Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Иммобилизация биокаталитически активного начала включением в гель (литературный обзор) 10-47
1.1. Ковалентные гели с включённым биокаталитически активным началом 12-30
1.1.1. Иммобилизованные биокатализаторы с матрицами из ковалентных гелей, полученных полимеризацией мономеров в присутствии действующего начала 12-25
1.1.2. Иммобилизованные биокатализаторы с матрицами из ковалентных гелей, полученных сшиванием полимеров 25-30
1.2. Нековалентные гели с включённым биокаталитически активным началом 30-44
1.2.1. Включение биокатализаторов в термообратимые гели 30-36
1.2.2. Включение биокаталитически активного начала в криогели 36-39
1.2.3. Включение биокатализаторов в ионотропные гели 39-44
1.3. Наполнители, подходящие для включения в гель в виде дисперсных частиц 44-47
ГЛАВА 2. Материалы и методы 48-60
2.1. Материалы 48-48
2.2. Методы 48-59
2.3. Математическая обработка результатов измерений 59-60
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 61-108
3.1. Некоторые физико-химические свойства криогелей поливинилового спирта, используемых в качестве носителей для иммобилизации ферментов 61-69
3.2. Ферментативно-активные наполнители 69-90
3.2.1. Сшитые гели трипсина с хитозаном 70-74
3.2.2. Поперечно-сшитые ферментные агрегаты 74-86
3.2.2.1. Изменение выхода и ферментативной активности поперечно-сшитых ферментных агрегатов при разных режимах их формирования 75-80
3.2.2.2. Калориметрические исследования поперечно-сшитых ферментных агрегатов и нативного трипсина 80-85
3.2.2.3. Поперечно-сшитые ферментные агрегаты трипсина с хитозаном..86-86
3.2.3. Трипсин, иммобилизованный на сшитом геле ПВС 86-90
3.3. Композитные биокатализаторы 90-108
3.3.1. Физикомеханические характеристики композитных систем 95-97
3.3.2. Ферментативная активность композитных биокатализаторов 97-108
Выводы 109-110
Литература 111-135
- Иммобилизованные биокатализаторы с матрицами из ковалентных гелей, полученных полимеризацией мономеров в присутствии действующего начала
- Наполнители, подходящие для включения в гель в виде дисперсных частиц
- Некоторые физико-химические свойства криогелей поливинилового спирта, используемых в качестве носителей для иммобилизации ферментов
- Калориметрические исследования поперечно-сшитых ферментных агрегатов и нативного трипсина
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одним из наиболее эффективных подходов к стабилизации ферментов является их иммобилизация с использованием нерастворимых носителей. Кроме того, такие системы обладают возможностью технически несложного отделения от реагентов, что позволяет применять их многократно и получать незагрязнённый ферментом продукт.
В качестве носителей для иммобилизации ферментов широко используют как органические (природные и синтетические) полимеры, так и неорганические материалы. К носителям предъявляются определённые требования: они должны быть нерастворимы в реакционной среде, обладать химической, биологической стойкостью, механической прочностью, не вызывать неспецифической адсорбции и сильных конформационных изменений молекулы белка, легко гранулироваться и активироваться.
Перспективными носителями для иммобилизованных ферментов являются криогели поливинилового спирта - макропористые вязкоупругие полимерные ге-левые материалы, получаемые в результате криогенной обработки, то есть после замораживания - выдерживания в замороженном состоянии - оттаивания водных растворов данного полимера. Полимерными криогелями называются гелевые материалы, сформированные в неглубоко замороженных растворах полимерных или мономерных предшественников. Неглубоко (умеренно) замороженными считаются системы при температурах не ниже, чем несколько десятков градусов от точки замерзания чистого растворителя. Подобные системы, как правило, являются двухфазными, они содержат поликристаллы твердой фазы, которые выполняют роль порогенов, и небольшой объем остающегося еще жидким раствора - так называемую незамерзшую жидкую микрофазу, где концентрируются растворенные вещества и происходит формирование криогелевой матрицы. Образующиеся криогели обычно имеют макропористую (от 0,1 до 10 мкм) или сверхмакропористую структуры (от 10 до 1000 мкм) с взаимосвязанными порами, что придает таким материалам уникальный набор физико-химических свойств, а также позволяет использовать их для решения ряда биомедицинских и биотехнологических задач.
