Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Биологические и биохимические особенности ракообразных отряда Decapoda 11
1.1. Линька ракообразных 11
1.2. Химический состав организма камчатского краба 21
1.3. Биохимические изменения в органах и тканях камчатского краба в ходе линочного цикла 22
1.3.1. Гепатопанкреас 22
1.3.2. Гемолимфа 28
1.3.3. Экзоскелет 28
1.4. Культивирование ракообразных и использование специализированных кормовых продуктов 40
1.5. Экологический аспект 50
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 54
2.1. Объекты исследования 54
2.2. Биохимические исследования 55
2.3. Биологические исследования 66
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 69
3.1. Биохимические исследования 71
3.1.1. Исследование липидного состава гепатопанкреаса 71
3.1.2. Исследование комплекса ферментов гепатопанкреаса камчатского краба 82
3.1.3. Исследование белка гемолимфы камчатского краба 100
3.1.4. Исследование физико-химических свойств хитин-белкового комплекса панциря акклиматизированного камчатского краба в зависимости от межлиночной стадии 106
3.2. Специализированные корма для ракообразных
3.3. Исследование показателей безопасности хитин-содержащего сырья 115
ВЫВОДЫ 118
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 120
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 121
Приложение
Введение к работе
Актуальность исследования. Культивирование камчатского краба Paralithodes camtschaticus – это новое направление в марикультуре. Ввиду того, что ракообразные заметно отличаются от других объектов аквакультуры (рыб и моллюсков), их культивирование в искусственных условиях должно базироваться на оригинальных подходах, разработка которых требует детального изучения биохимических процессов, происходящих в их организме в ходе линочного цикла. Разработка системы контроля физиологического состояния крабов, включающая в себя ряд биохимических показателей органов и тканей, а также оценки эффективности технологии культивирования ракообразных являются крайне актуальными.
Одной из важных проблем, возникающих при культивировании ракообразных, в частности камчатского краба, является преодоление линьки. Для ракообразных этот процесс является наиболее энергозатратным и часто сопряжен с фатальным исходом. Выжившие после линьки особи с ограниченной подвижностью и неокрепшим панцирем при совместном содержании подвержены каннибализму со стороны еще не линявших или уже окрепших особей.
В настоящее время весьма актуальна задача разработки рецептур специализированных кормов, включающих продукты переработки ракообразных: хитин-белковый комплекс, белковый гидролизат и хитозан, позволяющих адекватно заменить естественный рацион для личинок, мальков, и взрослых особей камчатского краба. Введение в рацион крабов кормов, содержащих низкомолекулярный хитозан, обладающий росто- и иммуностимулирующими свойствами, позволило бы повысить естественную резистентность культивируемых особей и выживаемость их после линьки, а также ослабить негативное влияние каннибализма.
Для получения низкомолекулярного хитозана лучше использовать собственные ферментные комплексы краба, обладающие субстратной специфичностью и хитинолитической активностью в отношении хитозана ракообразных, чтобы свойства получаемого вещества были наиболее близки к свойствам аналога, образующегося в организме краба естественным путем. Известно, что ферментный комплекс, выделенный из гепатопанкреаса камчатского краба, проявляет гидролитическую активность в отношении крабового хитозана, которая обусловлена наличием карбогидраз и протеиназ (Ильина и др., 2009).
Существующая общепринятая на промысле беспозвоночных система оценки межлиночной стадии крабов в условиях культивирования оказывается несостоятельной, поскольку используемые в ней параметры, такие как исчерченность панциря и количество обрастателей неадекватны при бассейновом содержании. Это ставит задачу разработки системы объективных биохимических показателей для более точного определения межлиночной стадии крабов.
Важным аспектом наших исследований стала разработка экологически безопасного способа переработки панцирьсодержащих отходов (ПСО) камчатских крабов в местах культивирования, добычи и переработки. Гепатопанкреас крабов, также являющийся отходом переработки, может быть использован для проведения гидролиза белковой части хитин-белкового комплекса (ХБК) и хитозана, что направит в производство новые источники сырья для получения биологически активных препаратов различного назначения.
