 2004). Помимо этого, положительные эффекты 7а-гидроксидегидроэпиандростерона (7ос-ОН-ДГЭА; ЗР,7а- дигидроксиандрост-5-ен-17-она), полученные в тестовых опытах и в экспериментах на животных, открывают перспективы его использования в лечении болезни Альцгеймера (Lardy, 1994), ожирения (Lardy, 1992), иммунных и эндокринных заболеваний (Rose et al., 2002). Другие гидроксипроизводные ДГЭА (7(3,11<х- дигидроксидегидроэпиандростерон (7Р,11а-ди-ОН-ДГЭА; Зр,7РД1а- тригидроксиандрост-5-ен-17-он), и 7а,15а-дигидроксидегидроэпиандростерон (7а, 15а-ди-ОН-ДГЭА; Зр,7а,15а-тригидроксиандрост-5-ен-17-он)) нашли применение как ключевые интермедиаты синтеза лекарственных препаратов, - дроспиренона и эплеренона (Petzoltd et al., 1984; White et al, 2006).

Получение гидроксилированных производных ДГЭА возможно путем микробиологической трансформации или химического синтеза. Однако химический синтез гидроксипроизводных ЗР-гидроксистероидов проходит с низкой селективностью и небольшим выходом (Defaye et al., 1978; Criton et al., 2007). Более предпочтительным представляется получение гидроксипроизводных ДГЭА с помощью микробиологической трансформации.

Известна способность мицелиальных грибов к эффективному гидроксилированию 3-кетостероидов андростанового и прегнанового рядов (Mahato and Garai, 1997; Fernandes et al., 2003). Между тем, данные о гидроксилировании ЗР- гидрокси-5-ен-стероидов, в том числе ДГЭА, до начала наших исследований были весьма ограничены.

Актуальными задачами являются поиск эффективных штаммов, способных к регио- и стереоспецифическому введению гидроксильных групп в положения 7а, 7р и 7а, 15а ДГЭА без структурной модификации кольца А; изучение их потенциала в качестве продуцентов нейроактивных стероидов и их предшественников, получение новых, потенциально биоактивных 7а-гидроксистероидов, а также поиск путей интенсификации процессов гидроксилирования гидрофобных стероидных субстратов мицелиальными грибами.

Состояние вопроса

Известно, что мицелиальные грибы способны вводить гидроксильную группу в различные положения стероидной молекулы. Основное внимание исследователей в течение долгого времени уделялось микробиологическому гидроксилированию 3-кето-4-ен-стероидов. Определен широкий круг мицелиальных грибов различной таксономической принадлежности, способных осуществлять 7(а/р)-гидроксилирование З-кето-4-ен-стероидов (Mahato and Garai, 1997; Fernandes et al., 2003). Способность к гидроксилированию Зр-ол-5-ен-стероидов была показана для ограниченной группы штаммов - представителей родов Fusarium (Defaye et al., 1978; Cotillon et al., 1997; Kolek, 1999; Wilson et al., 1999), Mucor (Madyastha and Joseph, 1995), Rhizopus (Dodson et al., 1959; Choudhary et al., 2003) и некоторых других родов.

Показано, что замена З-кето-4-ен- на ЗР-гидрокси-5-ен структуру стероидного ядра может приводить к изменению положения введения гидроксильной группы. Например, Mucor piriformis осуществлял преимущественно 14а-гидроксилирование С\д и Сгі стероидов с З-кето-4-ен структурой (Madyastha, 1994), в то же время ДГЭА и прегненолон гидроксилировались этим грибом стереоспецифически в положении 7а с образованием соответствующих 7а-гидроксипроизводных (Madyastha and Joseph, 1995). В ряде случаев реакция гидроксилирования сопровождалась трансформацией Зр-ол-5-ен- в З-кето-4-ен структуру (Charney and Herzog , 1967; Choudhary et al., 2003). Литературные данные по 7а,15а-дигидроксилированию ДГЭА мицелиальными грибами ограничены несколькими работами (Okada and Saito, 1965; Petzoldt et al., 1984; White and Gilbert, 2004; Romano et al., 2006).

Исследований по изучению ферментных систем низших эукариот, ответственных за моногидроксилирование в положениях 7а и 7Р и дигидроксилирование (в положениях 7а и 15а) ЗР-ол-5-ен-стероидов андростанового ряда, практически не проводилось. Изучение ферментной системы, ответственной за 7а-гидроксилирование ДГЭА, было проведено только на культуре Fusarium moniliforme (Cotillon et al., 1997; Cotillon and Morfin, 1999).