Наиболее изученными представителями криогелей с макропористой структурой являются криогели поливинилового спирта (КГПВС). Поливиниловый спирт (ПВС) доступен, является продуктом крупнотоннажного синтеза, каждая его марка стандартизована. Благодаря высокой прочности, выраженной пористости, биосовместимости и стабильности в биологических средах КГПВС нашли широкое применение в различных областях биотехнологии. В частности, криогели ПВС были использованы в качестве носителей для ковалентного присоединения белков и ферментов при получении макропористых иммуносорбентов и ряда иммобилизованных биокатализаторов, предназначенных для ферментолиза очень высокомолекулярных субстратов или для работы в маловодных средах. В этом случае емкость криогеля ПВС как носителя, то есть содержание фермента в расчете на единицу массы или объема, составляет порядка 1-10 мг/г(мл), что характерно для крупнопористых матриц, существенная часть объёма которых приходится на поры, а количество реакционноспособных группировок полимера, расположенных в стенках этих макропор, относительно невелико. В этой связи представляют интерес иммобилизованные системы, в которых биокаталитическое действующее начало (в рассматриваемом случае - препарат фермента) включено в матрицу макропористого криогеля ПВС в виде частиц дисперсного наполнителя, распределенного по всему объёму носителя, что позволило бы значительно повысить содержание фермента в соответствующем иммобилизованном биокатализаторе. При этом важным условием является сохранение хороших физико-механических свойств композитного геля, несмотря на включение в него механически непрочного ферментного наполнителя и отсутствие препятствий в технически несложной методике получения гранулированных гелевых препаратов на основе водных растворов ПВС.
Целью работы являлось изучение возможности получения композитных биокатализаторов с матрицей из криогеля поливинилового спирта и включённым в неё биокатализатором в виде частиц мелкодисперсного наполнителя. В связи с заявленной целью решались следующие задачи: 1. Исследование физико-химических свойств криогеля поливинилового спирта
(морфологических, теплофизических и физико-механических) при разных
условиях получения.
Изучение разных вариантов формирования дисперсных ферменто-содержащих наполнителей, подходящих для включения в матрицу криогеля ПВС. Оценка каталитических свойств наполнителей.
Изучение физико-механических свойств и ферментативной активности композитных биокатализаторов.
Научная новизна и практическая значимость полученных результатов. В диссертационной работе показана взаимосвязь между концентрацией ПСВ в растворе и морфологией получившегося в результате криогенной обработки криогеля поливинилового спирта. Впервые показана возможность получения композитных биокатализаторов, состоящих из мелкодисперсных частиц ферментативно-активного наполнителя, включённых в матрицу криогеля поливинилового спирта. Показано, что включение наполнителя в матрицу КГПВС не приводит к ухудшению физико-механических характеристик криогеля поливинилового спирта.
Апробация работы. Основные результаты диссертации изложены в 5 печатных работах, в том числе 2 статьях в научных журналах, 3 - сборниках статей и материалах конференций. Работа была награждена дипломом за лучшее стендовое сообщение на VII научной конференции молодых учёных, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета. "Материалы и технологии XXI века".
Личный вклад автора в работах, выполненных в соавторстве и включённых в диссертацию, состоял в проведение экспериментальных исследований, обработке, интерпретации и обобщении полученных результатов.
