Введение к работе
Актуальность темы. Спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) обладает очень высокой чувствительностью и в ряде случаев позволяет обнаруживать одиночные молекулы . Получение конъюгатов антител с ГКР-активными наноструктурами привело к возникновению нового типа иммуноанализа, который на несколько порядков превосходит по чувствительности широко применяемый в настоящее время иммуноферментный анализ. Данное обстоятельство имеет особую важность в связи с тем, что большинство белков плазмы крови присутствуют в очень низких концентрациях. Следовательно, с увеличением чувствительности метода круг определяемых объектов значительно расширяется . Кроме того, разведение исходных биологических образцов приводит к уменьшению вклада неспецифических взаимодействий и влияния интерферентов. В последние годы также наблюдается тенденция использования спектроскопии ГКР для визуализации конъюгатов наночастиц с антителами в живых тканях , что открывает перспективы их дальнейшего использования для направленной фототермической терапии . Таким образом, актуальность задач, связанных с созданием и оптимизацией условий для реализации максимально возможных факторов усиления ГКР, не вызывает сомнений.
Существует возможность многократного увеличения сигнала красителя в спектре ГКР путем агрегации наночастиц, на поверхности которых он иммобилизован. Недостатком такого подхода является увеличение погрешности получаемых результатов, поскольку агрегация наночастиц представляет собой статистический процесс. Поэтому область применения такого подхода в основном ограничивается качественным анализом.
Другая возможность увеличения сигнала в спектре ГКР связана с оптимизацией размера наночастиц. Например, для золотых наночастиц оптимальный размер составляет около 50 нм . Широко распространенным методом увеличения размеров наночастиц является автометаллография - осаждение металла на поверхности наночастиц путем восстановления его ионов. Существует также метод, основанный на ферментативной генерации восстановителя и называемый ферментативной
1 C.R. Yonzon, D.A. Stuart, X. Zhang, A.D. McFarland, C.L. Haynes, R.P. VanDuyne. Towards advanced
chemical and biological interactions II Talanta, Nanoscience and Nanotechnology. - 2005. -V.67(3). - P.438-
448.
2 A.I. Archakov, Y.D. Ivanov, A.V. Lisitsa, V.G. Zgoda. AFMfishing nanotechnology is the way to reverse the
Avogadro number in proteomics II Proteomics. - 2007. - V. 7. - P. 4-9.
3 K.K. Maiti, U.S. Dinish, C.Y. Fu, J-J. Lee, K.-S. Soh, S.-W. Yuri, R. Bhuvanesvari, M. Olivo, Y.-T. Chang.
Development of biocompatible SERS nanotag with increased stability by chemisorption of reporter molecule for
in vivo cancer detection II Biosensors and Bioelectronics. - 2010. - V.26. - P. 398-403.
4 Л.А. Дыкман, В.А. Богатырев. Наночастицы золота: получение, функционализация, использование в
биохимии и иммунохимии II Успехи химии. - 2007. - Т. 76. - №2. - С. 199-213.
металлографией, позволяющий расширить возможности получения наночастиц оптимального размера.
Для дополнительного увеличения фактора усиления в последнее время используют плазмонный резонанс с применением островковых пленок. Специально оптимизированные плазмонные подложки позволяют увеличить интенсивность электромагнитного поля на несколько порядков. Так как сигнал комбинационного рассеяния пропорционален четвертой степени интенсивности локального электромагнитного поля, он потенциально может быть усилен в сто и более миллионов раз . Иммобилизация золотых наночастиц с последующим проведением автометаллографии позволяет создавать островковые пленки, не прибегая к напылению золота, представляющему собой высокотехнологичный процесс, осуществление которого в больших масштабах затруднительно.
Цель работы заключалась в исследовании возможности применения автометаллографии для получения золотых наночастиц оптимального размера и островковых пленок золота, а также в демонстрации применимости полученных результатов в высокочувствительном иммуноанализе на примере определения приона. Прионы - это белковые патогены, вызывающие ряд неизлечимых в настоящее время заболеваний центральной нервной системы человека и животных . Создание высокочувствительных методов определения прионов необходимо для их ранней диагностики и выявления зараженных биоматериалов, что может ограничить их распространение.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
Исследование процесса агрегации золотых наночастиц полиэлектролитами методами спектрофотометрии, сканирующей электронной микроскопии и спектроскопии ГКР.
