Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ХЛОРФЕНОЛОВ 9
1.1. Физико-химические свойства 9
1.2. Токсичность 12
1.3. Источники поступления в экосистемы 16
2. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДЕСТРУКЦИЯ ХЛОРФЕНОЛОВ 27
3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 33
3.1. Объекты исследования 33
3.2. Физико-химические методы анализа 35
3.2.1. Спектрофотометрическое определение хлорфенолов.. 35
3.2.2. Газохроматографическое определение хлорфенолов,.. 37
3.2.2.1. Определение хлорфенолов в природной воде... 37
3.2.2.2. Определение хлорфенолов в культуральной жидкости 40
3.3. Микробиологические методы 41
3.3.1.Построение калибровочных кривых накопления биомассы 41
3.3.2.Выделение культур микроорганизмов-деструкторов хлорфенолов 43
З.З.З.Изучение морфолого-культуральных и физиологических свойств микроорганизмов
4. ЗАГРЯЗНЕННОСТЬ ХЛОРФЕНОЛАМИ БАССЕЙНА РЕКИ СЕЛЕНГИ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ИСТОЧНИКОВ ИХ ПОСТУПЛЕНИЯ 54
5. ДЕСТРУКЦИЯ ХЛОРФЕНОЛОВ МИКРООРГАНИЗМАМИ ПРУДА-АЭРАТОРА БЦБК 62
5.1, Хлорфенолы в воде пруда-аэратора БЦБК 62
5.2. Деструкция хлорфенолов микроорганизмами пруда-аэратора БЦБК 64
5.3. Морфолого-культуральные и физиологические свойства бактерий-деструкторов хлорфенолов 73
5.4 Разработка биотехнологической схемы очистки сточных вод 78
ВЫВОДЫ 81
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 82
Введение к работе
В связи с актуальностью проблемы охраны озера Байкал, участка мирового природного наследия, большое значение имеют исследования загрязнения водных экосистем токсичными органическими соединениями, источников их поступления и методов утилизации. Хлорфенолы являются;токсичными органическими загрязнителями, поступающими в водные экосистемы со сточными водами и отходами; целлюлозно-бумажной^ химической промышленности, хозяйственно-бытовыми г стоками (Елин, 2001), а также в, результате спонтанного хлорирования природного органического вещества (Naturally Produced Organohalogens, 1995). Согласно разработанному «Перечню вредных веществ; вредных для экосистемы озера Байкал», ХФ относятся к категории «особо опасных» веществ,, содержание которых в воде озера Байкал, и его притоков недопустимо. Между тем, хлорфенолы поступают в озеро Байкал со сточными водами Байкальского целлюлозно-бумажного комбината (БЦБК), расположенного непосредственно на берегу озера. Эти хлорфенолы образуются из лигнина на стадии отбелки целлюлозы хлором (Бейм и др., 1997). После физико-химической и биологической очистки сточные воды БЦБК поступают в пруд-аэратор (конечная стадия очистки),,через который они сбрасываются в озеро Байкал. По данным Комитета природных ресурсов Иркутской области, в 2000 году в озеро Байкал со сточными водами БЦБК поступило 29.7 тонн хлорорганических соединений, в: том числе хлорфенолов. Биотехнологические методы, основанные на, применении активных микроорганизмов-деструкторов, в настоящее время являются одними из наиболее эффективных методов очистки сточных вод от экотоксикантов; Поэтому для интенсификации биологической очистки стоков БЦБК и уменьшения объемов поступления хлорфенолов в экосистему озера Байкал исследование контаминации бассейна озера Байкал хлорфенолами и закономерностей их деструкции аборигенными микробными консорциумами пруда-аэратора БЦБК, адаптировавшихся к высоким концентрациям хлор фенолов, является актуальным.
Работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Байкальского института природопользования СО РАН подпрограммы СО РАН 17.7. «Защита атмосферы, природных вод и почв».
Цель работы. Исследование современного уровня контаминации хлорфенолами водных экосистем бассейна реки Селенги, источников их поступления и разработка биотехнологического способа очистки сточных вод, содержащих хлорфенолы, с применением микроорганизмов пруда-аэратора БЦБК.