Объём и структура работы. Диссертация изложена на 136 страницах печатного текста, содержит 17 рисунков, 9 таблиц и состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (213 наименований)
Работа выполнена в лаборатории криохимии биополимеров ИНЭОС РАН и явилась продолжением и частью исследований, направленных на создание эффективных носителей биотехнологического назначения в рамках проектов по грантам РФФИ 05-04-08018_офи_а, РФФИ 07-04-12132_офи_а и РФФИ 07-03-96682-РА_а.
Иммобилизованные биокатализаторы с матрицами из ковалентных гелей, полученных полимеризацией мономеров в присутствии действующего начала
Инициация реакции полимеризации мономеров, применяемых для синтеза гелевой матрицы и одновременного включения в неё биокаталитического начала, может вызываться радиацией [44, 45, 46], ультрафиолетовым излучением [47, 48] или химическим способом [49]. К достоинствам радиационной полимеризации относится возможность проведения реакции в широком диапазоне условий, включая полимеризацию при низких температурах, полимеризацию твёрдых мономеров и многофазных систем, а также отсутствие примесей катализатора. Для проведения радиационной полимеризации обычно используют дозы порядка 1-10 кГр (у-излучение, Со60) [45]. Существуют причины, ограничивающие широкое применение радиационной полимеризации, как чисто организационные, вытекающие из необходимости специального оборудования для работы с радиоактивными веществами, так и биолого-радиофизические, связанные с чувствительностью ферментов и клеток к у-излученшо.
Исходные соединения для гелевой матрицы, синтезируемой методом фотополимеризации, бывают двух видов: высокомолекулярные и низкомолекулярные. В качестве инициатора фотополимеризации мономеров, которые формируют матрицу, содержащую биокатализатор, применяют азобисбутиро-нитрил, 1-циклогексилфенилкетон, 2,2-диметокси-2фенилацетофенон, рибофлавин и другие соединения [47, 192].
Полимеризация, инициируемая химически, чаще всего применяется при получении иммобилизованных биокатализаторов методом включения в массу носителя. Основными органическими предшественниками для ковалентных гелей, включающих в свою массу биокаталитическое начало, являются такие коммерческие мономеры и их смеси, как акриламид, акриловая кислота с гли цидилакрилатом, 2-гидроксиэтилметакрилат, N-винилпирролидон, 2— гидроксилпропиламид, 2—гидроксипропилакрилат, бутандиолакрилат и эти ленгликольакрилат и др. [1]. Для иммобилизации биокаталитического начала часто синтезируют сополимеры из следующих смесей мономеров: акриламид — Т ІМ -метиленбисакриламид, акриламид — 2-гидроксиэтилметакрилат — Т,№-метиленбисакриламид, N-изопропилакри-ламид - N,N — метиленбисакриламид, N-изопропилакриламид - акриловая кислота - N,N" метиленбисакриламид, 2-гидроксиэтилметакрилат - N,N метиленбисакриламид и другие [1]. При этом, такие свойства иммобилизованных ферментов, как активность, стабильность или селективность, во многом определяются природой мономеров, концентрацией сшивающего агента, концентрацией инициатора реакции.
Полимерные материалы, используемые для включения биокаталитического начала, могут быть гидрофобными; как например полиметилметакри-лат, полистирол, поливинилацетат [50], полигидроксиэтил метакрилат, или гидрофильными, как, например, полимеры на основе акриламида и акриловой кислоты.
Важной характеристикой, влияющей на эффективность иммобилизованного биокатализатора, который получен включением в гель, является размер пор матрицы. Значение этого параметра должно отвечать двум взаимо-противоречащим требованиям, а именно — предотвращать вымывание биокаталитического начала и не создавать больших диффузионных затруднений при протекании реакции. Приёмы, позволяющие предотвратить вымывание биокаталитического начала, различаются по объекту воздействия: одни из них направлены на уменьшение размеров пор (например, повышением степени сшивки матрицы), а другие на увеличение гидродинамического радиуса ферментов. Изменения, затрагивающие белок, производят его химической модификацией полимерными цепями, например, ПЭГилированием ферментов [51, 52, 53], модификацией полимерами на основе поли-И-винилпирролидона [33, 52], поли-КГ-акрилоилморфолина [52]. Из полимеров и способов их присоединения к ферменту во многих случаях можно выбрать подходящий, чтобы активность фермента после модификации была максимальной и, таким образом, сохранить активность фермента и предотвратить вымывание биокатализатора при достаточно большом диаметре пор носителя. Тем не менее, небольшие размеры пор могут способствовать большей стабильности иммобилизованного биокаталитического начала из-за больших диффузионных затруднений для гидралаз микроорганизмов, оказавшихся в реакторе.