Целью настоящей работы является получение из гепатопанкреаса, гемолимфы и панциря камчатского краба биологически активных веществ и определение биохимических индикаторов физиологического состояния культивируемых ракообразных, а также разработка рецептур специализированных кормов для ракообразных, отвечающих их естественным рационам и содержащих хитозан в качестве ростостимулирующего агента.
Для достижения поставленной цели были определены следующие основные задачи:
- провести комплексное исследование биологически активных веществ, способных служить параметрами для оценки физиологического состояния камчатского краба в процессе культивирования: липидов и ферментов гепатопанкреаса, хитин-белкового комплекса панциря, белков гемолимфы;
- получить in vitro низкомолекулярный хитозан с использованием ферментного комплекса из гепатопанкреаса камчатского краба;
- разработать рецептуры кормов для ракообразных;
- предложить способ безотходного использования культивируемых и промысловых ракообразных;
- разработать комплексную методику отбора проб органов и тканей камчатского краба для биохимических исследований.
Научная новизна. Впервые определены биохимические индикаторы в комплексе для контроля физиологического состояния культивируемого камчатского краба, а также для оценки эффективности технологии культивирования: общее содержание липидов и содержание 3 и 6 полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) в гепатопанкреасе, протеиназная и хитобиазная активности в экстракте гепатопанкреаса, суммарное содержание белка в гемолимфе, температуры первого и второго стеклования ХБК панциря.
Впервые исследованы закономерности изменения липидного состава гепатопанкреаса, а также специфических и неспецифических хитинолитических активностей ферментов гепатопанкреаса камчатского краба на различных стадиях линочного цикла.
Впервые исследована зависимость степени кристалличности ХБК панциря камчатского краба от межлиночной стадии.
Впервые разработана рецептура специализированных кормов для ракообразных с использованием ХБК и низкомолекулярного хитозана.
Разработана методика комплексного отбора проб органов и тканей камчатского краба для биохимических исследований биологически активных веществ, способных служить индикаторами физиологического состояния культивируемых ракообразных, а также являющихся компонентами кормов.
Практическое значение. Разработанные биохимические индикаторы дают возможность оценки физиологического состояния камчатского краба в процессе культивирования и эффективности методов их культивирования. Полученные результаты позволяют определять межлиночную стадию краба по биохимическим показателям.
Полученные результаты легли в основу рекомендаций по составлению рецептур специализированных кормов для ракообразных.
Введение в рацион культивируемых ракообразных разработанных нами кормов, содержащих низкомолекулярный хитозан в качестве ростостимулирующего агента, позволит повысить их выживаемость после линьки, и рентабельность процесса культивирования камчатского краба в целом.
Предложен экологически безопасный способ переработки ПСО культивируемых и промысловых крабов. Показано, что гепатопанкреас крабов может быть использован для гидролиза белковой части ХБК панциря и хитозана с целью получения компонентов специализированных кормов для ракообразных.
Основные положения. На основе биохимических исследований гепатопанкреаса, гемолимфы и панциря камчатского краба установлены параметры для оценки его физиологического состояния в процессе культивирования.
Обосновано введение в специализированные корма для ракообразных компонентов, свойственных их естественным рационам: ХБК, белкового гидролизата, хитозана, полученных из гепатопанкреаса и панциря ракообразных. Введение низкомолекулярного хитозана в корма для ракообразных оказывает ростостимулирующее действие.
Апробация. Основные положения диссертационной работы доложены на 2-й и 3-й Международных научно-практических конференциях: «Пищевая и морская биотехнология: реализация, проблемы, перспективы» (Калининград, 2006, 2008), на XIII & XIV Seminar and Workshop “New Aspects of the Chemistry and Applications of Chitin and its Derivatives” (Wroclaw, 2007, Olshtyn, 2008), на международной конференции «Aquaculture Europe» (Стамбул, 2007), на 3 Международной научно-практической конференции «Морские прибрежные экосистемы. Водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки» (Владивосток, 2008), на 9-й международной конференции Европейского хитинового общества «Forthcoming Euchis - 2009» (Венеция, 2009), международной конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК.