Основные задачи:
Определение уровня загрязнения хлорфенолами воды пруда-аэратора БЦБК, озера Байкал в зоне влияния БЦБК, реки Селенги и ее притоков.
Идентификация источников поступления хлор фенолов в исследованные водные экосистемы по соотношениям индивидуальных соединений.
Исследование динамики деструкции 2-хлор фенола, 4-хлорфенола и 2,4-дихлорфенола микроорганизмами ила пруда-аэратора БЦБК;
Разработка биотехнологического способа очистки сточных вод с использованием микроорганизмов-деструкторов хлорфенолов, выделенных из ила пруда-аэратора БЦБК.
Определение морфолого-культуральных и физиологических свойств выделенных микроорганизмов-деструкторов.
Научная новизна работы. В работе впервые получены данные по уровням загрязнения хлорфенолами водных экосистем бассейна реки Селенги с применением дериватизации и газохромато графического определения хлорфенолов в виде бромпроизводных на уровне предельно-допустимых и более низких концентраций. Показано, что присутствие хлорфенолов в природной воде обусловлено локальными антропогенными и природными источниками, для идентификации которых впервые предложено использовать соотношения суммарных концентраций трихлорфенолов и дихлорфенолов, трихлорфенолов и 2-хлорфенола, Выделены активные культуры микроорганизмов-деструкторов хлорфенолов из ила пруда-аэратора БЦБК и определены их морфолого-культуральные и физиологические свойства. Показано, что способность выделенных культур утилизировать хлорфенолы увеличивается в ряду 2-хлорфенол < 4-хлорфенол < 2,4-дихлорфенол. Выявлена перспективность применения активных культур для эффективной биоремедиации стоков БЦБК при концентрациях хлорфенолов до 10 мг/л.
Практическая значимость. Из ила пруда-аэратора БЦБК выделены активные культуры микроорганизмов-деструкторов 2-хлорфенола, 4-хлорфенола и 2,4-дихлорфенола, отнесенные к роду Rhodococcus. Изучены их основные: морфолого-культуральные и физиологические свойства; Консорциум микроорганизмов, выделенный из ила пруда-аэратора БЦБК рекомендован к применению для биологической очистки сточных вод БЦБК от высоких концентраций хлорфенолов. Результаты исследований вошли в отчеты Байкальского института природопользования СО РАН по госбюджетным темам, в отчеты по экспедиционным грантам СО РАН (2000-2003 гг.), по интеграционному проекту СО РАН «Комплексное исследование состояния и динамики развития экосистемы дельты р. Селенга как естественного биофильтра и индикатора современного состояния в условиях интенсификации антропогенного загрязнения озера Байкал» (по итогам 2001 г., утвержден 30.01.02), в отчет по гранту правительства Республики Бурятия для молодых ученых на выполнение НИР по теме «Деструкция хлор фенолов микрофлорой пруда-аэратора Байкальского целлюлозно-бумажного комбината».
Апробация работы. Результаты работы представлялись на международных и региональных конференциях и симпозиумах: «Экология Байкала и Прибайкалья» (г. Иркутск, 2000), «Молодежь и пути России к устойчивому развитию» (г. Красноярск, 2001), Всероссийские научные чтения (к 70-летию со дня рождения члена-корреспондента АН СССР М.В. Мохосоева) (г. Улан-Удэ, 2002), «Вода: экология и технология (ECWATECH-2002)» (Москва, 2002), «Экология и проблемы охраны окружающей среды» (г. Красноярск, 2003), Научно-практическая конференция Восточно-Сибирского государственного технологического университета (г. Улан-Удэ, 2003), «Окружающая среда и здоровье человека» (г. Санкт-Петербург, 2003), «Вторая интеграционная междисциплинарная конференция молодых ученых СО РАН и высшей школы» (Иркутск, 2003), «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водоемов» (Иркутск, 2003), Молодежный Академический Форум «Молодежь и наука Сибири» (г. Чита, 2003 г.), Научно-практическая конференция Бурятского государственного университета (г. Улан-Удэ, 2004), «Биология - наука 21— века» (г. Пушино, 2004),,3-я школа-семинар молодых ученых России «Проблемы устойчивого развития региона» (г. Улан-Удэ, 2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ.