Следует отметить использование "умных полимеров" для иммобилизации ферментов. Молекулы "умных полимеров" изменяют энергетические параметры взаимодействия полимер-растворитель в ответ на некоторые физические или химические воздействия (температура [54], свет [55], рН [56, 57], изменение состава растворителя [58]). Молекулы растворителя вытесняются из сольватной оболочки полимера самими полимерными звеньями (с точки зрения физической химии это - фазовый переход [59], который можно вызвать изменением температуры, растворителя или нагрузкой). Для линейных водорастворимых полимеров фазовый переход заключается в расслоении раствора и выпадении полимера в осадок. Для трехмерных полимерных сеток, в частности гидрогелей, фазовый переход выражается в коллапсе сетки, т. е. в уменьшении линейных размеров и массы геля [59].
Согласно существующим теоретическим представлениям [59, 60], равновесные размеры полимерного геля (т. е. его набухание и коллапс) определяются балансом между энтропийной упругостью сетки и объёмными взаимодействиями звеньев. Если цепи сетки содержат ионизированные группы и, соответственно, в растворителе находятся в должном количестве подвижные противоионы, то существенные вклады в свободную энергию вносят также кулоновское взаимодействие флуктуации плотности заряда и осмотическое давление газа противоионов [59, 60].
Существует ряд полимеров, вьгпадающих из растворов при нагревании. Температура, при которой происходит коллапс полимерной цепи, называется нижней критической температурой смешения (НКТС). Типичные полимеры с НКТС, используемые для иммобилизации биокаталитического начала, основаны на N-изопропилакриламиде [61], М -диэтилакриламиде [62], метилви-ниловом эфире [63], N-винилкапролактаме [32, 33]. Температура, выше которой полимеры становятся растворимыми, называется верхней критической температурой смешения (ВКТС). Синтетические стимуло-чувствительные полимеры с ВКТС получают при полимеризации незаряженного и заряженного мономеров, например при совместной полимеризации акриламида с акриловой кислотой [64]. Изменяя степень гидрофобности/гидрофильности исходных мономеров, можно получать полимеры с нужной температурой фазового перехода, варьирующейся в весьма широких пределах от 4 до 70С [54]. При синтезе рН-чувствительных полимеров применяют мономеры, содержащие группы, которые способны протонироваться и депротонироваться в физиологических условиях (как правило, карбоксильные и аминогруппы).
Наполнители, подходящие для включения в гель в виде дисперсных частиц
Различают четыре метода иммобилизации биокаталитического начала с использованием каррагинанов: а) "гелевый", б) "капельный", в) "эмульсионный и г) "дегидратационный" [5]. При использовании "гелевого" метода иммобилизации к нагретому раствору каррагинана с соответствующей ионной силой добавляют нагретый раствор или суспензию биокатализатора [5]. Гель, полученный после охлаждения системы, измельчают и применяют по мере необходимости. В результате "капельного" метода включение в гель происходит в процессе прикапывания раствора (суспензии) биокатализатора и каррагинана в раствор солей, как правило, КС1 с концентрацией 0,3 М [4] — 0,7 М [129]. При "эмульсионном" методе нагретый раствор или суспензия биокаталитического начала с каррагинаном и индуктором гелеобразования перемешивается с инертным маслом и охлаждается [130]. При "дегидратационном" методе иммобилизации гранулы матрицы высушиваются лиофильно, затем помещаются в раствор фермента и после пропитки снова лиофильно высушиваются [131]. Иммобилизованные таким образом биокатализаторы применяют для работы в неводных средах.