Спектрофотометрическое исследование закономерностей роста золотых наночастиц в растворе в процессе восстановления золотохлористоводородной кислоты пероксидом водорода для получения наночастиц оптимального размера, которые могут быть использованы в иммуноанализе.
5 Климов В.В. Наноплазмоника. М.: Физматлит, 2009.
6 А.К. Sarychev and V.M. Shalaev. Electrodynamics ofMetamaterials. World Scientific. 2007.
7 B.C. Рукосуев, A.A. Жаворонков. Прионовые болезни и амилоидоз головного мозга II Архив патологии.
- 1999. - Т. 2. - С. 50-55; И.А. Завалишин, И.Е. Шитикова, Т.Д. Жученко. Прионы и прионные болезни II
Клиническая Микробиология и Анимикробная Химиотерапия. - 2000. - Т. 2. - №2. - С. 12-19;
Блинникова О.Е. Трансмиссивные олигоформные энцефалопатии II Новый Хирургический Архив. -
2001. - Т. 1. - №2. - С. 1457-1465.
Исследование закономерностей роста иммобилизованных золотых наночастиц, приводящего к формированию островковых пленок, в процессе восстановления золотохлористоводородной кислоты пероксидом водорода методами спектрофотометрии, электронной микроскопии и атомно-силовой микроскопии (АСМ).
Исследование возможности получения островковых пленок для высокочувствительного иммуноанализа напылением золота на различные поверхности.
Использование островковых пленок для высокочувствительного определения прионов.
Научная новизна работы состоит в следующем:
Обнаружено, что ферментативная металлография позволяет получить островковые пленки с более разнообразными свойствами, чем автометаллография.
Установлено, что агрегация золотых наночастиц полиэлектролитами протекает воспроизводимо и приводит к повышению их ГКР-активности.
Показано, что автометаллография приводит к дальнейшему повышению ГКР-активности агрегатов золотых наночастиц.
Практическая значимость результатов:
Предложено использование полиэлектролитов для воспроизводимого получения стабильных растворимых агрегатов золотых наночастиц, применение которых повысит чувствительность иммуноанализа с применением спектроскопии ГКР.
Предложен способ дополнительного усиления сигнала ГКР конъюгатов при проведении иммуноанализа на нитроцеллюлозной тест-полоске путем добавления к их раствору золотых наночастиц размером 45 нм и предварительной обработки нитроцеллюлозы полиэлектролитом.
Разработаны новые методы получения ГКР-активных островковых пленок золота. На примере определения прионов показана их применимость для высокочувствительного иммуноанализа.
Апробация работы: основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на следующих конференциях: «Биокатализ-2009», Архангельск, СГМУ, 18-24 июня 2009 г.; II Фестивале научно-технического творчества молодежи Западного административного округа, Москва, МИТХТ имени М.В. Ломоносова, 29 мая 2010 г.; III Фестивале научно-технического творчества молодежи Западного административного округа, Москва, МИТХТ имени
М.В.Ломоносова, 28 мая 2011 г.; IV международной конференции «Современные достижения бионаноскопии», Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова, 15-18 июня 2010 г.; V международной конференции «Современные достижения бионаноскопии», Москва, МГУ имени М.В.Ломоносова, 15-17 июня 2011 г.; IV Конгрессе с международным участием «Опухоли головы и шеи», Иркутск, 2-4 сентября 2011 г.; II Международной школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина», Московская область, 19-24 сентября 2011 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, из них - 1 статья и 6 работ в материалах научных конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, 5 глав экспериментальной части, общих выводов и списка литературы, включающего 181 наименование. Диссертация изложена на 175 страницах машинописного текста. Работа содержит 61 рисунок и 6 таблиц.