Структура и объем диссертации.
Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав, выводов и списка использованной литературы (88 наименований, в том числе 44 иностранных). Работа изложена на 91 страницах машинописного текста, иллюстрирована 23 рисунками и 16 таблицами.
Физико-химические свойства
Хлорированные фенолы являются ароматическими углеводородами, содержащими в бензольном кольце гидроксильную группу (ОН) и различное число заместителей - атомов хлора (С1). Хлорфенолы при 25С представляют собой твердые вещества, за исключением 2-хлорфенола, являющимся жидкостью (табл. 1.Ш). Поведение хлор фенолов зависит от их физико-химических свойств и условий окружающей среды. Сорбция, испарение и деструкция (фотолиз, химическое окисление и биодеструкция) являются основными процессами, определяющими поступление, перенос и накопление хлорфенолов в природных экосистемах. С увеличением числа атомов хлора в молекуле увеличиваются коэффициент распределения «октанол-вода» (К ) и растворимость в воде. Так, растворимость 2,4-ДХФ в воде составляет 4500 мг/л, 2-ХФ - 20000 мг/л, а растворимость 2,4,6-ТХФ и пентахлорфенола уменьшается до 434 и. 14 мг/л соответственно (табл. 1.1.1). Величина Log(K(,w) увеличивается с 2.17 (2-хлорфенол) до 5.0 (пентахлорфенол). Поэтому, увеличение степени хлорирования повышает степень накопления и концентрирования данных соединений в донных осадках и жировой ткани соответственно. Так, коэффициент биоаккумуляции (bioaccumulation factor -BCF) 2,4-дихлорфенола в форели равен 1.0, в карасе серебряном - 1.53, водорослях - 2.41. Коэффициент биоаккумуляции пентахлорфенола значительно выше и равен 10000 в отдельных видах рыб, 1000 в карасе серебряном, 324 в мидии, 78 в устрицах (Kiefer et al., 1998). Скорость испарения из водного раствора зависит от давления паров соединения и растворимости в воде. 2-хлорфенол обладает самым высоким значением давления паров и, следовательно, испаряется из воды с наибольшей скоростью. Величина рН среды является одним из главных физико-химических факторов, влияющих на поведение хлорфенолов.
С повышением рН среды степень ионизации хлорфенолов увеличивается, которая определяется величиной их константы диссоциации (Ка или рКа). Заместители в бензольном кольце - атомы хлора - относятся к электроноакцепторным заместителям и усиливают кислотные свойства фенолов. Низшие гомологи хлорфенолов характеризуются более высокими значениями рКа (8.49-8.85), и в природных водах данные соединения находятся, главным образом, в недиссоциированной («свободной») форме. Напротив, величины рКа для полихлорированных фенолов ниже (4.7-7.6 8), поэтому, при обычных значениях рН (6.0-8.0) высшие гомологи присутствуют, в основном, в ионизированном виде. С увеличением числа атомов хлора в молекуле также повышается устойчивость (персистентность) соединения. Так, период полураспада дихлорфенолов в пресных водах равен 0.8 часам в летнее время и 3.0 часам в зимнее время, в морских водах 5 и 23 часам соответственно. Период полураспада пентахлор фенола в воде уже изменяется в пределах 20-200 суток (Kiefer et.al., 1998).