Сведения о наличии у мицелиальных грибов активности Байер-Виллигер монооксигеназы - фермента, ответственного за лактонизацию кольца D стероидов были приведены в ряде публикаций (Ахрем и Титов, 1970; Mostava and Zohri, 2000; Bartmanska et al., 2005 и др.). Образование тестололактона (17а-окса-Б-гомо-андрост-4-ен-3,17-диона) из З-кето-4-ен-стероидов (преимущественно, тестестерона (Т, 17р-гидроксиандрост-4-ен-3,17-диона) и прогестерона (прегн-4-ен-3,20-диона)) мицелиальными грибами было выявлено у представителей родов Aspergillus (Mostava and Zohri, 2000), Penicillium (Bartmanska et al., 2005), Fusarium (Plourde et al., 1972). Получение лактонов из С19- и Сг і -стероидов с ЗР-гидрокси-5-ен-структурой без модификации кольца А было показано только для культур Penicillium lilacinum AM 111 (Kolek et al., 2008) и Penicillium camemberti AM 83 (Kolek et al., 2009): штаммы конвертировали прегненолон и ДГЭА до ЗР-гидрокси-17а-окса-0-гомо-андрост-5-ен-17-она. При биоконверсии прегненолона начальным этапом являлась деградация прегнановой боковой цепи с образованием ДГЭА в качестве интермедиата с последующим его окислением до Зр-гидроксилактона (Kolek et al., 2008; Kolek et al., 2009). Сведений об образовании 7-гидроксипроизводных лактонов с Зр-ол-5-ен структурой в доступной литературе не обнаружено.

В целом, анализ данных научной и патентной литературы свидетельствует о наличии ограниченного числа штаммов, представляющих интерес для дальнейшего биотехнологического использования при получении биоактивных стероидов и ключевых интермедиатов на основе 7-гидроксилированных производных ДГЭА. Недостаточно изученной остается также связь 7-гидроксилирования 3-гидрокси-стероидов с лактонизацией по кольцу Д и другими реакциями трансформации, осуществляемыми ферментными системами мицелиальных грибов, - окислением 3-гидроксигруппы, А^5_>4-изомеризацией, 17Р - восстановлением, 15а-гидроксилированием.

Цель и задачи работы.

Целью работы являлось изучение гидроксилирования дегидроэпиандростерона в положениях 7а и 7р мицелиальными грибами и разработка биотехнологических методов получения 7-гидроксипроизводных Зр-ол-5-ен-стероидов ряда андростана.

Были поставлены следующие задачи:

1. Оценить гидроксилирующую активность мицелиальных грибов в отношении дегидроэпиандростерона и выявить штаммы, наиболее эффективно осуществляющие гидроксилирование в положениях 7а и 7р без структурной модификации кольца А.

2. Выбрать наиболее активные штаммы, катализирующие стереоселективное дигидроксилирование дегидроэпиандростерона в положениях 7а и 15а.

3. Изучить связь 7-гидроксилирования с сопутствующими реакциями трансформации дегидроэпиандростерона: 15а-гидроксилированием, 17р-восстановлением, окислением 3-гидроксигруппы, Д^5_>4-изомеризацией, лактонизацией кольца D.

4. Исследовать особенности трансформации дегидроэпиандростерона наиболее активными штаммами и определить оптимальные условия селективного образования целевых 7-гидроксипроизводных.

5. Разработать биотехнологические способы получения Зр,7а,15а-тригидроксиандрост- 5-ен-17-она и ЗР,7а-дигидроксиандрост-5-ен-17-она из дегидроэпиандростерона с выделением продуктов в кристаллическом виде.

Научная новизна работы.

Исследована трансформирующая активность 487 штаммов 312 видов 89 родов мицелиальных грибов в отношении дегидроэпиандростерона. Большинство штаммов осуществляли гидроксилирование ДГЭА в положении 7а, при этом, наиболее активные представители были выявлены среди родов Actinomucor, Backusella, Benjaminiella, Epicoccum, Fusahum, Phycomyces, Thchothecium, Gongronella, Gliocephalotrichum, Mucor, Rhizomucor, Neurospora и Cunninghamella. Представители родов Bipolaris, Conidiobolus и Curvularia наиболее активно вводили гидроксильную группу в положение 7р. Найдены штаммы, активно проводящие 7а, 15а-дигидроксилирование ДГЭА. При этом высокая активность отмечена для представителей родов Acremonium, Fusarium, Gibberella и Nigrospora. Впервые выявлены штаммы (родов Basidiobohis, Botrytis и Phoma) эффективно восстанавливающие 7а-ОН-ДГЭА с образованием андрост-5-ен-Зр,7а,17Р-триола. Представители родов Drechslera, Eurotium и Sporotrichum активно модифицировали Зр-ол-5-ен группировку ДГЭА в З-кето-4-ен- структуру с образованием андрост-4-ен-3,17-диона. Впервые исследовано 7а-гидроксилирование ДГЭА культурой Gibberella zeae ВКМ F-2600. Найдены условия, обеспечивающие селективное образование 7а-гидроксипроизводного (при совместном использовании твина-80, метилированного р-циклодекстрина и растворителя (этанола или диметилформамида)). Впервые изучены особенности 7а,15а-дигидроксилирования ДГЭА культурой Fusarium graminearum F-159. Установлено, что образование 7а,15а-дигидроксипроизводного является результатом последовательного осуществления реакций 7а-гидроксилирования ДГЭА и 15а-гидроксилирования 7а-гидроксипроизводного ДГЭА.