Личный вклад автора: участие в планировании и постановке экспериментов, разработка методики отбора проб органов и тканей камчатского краба, пробоподготовка, исследование липидного состава гепатопанкреаса, оценка специфической и неспецифической хитинолитической активности в экстракте гепатопанкреаса, изучение белкового состава гемолимфы, изучение процесса гидролиза крабового хитозана ферментным комплексом из гепатопанкреаса краба, участие в разработке рецептур специализированных кормов, математическая обработка, анализ и интерпретация полученных результатов, написание научных статей, докладов и презентаций, участие в конференциях.
Структура и объём диссертации. Диссертация содержит введение, обзор литературы, методическую часть, раздел результатов и их обсуждения, выводы, практические рекомендации, список литературы, приложение. Работа изложена на 129 страницах, содержит 36 таблиц и 33 рисунка, библиографию из 151 наименования, в том числе 58 на иностранном языке.
Благодарности. Автор выражает благодарность к.х.н. Ильиной А.В., к.х.н. Сидорову Н.Н., д.х.н. Урьяшу В.Ф., всем сотрудникам лаборатории инженерии ферментов Центра «Биоинженерия» РАН, лаборатории термохимии Института химии Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского, а также сотрудникам лаборатории «Воспроизводства и культивирования ракообразных» ВНИРО за содействие в проведении данной работы.
Линька ракообразных
Современные технологии культивирования ракообразных предусматривают регулирование всех жизненно важных процессов объекта разведения. Биологической особенностью развития ракообразных является линька, при которой сменяется не только экзоскелет, но и минерализованные части внутренних органов и хитиновые пластинки («сухожилия»), расположенные в мускулах. Линька определяет скорость роста ракообразных и представляет собой повторяющийся процесс биоконверсии всех тканей и органов их организма, результатом которого становится его бурный рост.
В природе внешним показателем близости линьки у взрослых особей камчатского краба обоих полов служит степень загрязненности панциря отложениями неорганических солей, в особенности покровов коксоподитов ходильных ног, густо окрашенных в коричневый и коричнево-черный цвет, обрастание эпибионтами и желтый или темно-бурый цвет жабр. Кроме того, на нижних поверхностях коксоподитов, соприкасающихся с грунтом, появляется характерная насечка, представляющая собой глубокие царапины панциря, окрашенного в темно-коричневый цвет. Дополнительным признаком давности линьки у самок может служить стадия развития икры. Число ежегодных линек изменяется с возрастом животного (Marukawa, 1933). Мальки на первом году жизни линяют 11-12 раз, а далее число ежегодных линек уменьшается до 2-х - 3-х раз на четвертом-седьмом году жизни. По мере приближения к половой зрелости краб начинает медленнее увеличиваться в размерах и линяет 1 раз в год. Начиная с 12-13-летнего, возраста часть самцов может линять даже 1 раз в 2 года. Линька у половозрелых крабов имеет сложную природу и для животных различного размера вероятность ее не одинакова. За счет этого они линяют через разные промежутки времени, что делает практически невозможным определение точного возраста краба и межлиночной стадии по его размерам (Левин, 2001).
Процесс линьки происходит следующим образом: продолжительность сбрасывания панциря составляет 4-10 минут. Перед линькой у особи раздувается абдомен и животное замирает. В момент начала линьки над первым абдоминальным сегментом надрывается мембрана, карапакс и брюшной сегмент начинают разделяться, разрывая мембрану дальше и открывая отверстие, через которое протискивается наружу тело краба в новом мягком панцире, совершая растягивание и сжатие конечностей (Виноградов, 1945; Иванов, 1955; Stevens, 2001). При этом происходит полная смена всего хитинового покрова: спинной панцирь, покровы брюшной стороны и ног, выстилка желудка (желудочная мельница) и задней кишки, а также хитиновые сухожилия мышц. Старые наружные чехлы антенн, глаз, жабр, желудка, сухожилия ног и ротовой аппарат остаются целиком на сброшенном панцире (экзувии).