Микробиологическая деструкция хлорфенолов
Биотехнологические методы, основанные на применении микроорганизмов-деструкторов, используются для очистки бытовых, промышленных и агропромышленных сточных вод, локальной очистки загрязненных почв. Известно, что присутствие в молекулах связей «галоген-углерод» затрудняет их микробиологическую деструкцию, так как природные соединения редко содержат такие связи. Следовательно, многие хлор органические соединения весьма персистентны и подвергаются крайне медленному, а иногда даже лишь частичному разложению микроорганизмами. Микроорганизмы обладают большим разнообразием ферментов, осуществляющих реакции деструкции различных хлорорганических соединений. Чтобы использовать определенное соединение в качестве единственного источника питания, микроорганизмы синтезируют и поддерживают в активном состоянии специальную систему ферментов; Большинство ферментов подготовительного метаболизма может катализировать не одного, а ряда соединений, т.е. обладает широкой специфичностью (Копытов, Дивавин, 1983; Карасевич, 1982; Реакция гидробионтов на загрязнение, 1983). Способность к деструкции органических соединений у бактерий контролируется внехромосомными элементами наследственности, так называемыми плазмидами (плазмиды деградации, или D-плазмиды) (Воронин, 2000). В зависимости от условий окружающей среды состав и свойства микроорганизмов, входящих в соответствующий консорциум, характеризуются теми или иными особенностями (Громов и др., 1987). Благодаря высокой способности природных консорциумов микроорганизмов адаптироваться к условиям окружающей среды, перспективным направлением исследований является поиск эффективных микроорганизмов-деструкторов токсичных органических загрязнителей и разработка способов биологической очистки сточных вод с использованием микроорганизмов, обладающих определенным набором ферментных систем (Скурлатов и др., 1994; Блинов, 1995; Биотехнология. Принципы и применение, 1988). Это достижимо методами биотехнологии (Grady, Filipe, 2000; Тимофеева, 1999), но при этом необходимо располагать информацией, источником которой являются, прежде всего, природные микроорганизмы, адаптированные к конкретным экологическим условиям.
Скорости, пути и механизмы разложения хлорированных фенолов микроорганизмами зависят от числа и положения атомов хлора в ароматическом кольце, условий; деструкции (аэробных и анаэробных), а также наличия или отсутствия косубстрата. Известно, что мета- и пара-замещенные хлорфенолы в аэробных условиях разлагаются микроорганизмами легче, чем орто-замещенные (Финкельштейн и др., 2000), Однако, в анаэробных условиях скорость биодеструкции монохлорфенолов в донных осадках (Genthner et al., 1990) или в активном иле (в метано генных условиях), напротив, уменьшается, в ряду: орто мета пара- или орто парсомета- при деструкции в анаэробных морских осадках или в почве (Takeuchi et al., 2000).
Помимо положения атомов хлора способность к разложению зависит также от числа заместителей - атомов хлора. Известно, что монохлорфенолы в аэробных условиях разлагаются микроорганизмами легче, чем полихлорированные фенолы. При аэробных условиях скорость деградации хлорфенолов в зависимости от числа атомов хлора уменьшается в ряду: 2-ХФ 4-ХФ 2,4-ДХФ 2,4,6-ТХФ. Но при анаэробных условиях наблюдается обратная зависимость (Atuanya et al., 2000). Анаэробные культуры, способные к дехлоринации полихлорированных фенолов, имеют невысокую способность разлагать монохлорфенолы (Armenante et al:, 1999); Внесение косубстратов имеет большое значение для адаптации микроорганизмов.
Наряду с нетоксичными ростовыми субстратами (глюкоза или глутамат натрия) используют токсичные субстраты, например, фенол (Wang, Loh, 1999). Одновременно с поддержанием роста клеток, ростовые субстраты индуцируют синтез ферментов и кофакторов, требуемых для кометаболизма.
Известно, что в аэробных условиях 2-хлорфенол разлагают бактериальные штаммы; Rhodococcus opacus 1G (Bondar et al., 1999; Финкелынтейни др., 2000), Rhodococcus opacus 1 CP (Финкелыптейн и др., 2000; Моисеева и др., 1999), а также Pseudomonas putida СР1 (Farrell et al,, 2002). Бактерии Rhodopseudomonas palustris осуществляют деструкцию 2-хлорфенола в фототрофных условиях по пути, комбинирующем и аэробные и анаэробные реакции (Kohring et al., 2001). Штамм Rhodococcus opacus 1CP также растет на 3-хлорфеноле, 4-хлорфеноле, 2,4-дихлорфеноле, используя данные соединения в качестве единственного источника углерода и энергии (Финкельштейн и др., 2000). 4-хлорфенол разлагают также бактерии Pseudomonas putida (Farrell et al;, 2002), Acinetobacter. sp. (Wang et al., 2001) и др. Штамм Azotobacter sp. Strain GP1 способен к деградации 2,3,6- и 2,4,6-трихлорфенолов (Deng-Yu et al., 1991). Грибы Coriolus versicolorспособны в аэробных условиях утилизировать 2,4,6-трихлор фенол (Leontievsky et al., 2001). Пентахлорфенол разлагается бактериями рода Pseudomonas, а также грибами Phanerochaete sp. (Lamar et al., 1990).
