Введение к работе
Актуальность проблемы. Эндогенные ретровирусы и ретротранспозоны, будучи интегральной частью эукариотического генома, как правило, занимают около 10%, а в некоторых случаях до 50% генома. Их способность к транспозициям и горизонтальному переносу представляет один из основных факторов генетической нестабильности и пластичности генома, а в рамках отдельного организма может привести к развитию ряда заболеваний животных и человека. В настоящее время с активностью эндогенных ретровирусов связывают ряд психосоматических расстройств, включая шизофрению (T. Christensen, 2010), гипертонию, аутоиммунные заболевания (D.H. Dreyfus, 2011), появление некоторых видов опухолей, псориаз (R. Sarid and S.J. Gao, 2011) и т.д. Кроме того, в вероятности межвидового переноса эндогенных ретровирусов таится главная опасность ксенотрансплантации клеток свиньи, несмотря на то, что подобный подход имеет большой потенциал для лечения многих заболеваний человека, включая замену органов и диабет (J. Denner, 2011). Прогресс в изучении эндогенных ретровирусов имеет фундаментальную и теоретическую значимость для ветеринарной вирусологии и генетики и важен с хозяйственной точки зрения, например, для понимания причин многолетнего персистирования вируса лейкоза в российской популяции крупного рогатого скота.
Наиболее удобной моделью для изучения эндогенных ретровирусов на сегодняшний день является ретровирус дрозофилы (эрантирвирус) gypsy (его другое название – МДГ4). Интерес к изучению gypsy определён его довольно активной экспрессией, высокой частотой транспозиций и амплифицированностью в геноме. Именно на примере gypsy впервые была установлена способность эндогенного ретровируса перемещаться не только внутри генома, но и между разными клетками и организмами. Межклеточные перемещения gypsy явились одним из первых примеров трафика вируса, независимого от белков оболочки вирусной частицы. Сейчас это явление подтверждено многими примерами, а механизмы, лежащие в его основе, развиты в теорию экзосомной стратегии распространения вируса (S.J. Gould et al., 2003).
Изучение молекулярной архитектуры вирусных и вирусоподобных частиц, образуемых эндогенными ретровирусами, актуально для развития новейших нанобиотехнологий. В последние годы стало очевидным, что свойства структурного белка ретровирусов (как и некоторых других вирусов) можно использовать при разработке рекомбинантных вакцин, а также систем доставки в клетку нуклеиновых кислот или иных биологически активных молекул. В частности, в последнее десятилетие показано, что структурный белок (Gag) ряда ретровирусов способен самостоятельно формировать вирусоподобную частицу вне зависимости от каких либо факторов эукариотической клетки, упаковывать вовнутрь частицы нуклеиновые кислоты и/или экспонировать на поверхности собранной частицы гетерологичный пептид.
Цель работы. Выявить функциональные особенности эндогенного ретровируса gypsy (МДГ4) и образуемых им частиц.
Основные задачи исследования.
1. Разработать тесты на примере gypsy для выявления способности эндогенного ретроэлемента сохранять свою генетическую информацию во внеклеточной форме в виде вирусоподобных частиц.
2. Разработать систему, моделирующую «экзогенизацию» эндогенного ретровируса. Изучить на примере gypsy и родственного ему ретротранспозона МДГ3 способность к межклеточной передаче эндогенных ретровирусов.
3. Исследовать функции структурного белка gypsy (Gag) в процессе межклеточной передачи частиц ретроэлемента.
4. Клонирование и экспрессия в гетерологичных системах структурного белка ретровируса gypsy; разработать технологию его очистки.
5. Определить принципы образования мономерами Gag вирусоподобных частиц.
Научная новизна работы. В представленной диссертационной работе на примере gypsy обобщен опыт моделирования функциональных особенностей эндогенного ретровируса. Исследованы функции частиц, образуемых gypsy и ретротранспозоном МДГ3, принадлежащим к группе gypsy. Впервые обнаружен феномен межклеточного переноса ретроэлементов от одной клетки к другой. На основе культивируемых соматических клеток была разработана система, позволяющая моделировать межклеточный перенос эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов и определять частоту таких событий. Установлено, что межклеточные перемещения эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов происходят без какой либо предварительной стимуляции реципиентных или донорных клеток.
Экспериментально доказана возможность межвидовой передачи эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов их вирусоподобными частицами. Раскрыто, что межвидовой процесс передачи не зависит от гена env, а структурный белок ретровируса может обеспечить его медленные межклеточные перемещения.
Обоснована теория о том, что ряд белков, кодируемых геномом клетки-хозяина, может использоваться структурными белками ретроэлемента для выхода из клеток или проникновения в них. В рамках теории о том, что взаимодействие структурного белка ретроэлемента с клеточными белками-партнёрами может регулироваться его фосфорилированием, изучена кинетика взаимодействия казеиновой киназы типа 2 (СК2) cо структурным протеином gypsy;
Была клонирована нуклеотидная последовательность, кодирующая структурный белок (Gag) ретровируса gypsy. Gag gypsy был впервые экспрессирован в гетерологичных системах, используя бактериальные (Е. coli) и эукариотические (S. frugiperda) клетки.
Продемонстрированы подходы для изучения молекулярной архитектуры частиц, образуемых структурными белками ретровирусов типа gypsy. Проведён теоретический и экспериментальный анализ функциональных областей структурного белка gypsy. Экспериментально определена функция нуклеокапсида в формировании частиц gypsy и раскрыт механизм мультимеризации мономеров Gag в вирусоподобные частицы.
Полученные результаты закладывают фундаментальную базу для разработки стратегий борьбы с рядом медленно развивающихся болезней человека и животных, определенных межвидовым и неспецифическим распространением вирусов.