Недостатком данных систем является необходимость присутствия в системе агентов, индуцирующих гелеобразование. Несмотря на возможность гелеобразования в растворах чистого к-каррагинана с концентрацией 7% и более [132], при отсутствии катионов в необходимой концентрации наблюдается размягчение геля и вымывание биокаталитического начала. Например, а-амилаза, включённая в гранулы, полученные из 3,5%-ного раствора к-каррагинана под действием 0,7М КС1, вымывается на 90% из матрицы за 74,4 мин [129], а папаин при той же концентрации к-каррагинана, но в присутствии 0,7 М КС1, вымывается на 90% за 55 мин [133]. В противоположность этому фермент, включённый в состав матрицы, сформированной из двух полимеров, формирующих взаимопроникающую гелевую сетку, вымывается гораздо меньше. Например, концентрация (3-галактозидазы, включённой в матрицу из совместного геля, образованного альгинатом Са и к— каррагинаном, после 18-ти 30-ти минутных циклов с хорошим перемешиванием, уменьшилась в матрице только на 10% [134]. Такие гели с взаимопроникающими полимерными сетками формируют не только из альгината и к— каррагинана [135, 136, 134, 137], но и из хитозана с желатином [138], из к каррагинана и сополимера акриламида с акриловой кислотой [139]. За счёт взаимного проникновения одной полимерной сетки в другую сечение пор формируемой гелевой матрицы уменьшается, что приводит к понижению вымывания фермента.
Другой метод, предотвращающий вымывание ферментов из каррагина-новой матрицы, состоит в использовании сшитых ферментных препаратов в качестве объектов для включения в гель [130, 2]. Ещё лучшие результаты по сохранению стабильности получаются при комбинировании подходов по стабилизации иммобилизованного фермента и матрицы, например, включение поперечно-сшитых ферментных препаратов в каррагинановую матрицу с последующей обработкой хитозаном [130].
Желатин является продуктом распада фибрилярного трехспирального белка коллагена на отдельные полипептидные цепи, свёрнутые в беспорядочные клубки. Коллаген составляет основную массу коллагеновьтх волокон соединительной ткани, кожи, сухожилий, костей. Молекулярная масса этой молекулы около 300000 Да, длина - 280 нм, толщина —1,5 нм. В молекуле присутствуют неполярные и полярные участки [124].
Желатиновые матрицы достаточно легкоплавки (t плавления 40С), их белковая основа является благоприятной средой для развития микроорганизмов и не может быть использована для иммобилизации протеаз и клеток, обладающих протеолитической активностью. Поэтому включение ферментов в желатиновую матрицу без обработки [140] применяется не часто. Для упрочнения матрицы и её стабилизации применяют "задубливание" формальдегидом [141] или глутаровым альдегидом [3]. При этом стабильность иммобилизованных биокатализаторов, полученных с использованием глутарового альдегида, оказывается выше, по сравнению с образцами иммобилизованных ферментов, полученных при использовании формальдегида [3]. Данный результат может быть объяснен стабилизацией фермента бифункциональным сшивателем, формирующим внутри- и межмолекулярные связи. Тем не менее, даже обработанный глутаровым альдегидом иммобилизованный биокатализатор на основе Р-амилазы, вюпочённой в плёнку из желатина, после второго использования сохранял около 50%, а после четвёртого - около 20% относительной активности [3].