Объекты исследования
Концентрацию хлорфенолов в КЖ в процессе биодеструкции определяли спектрофотометрически в УФ-области методом калибровочного графика. Для построения калибровочных графиков были приготовлены три рабочих раствора 2-ХФ, 4-ХФ и 2,4-ДХФ с концентрацией 100 мг/л для каждого ХФ. Серия растворов ХФ с концентрацией 5, 10, 15, 20 и 50 мг/л были приготовлены путем разбавления рабочих растворов. Пробоподготовка заключалась в экстракции водной пробы объемом 10 мл этилацетатом в соотношении 1:1 в течение 1 минуты. После разделения и удаления водной фазы отбирали органическую фазу для спектрофотометрического анализа. Для удаления избыточной влаги органическую фазу сушили над безводным сульфатом натрия. Съемка этилацетатных экстрактов проводилась на спектрофотометре Agilent Technologies 8453 UV-VIS в УФ-области поглощения спектра. Характерные полосы поглощения ХФ наблюдаются при 276 нм, 283 нм и 287 нм для 2-ХФ, 4-ХФ и 2,4-ДХФ, соответственно. Для каждого хлорфенола сняты УФ-спектры и построены следующие калибровочные графики (Рис. 3.2,1.1,3.2.1.2, 3.2.1.3).
Определение хлорфенолов в природной воде проводили с применением дериватизации бромированием в кислой среде, экстракционном концентрировании образовавшихся бромпроизводных толуолом и газохроматографическом анализе экстрактов (Коренман и др., 1999, 2000; Груздев, 2001) (Рис. 3.2.2.1.Г.). Объем пробы природной воды, отбираемой для анализа, составлял 1 л. Анализируемую пробу воды подкисляли раствором хлороводовородной (соляной) кислоты до рН 2-3. Исходный объем пробы делили на две равные части (по 500 мл), в одну из которых вводили стандартную добавку аттестованного образца состава раствора фенола или хлорфенолов: масса вносимой добавки по каждому определяемому соединению составляла 0.2 мкг. Все последующие операции выполняли на магнитной мешалке ММ-5 сначала для одной, затем для другой части пробы:
1. Бромировапие; добавляли бромную воду; расчетная концентрация брома в пробе - 0.0002 моль/л. Бромировапие проводили в течение 1 минуты. После завершения бромирования, избыток брома удаляли раствором тиосульфата натрия; расчетная концентрация в пробе- 0.0002 моль/л.
2. Экстракция: бромпроизводные экстрагировали 1 мл толуола и экстрагировали в течение 10 минут на магнитной мешалке. 1 мкл экстракта анализировали на газовом хроматографе Hewlett-Packard HP 6890 (электронозахватный детектор с микроячейкой, капиллярная колонка HP 5 длиной 30 м, с внутренним диаметром 0.32 мм). Условия
газохроматографического определения: температура испарителя - 250С, температура детектора - 330С, газ-носитель - гелий, поддув детектора азотом - 60 мл/мин, без деления потока. Температура термостата колонки увеличивалась от 40С (время выдержки - 2 мин) до 70С (время выдержки -1 мин) со скоростью 30С/мин, далее до 200С (время выдержки - 3 мин) со скоростью 20С/мин и до 255С (время выдержки - 1 мин) со скоростью 20С/мин. В экстрактах были определены следующие хлор фенолы: 2-ХФ, 2,4-ДХФ, 2,6-ДХФ, 2,4,5-ТХФ, 2,4,6-ТХФ и ПХФ. Использовались стандарты фенолов производства ЗАО «НПО Экрос» (г. Санкт-Петербург). Концентрацию индивидуальных соединений в пробе рассчитывали методом стандартной добавки (Новак, 1978), заключающемся в прямом измерении величин концентрации в исходной пробе, обогащенной определённым добавлением определяемого соединения.