Вклад автора в развитие отечественной биологической науки был отмечен Главной Премией МАИК “Наука/Интерпериодика” в области биологии за 2004 г. С обоснованием такого решения можно ознакомиться по следующей ссылке:
Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость работы заключается в обнаружении феномена межклеточного переноса ретроэлементов и межвидовой передачи эндогенных ретровирусов. Показано, что такой перенос определен вирусоподобными частицами ретроэлементов. Принципиальным является результат, раскрывающий, что процесс межклеточной передачи частиц ретроэлементов не всегда зависит от гена env, несмотря на то, что классическая схема предусматривает необходимость гликопротеина Env для инфекционности ретровируса. Развита теория о том, что ряд белков, кодируемых геномом клетки-хозяина, может использоваться структурными белками ретроэлемента для выхода из клеток или проникновения в них.
Практическая значимость работы состоит в том, что на основе структурного белка ретровируса gypsy и конструкций, позволяющих его экспрессию в гетерологичных системах экспрессии, разработаны принципы построения биотехнологичных глобулярных наночастиц. Кроме того, в рамках диссертационной работы впервые предложены для научно-исследовательских работ следующие технологии:
На культурах клеток разработана система для моделирования распространения вируса и вирусоподобных наночастиц;
Разработаны методы очистки казеиновой киназы типа 2 (СК2) из культуры клеток и фосфорилирования мономеров Gag in vitro;
Предложен метод лиганд-блоттинга, позволяющий детектировать структурные белки вирусов. Эта технология защищена патентом;
Разработаны методологические основы получения вирусоподобных частиц в эукариотической системе экспрессии и их очистки;
Получены и очищены глобулярные белковые наночастицы в бактериальной системе экспрессии;
Предложена технология получения глобулярных белковых наночастиц из мономеров белка in vitro;
Определена минимальная последовательность Gag gypsy, необходимая для производства рекомбинантной белковой наночастицы.
Методология диссертационной работы может помочь в изучении ряда медленно развивающихся заболеваний животных и человека, имеющих вирусную этиологию, например лейкоза КРС и аденомотоза овец. Разработанные в рамках диссертации генно-инженерные наночастицы могут послужить основой для создания рекомбинантных вакцин нового поколения и разработки молекулярных носителей для доставки биологически активных веществ в клетку.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Экспериментально доказано, что геном беспозвоночных населяют эндогенные ретровирусы, также как геном млекопитающих.
2. Обнаружен феномен межклеточного перемещения ретроэлементов от одной соматической клетки к другой и межвидовая передача эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов. Показано, что такой перенос определен вирусоподобными частицами ретроэлементов. На модели культивируемых клеток разработана система, моделирующая процесс межклеточных перемещений эндогенного ретровируса.
3. Процесс межклеточной передачи частиц ретротранспозонов не связан с геном env, несмотря на то, что классическая схема предусматривает необходимость гликопротеина Env для распространения ретровируса. Межклеточные перемещения частиц эндогенного ретровируса могут быть определены его структурным белком, т.е. обнаружен альтернативный путь распространения ретровируса, обеспечивающий его межвидовую передачу.
4. Ряд белков, кодируемых геномом клетки-хозяина, может использоваться структурными белками ретровируса для выхода из клеток или проникновения в них. Определены несколько клеточных белков, взаимодействующих с Gag gypsy: убиквитин, SUMO и казеиновая киназа типа 2.
5. Gag gypsy способен образовывать вирусоподобные частицы в гетерологичной эукариотической системе экспрессии. Он самодостаточен для мультимеризации в глобулярные частицы без участия каких-либо факторов эукариотической клетки, поскольку, экспрессированный в бактериях, способен также образовывать частицы.
6. Нуклеокапсид существенно влияет на организацию частиц Gag gypsy, и эту функцию определяет последовательность аминокислотных остатков на его N-конце (проксимальная часть нуклеокапсида). Формирование частиц эффективно происходит в присутствии РНК или однонитевых олигонуклеотидов произвольной последовательности.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на 3-ем и 4-ом Всероссийском симпозиуме по генетике культивируемых соматических клеток, Москва, 1986 г. и Москва-Звенигород, 1989 г.; на 2-ом Европейском конгрессе по клеточной биологии, Будапешт, 1986 г.; на 2-ом Всероссийском сипозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов» Москва, 1987 г.; на 6-ом Всероссийском симпозиуме по проблемам биологии и генетики дрозофилы, Одесса, 1989 г.; на Международном симпозиуме «Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии». Москва-Самарканд. 1991 г.; на 42-й и 50-й Ежегодной конференции по исследованиям на дрозофиле, Вашингтон, США, 2001 г. и Чикаго, США, 2009 г.; 4-ом Международном симпозиуме по исследованиям ретровирусного нуклеокапсида, 2003 год, Страсбург, Франция; Международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний», Новосибирск, 2004 г.; 23-ей Российской конференции по электронной микроскопии, Черноголовка, 2010 г.; Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционных болезней молодняка и других возрастных групп сельскохозяйственных животных, рыб и пчел», посвящённой 50-летию со дня основания лаборатории лейкозологии, лаборатории ихтиопатологии и отдела охраны полезной энтомофауны ВИЭВ, Москва, 2011 г.; и др.
Личный вклад автора. На всех этапах диссертационного исследования от постановки задач до выполнения основных результатов роль автора была основной. Участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 39 печатных работ, в том числе 25 статей в рецензируемых научных журналах и патент на изобретение.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 245 страницах, содержит 8 таблиц, 48 рисунков и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, рекомендаций по использованию научных выводов и списка цитируемой литературы. Список цитированной литературы состоит из 427 ссылок.