Таким образом, использование полимеров природного происхождения наиболее эффективно для иммобилизации методом включения в гель довольно крупных объектов, таких, как клетки и сшитые ферментные препараты, по-сколько крупные поры матрицы не создают ощутимых препятствий для вымывания немодифицированных ферментов. В целом матрицы из природных полисахаридов, таких, как каррагинаны, агароза и желлан, не обладают достаточной способностью удерживать фермент [2, 143] при удовлетворительных результатах, получаемых при иммобилизации более крупных объектов, таких, как сшитые ферментные препараты [2, 130] или клетки [6]. Желатиновые матрицы также не обладают достаточной способностью удерживания ферментов. Решением, способным предотвратить вымывание белков, стала разработка подходов по получению взаимопроникающей гелевой сетки, поры которой меньше, и иммобилизованные ферменты обладают более высокой стабильностью.
Криотропное гелеобразование - это специфический вид гелеобразова-ния, которое происходит в результате криогенной обработки исходных систем, потенциально способных к желированию. Обязательным условием процессов, приводящих к формированию криогелей, является кристаллизация (замерзание) основной массы низкомолекулярной жидкости, присутствующей в первоначальной системе. Все типы гелеобразования, протекающего в среде растворителя можно реализовать и в криогенном варианте при подходящих режимах замораживания, выдерживания в замороженном состоянии и оттайвания. При этом образование фазы полимерного геля может происходить во время любой стадии криогенной обработки [144].
Некоторые физико-химические свойства криогелей поливинилового спирта, используемых в качестве носителей для иммобилизации ферментов
Макропористые криогели поливинилового спирта (КГПВС) образуются в результате криогенной обработки, т.е. после замораживания, выдерживания в замороженном состоянии и оттаивания водных растворов данного полимера [144-146]. Эти гелевые материалы представляют интерес как в научном, так и в прикладном аспектах, в том числе и для биотехнологии [7, 148, 199, 200], поскольку они обладают хорошими механическими, диффузионными (благодаря макропористости) и теплофизическими свойствами, а сам полимер доступен, нетоксичен и биосовместим. Кроме того, методика формирования геля довольно проста. Известно, что свойства и структура КГПВС определяются многими факторами: во-первых, характеристиками полимерного гелеобразо-вателя, во-вторых, его концентрацией в исходном растворе и, в-третьих, режимами криогенного воздействия [144-146]. В настоящее время эти гелевые материалы привлекают большое внимание в плане практического использования, особенно в таких областях, как биотехнология и разработка материалов биомедицинского назначения [6, 7, 51, 144, 148, 149, 150].
Принципиальной особенностью криогелей ПВС является, как уже отмечено в разделе 1.2.2 литературного обзора, их макропористая гетерофазная морфология, которая формируется поликристаллами замороженного растворителя, после плавления которых в массе геля остаются крупные поры, заполняемые оттаявшей жидкостью. Размеры и "архитектура" таких пор имеют существенное значение для интегральных физико-химических свойств КГПВС, и отдельные моменты такой взаимосвязи были продемонстрированы в ходе наших исследований. В частности, было показано, что характер воздействия макропористой морфологии криогелей ПВС на их физико-химические свойства определяется совокупностью многих факторов. Четкая корреляция "структура-свойство" не обязательно прослеживается в отношении влияния всех параметров процессов, приводящих в итоге к превращению жидкого раствора данного полимера в упруговязкий гетерофазный КГПВС. Высокие коэффициенты корреляции между физико-химическими характеристиками КГПВС и данными морфометрического анализа микрофотографий тонких срезов крио-гелей ПВС были найдены только в отдельных случаях, указывая тем самым, что пористая морфология КГПВС нередко определяется не каким-то одним доминирующим, а многими факторами, в том числе и очень часто действующими разнонаправленно.