Впервые выявлена способность штамма рода Spicaria к осуществлению 7(а/Р)-гидроксилирования дегидроэпиандростерона и лактонизации кольца D Зр,7(а/р)-диолов андростанового ряда. Ранее о возможности микробиологического получения лактонов Зр,7(а/р)-диолов андростанового ряда, а также о наличии активности Байер-Виллигер монооксигеназы у грибов рода Spicaria не сообщалось.

Практическая значимость работы.

Найдены штаммы мицелиальных грибов, осуществляющие моногидроксилирование в положениях 7(а/Р) и 7а,15а-дигидроксилирование Зр~ гидроксистероидов без структурной модификации кольца А. Получены микробиологическим путем новые стероидные лактоны - Зр,7(а/р)-дигидрокси-17а- окса-0-гомо-андрост-5-ен-17-оны из дегидроэпиандростерона. Результаты открывают перспективы нового биотехнологического подхода к получению лактонов, потенциально обладающих противоопухолевой и антиандрогенной активностями. Разработаны эффективные биотехнологические методы получения Зр,7а- дигидроксиандрост-5-ен-17-она и Зр,7а,15а-тригидроксиандрост-5-ен-17-она- важных интермедиатов синтеза терапевтических стероидов. Предложен метод комбинированного химико-микробиологического синтеза Зр-гидроксиандрост-5,7-диен-17-она — ценного интермедиата новых производных витамина D. Результаты могут быть использованы при получении биоактивных стероидов и интермедиатов.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: на 9-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005), на II Международной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2006), на VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008), на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009), на ежегодных Отчетных сессиях научных работ ИБФМ РАН (2004, 2006, 2007, 2009).

Основные положения диссертации были представлены на совместном семинаре Лаборатории микробиологической трансформации органических соединений и Лаборатории энзиматической деградации органических соединений.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 5 статей и 6 тезисов.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, приложений 1 и 2. Работа содержит 119 страниц машинописного текста, 26 таблиц и 30 рисунков. Библиография включает 180 наименований, из них 149 иностранных работ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Стероиды, органические соединения, которые в своей структуре имеют ядро, образованное гидрированным фенантреном и циклопентаном. В зависимости от структуры боковой цепи при атоме С-17 и наличия метальных групп при атомах С-10 и С-13 стероиды подразделяются на следующие группы: производные эстрана, андростана, прегнана, холана, холестана, эргостана и стероидные соединения, содержащие в боковой цепи один или несколько гетероциклов (карденолид, буфадиенолид и др.) (рис.1). ²¹СН₃

эргостан холестан

Рис.1. Структуры представителей основных стероидных групп.

СН₃ СН₃ 20

В живой эукариотической клетке началом биосинтеза стероидов является образование изопреновых фрагментов из уксусной кислоты, через ацетил кофермент А и мевалоновую кислоту, которые путем конденсации образуют общий предшественник сквален. Циклизация сквалена приводит к образованию структуры стероида (Джафаров с соавт., 2010).

Первые стероидные соединения были выделены из грибов в начале 19 века, а в начале 20 века началось изучение микробиологической трансформации стероидов (Ахрем и Титов, 1970). Открытие терапевтических эффектов кортизола и прогестерона к началу 50-х годов прошлого столетия и выявление 11а-гидроксилазной активности у штаммов рода Rhizopus послужило первым шагом в разработке практического синтеза стероидов с полезными биологическими свойствами. Наибольшее внимание исследователей было сфокусировано на реакциях гидроксилирования, д'-дегидрирования, деградации боковой цепи стеринов (Mahato and Garai, 1997; Feraandes et al., 2003). Исследования в первую очередь были направлены на изучение биотрансформаций для получения природных соединений, проявляющих биологическую активность, или являющихся ключевыми интермедиатами в химическом синтезе получения синтетических стероидов с заданными свойствами. Увеличение числа исследований по трансформации стероидов микроорганизмами связано с тем, что при использовании биокатализатора процесс можно проводить в мягких условиях, не требующих агрессивных сред, повышенных температур и специальных дорогостоящих реактивов.

Похожие диссертации на Регио- и стереоспецифическое гидроксилирование дегидроэпиандростерона в положении 7 мицелиальными грибами

Синтез и некоторые реакции 1,3,3-триалкил-3,4-дигидроизохинолинов, содержащих диалкокси- и гидрокси-алкоксигруппы в 6-ом и 7-ом положениях кольцаВшивкова Татьяна Степановна

Литиирование нафталиновой протонной губки и синтез ее производных с азотсодержащими заместителями в положениях 2 и 7Антонов Александр Сергеевич