В результате проведённых исследований было выяснено, что чем ниже была температура замораживания/выдерживания образцов, тем меньше у эк-виконцентрированных КГПВС были пористость и среднее сечение пор. Этот результат вполне закономерен, поскольку с понижением температуры замораживания должны уменьшаться размеры кристалликов льда, выполняющих функцию порогенов при криотропном гелеобразовании [144, 145]. При этом, зависимость жесткости КГПВС от температуры замораживания/выдерживания имела экстремальный характер. Причиной такого изменения жёсткости является конкуренция факторов, влияющих на характеристики образующихся КГПВС. Очевидно, что при одинаковой исходной концентрации полимера чем ниже температура замороженной системы, тем выше концентрация ПВС в НЖМФ, и это должно способствовать взаимодействиям полимер-полимер, т.е. промотировать формирование криогелей. Однако, прогрессивное нарастание вязкости, а также замедление тепловой подвижности цепей и их сегментов с понижением температуры выступают в качестве факторов, ингибирующих гелеобразование. В результате имеет место экстремальная зависимость физико-химических характеристик КГПВС от температуры замораживания/выдерживания исходных растворов полимера.
Вышеупомянутое отсутствие однозначных корреляций "структура-свойство" может свидетельствовать о том, что для каждого частного случая, т.е. для каждой концентрации ПВС в исходном растворе и температуры его замораживания/выдерживания, реализуется некое свое, по-видимому, уникальное сочетание факторов, определяющих конечную пористую морфологию образующегося криогеля.
Исследование влияния начальной концентрации раствора ПВС на свойства получившихся криогелей показало, что с повышением концентрации ге-леобразующего полимера в исходном растворе возрастали жесткость получающихся криогелей и их теплостойкость (коэффициенты корреляции параметров условно-мгновенного модуля сдвига (G0) и температуры плавления геля (Гг) в диапазоне концентраций полимера 80-120 г/л оказались равными 0.99, т.е. взаимосвязь жесткости и теплостойкости таких КГПВС была очень тесной). Данные, представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что повышение начальной концентрации ПВС с 80 до 120 г/л в подвергаемом криогенной обработке растворе полимера приводило к возрастанию сдвигового модуля соответствующих криогелей от 2.6 до 10 кПа, а температура плавления КГВПС повышалась на 5.1 С. Для физических полимерных гелей вообще такие тенденции изменения Гг хорошо известны [201, 202], они таюке характерны для КГПВС [144-146] и обусловлены увеличением количества термообратимых межмолекулярных сшивок в единице объема (или веса) гелевой системы при переходе ко все более концентрированным растворам соответствующих полимерных предшественников.
Калориметрические исследования поперечно-сшитых ферментных агрегатов и нативного трипсина
Если первоначальное воздействие глутарового альдегида на раствор трипсина длилось 5 минут и более, получить поперечно-сшитые ферментные агрегаты не удавалось. Данный результат можно объяснить тем, что глутаровый альдегид успевал прореагировать с большинством доступных аминогрупп белка в растворе, в результате чего образование межмолекулярных связей внутри частиц коагулята, осажденного под действием ацетона, оказывалось невозможным.
Характер изменения выхода ПСФА в зависимости от концентрации глутарового альдегида в экспериментах с использованием изопропанола: метод 2.2.2.2.1.4 (осаждение и сшивание с помощью раствора глутарового альдегида в изопропаноле) и метод 2.2.2.2.1.6 (первоначальное осаждение фермента изопропанолом и последующее сшивание глутаровым альдегидом), - оказался (рисунок 5) подобным тому, что мы наблюдали в случае применения ацетона в качестве осадителя (рисунок 4). Тем не менее, при одинаковых концентрациях использовавшегося в качестве сшивателя глутарового альдегида выход ПСФА был выше в тех экспериментах, где в качестве осадителя применяли изопропанол.
Активность ПСФА, оцененная по кинетике гидролиза БАНА, не зависела от типа осадителя и была примерно одинаковой у препаратов, полученных с использованием ацетона и изопропанола. Поэтому было изучено влияние на ферментативную активность ПСФА скорости добавления к раствору фермента смесей "сшиватель — осадитель" и их температуры (таблица 5). Температуру осадителя поддерживали на уровне или -10С, или 0С, или +22С, а скорости прибавления осадителя изменяли от 12 мл/с до 0,4 мл/с (в пересчёте на исходный объёма раствора фермента 4 мл). По результатам исследований было найдено, что активность ПСФА максимальна при наибольшей скорости добавления осадителя с температурой 0С. При таких условиях сшивание происходит достаточно быстро, и фермент фиксируется ковалентньтми связями с другими молекулами белка прежде, чем подвергнется значительным конфор-мационным изменениям. Температура 0С обеспечивала наиболее мягкое протекание реакции, и, как следствие этого, более высокое сохранение ферментативной активности по сравнению с другими температурами. Невысокий уровень сохранения активности при получении трипсиновых ПСФА, вероятно, объясняется взаимодействием глутарового альдегида с активным центром трипсина. Подобное действие глутарового альдегида при получении ПСФА известно для таких ферментов, как нитрилаза из Ps. fluorescence и алкогольде-гидрогеназа Е. coli [170]; более высокий уровень сохранения активности фермента в составе ПСФА иногда удавалось получить при использовании вместо глутарового альдегида полиальдегиддекстрана [170]. Тем не менее, поскольку нашей задачей являлось не получение конкретного иммобилизованного биокатализатора с высоким уровнем активности, а разработка подходов, позволяющих сформировать удобные в применении композитные иммобилизованные биокатализаторы, обладающие высокой ёмкостью в отношении биокаталитического начала, то дальнейшие усилия по повышению уровня активности иммобилизованного трипсина были признаны нецелесообразными.
Увеличение времени реакции получения ПСФА до 4 часов привело к тому, что выход ПСФА достигал количественного уровня при скорости разбавления от 13 до 0,4 мл/с. Если же добавление осадителя происходило ещё медленнее, то образования ПСФА не наблюдалось. Это объясняется тем, что после взаимодействия глутарового альдегида с большинством аминогрупп растворимого фермента не остаётся аминогрупп, с которыми может провзаи-модействовать при образовании осадка свободная альдегидная группа глутарового альдегида, связанная одним концом молекулы с белком. Описанный выше феномен подобен близкому к нулю выходу, который имел место при таком методе получения ПСФА, когда после длительной инкубации раствора фермента с глутаровым альдегидом к системе добавляли осадитель (метод 2.2.2.2.1.2.).
Небольшие, но всё-таки детектируемые различия в активности ПСФА, полученных при разных скоростях прибавления осадителя, а также невысокий уровень сохранения ферментативной активности трипсина в составе ПСФА, привели нас к необходимости изучить процессы, происходящие с ферментом при образовании ПСФА. В качестве метода, чувствительного к изменениям, произошедших в белке, была выбрана высокочувствительная дифференцаль-ная сканирующая калориметрия (ВЧ-ДСК), чьё применение для описания процессов, происходящих при иммобилизции ферментов, известно из литературы [212]. Для изучения процессов, имеющих место при получении ПСФА, были исследованы следующие препараты: а) трипсин, обработанный изопро-панолом, лиофильно высушенный и вновь растворённый в воде; б) трипсин, обработанный глутаровым альдегидом, а также контрольный образец натив-ного трипсина в).
На соответствующих термограммах (рисунок 6) в случае нативного трипсина виден бимодальный (скорее всего из-за двух изоформ фермента, присутствующих в препарате) денатурационный переход в области 40-70 С с энтальпией 14 Дж/г. Денатурационный переход у фермента, осажденного изо-пропанолом, высушенного лиофильно и вновь растворённого в воде, идентичен переходу нативного белка. Следовательно, после обработки спиртом фермент полностью ренатурирует в водной среде и влияние такого фактора, как обработка изопропанолом, снимается после помещения белка в водную среду. Термограмма фермента, обработанного глутаровым альдегидом, существенно отличается от термограммы нативного белка. На термограмме трипсина, обработанного глутаровым альдегидом, виден эндотермический переход около 70 С, вероятно связанный с денатурацией, и экзотермический пик около 80 С. Энтальпия экзотермического эффекта не зависит от времени отжига образца при 40 С.