После линьки происходит значительное ослабление всего организма, особенно мускулатуры. Происходит это за счет большой потери энергии, а также всасывания расширившимися тканями тела значительного количества воды. В течение нескольких недель после линьки сочленения ног очень слабы, из-за чего в процессе промысла животные часто травмируются, теряют части конечностей или конечности целиком. Панцирь краба еще долго остается эластичным, а мясо водянистым. Чтобы окончательно окрепнуть и войти в жизнестойкую кондицию крабу требуется при хорошем питании около двух недель. В целом, продолжительность первых трех стадий линьки у камчатского краба составляет около месяца. На рис. 1 Представлены только что перелинявший краб и сброшенный им экзувий.
Объекты исследования
Камчатский краб. Ввиду лимитирования научных квот на вылов водных биоресурсов и для рационального использования биотехнологического материала мы разработали комплексный подход для отбора проб органов и тканей камчатского краба.
Образцы органов и тканей отбирали с 2005 по 2009 г. у особей камчатского краба, акклиматизированного в Баренцевом море и содержавшегося в бассейновом комплексе (ООО «Северный проект», пос. Видяево) в течение 4-5 месяцев (с сентября по февраль).
Условия содержания: проточная система водоснабжения, забор воды с глубины 30 м, температура морской воды 2,5-6С, соленость - 34 %о, рацион - филе свежемороженой сельди. Помимо этого отбор проб органов и тканей крабов проводили во время учетной ловушечной съемки в Баренцевом море в районах Рыбачьей и Кильдинской банок (N 69 19 78-70 08 68; Е 31 19 78 -33 47 20), а также в ходе промыслового лова в Западно-Прибрежном и Восточно-Прибрежном районах (N 68 ЗГ16 - 69 23 28; Е 35 48 61 - 38 56 35) в сентябре-октябре 2006 года. Рейс осуществляли в соответствии с тематическим планом ВНИРО в Исключительной экономической зоне (ИЭЗ) России с целью изучения распределения и состояния запасов камчатского краба, а также пространственно-временных закономерностей формирования и распределения скоплений в зависимости от условий внешней среды и воздействия промысла. Образцы отбирали у особей, добытых ловушечньгм способом. Порядки ловушек выставляли на глубинах от 164 до 299 м. В качестве приманки использовали сельдь свежемороженую рубленую, а также рыбный фарш. Крабы находились в ловушках не более 3-х суток. Отбирали особей с четко выраженными признаками межлиночных стадий, с шириной карапакса не менее 160 мм.
Пробы органов и тканей ракообразных отбирали препаративно по разработанной нами методике (Приложение 1). Для биохимических исследований отбирали пробы панциря, гемолимфы, гепатопанкреаса и мышечной ткани крабов на разных межлиночных стадиях, содержавшихся в течение длительного времени (5-6 месяцев) в искусственных условиях с проточной и замкнутой системой водоснабжения, а также крабов различных природных популяций, добытых промышленным способом.
Для исследований отбирали пререкрутов с шириной карапакса от 132 до 150 мм и массой от 1430 до 2290 г и промысловых самцов с шириной карапакса от 150 до 217 мм и массой от 2630 до 5870 г, на всех межлиночных стадиях.
Гигантская пресноводная креветка. Для апробирования экспериментальных кормов использовали постличинок гигантской пресноводной креветки со средним размером 1,5 см и личинок камчатского краба II стадии, полученных в искусственных условиях в аквариальном комплексе лаборатории воспроизводства ракообразных ВНИРО.
Биохимические исследования
Гепатопанкреас ракообразных содержит значительное количество липидов, общее содержание и фракционный состав которых подвержен заметным изменениям в зависимости от межлиночнои стадии, что дает основание считать эти характеристики показательными для точного определения межлиночнои стадии краба.
Задачей данного исследования являлось определение липидного состава гепатопанкреаса камчатского краба, выявление аналитически значимых различий в количественном содержании компонентов в зависимости от межлиночнои стадии.
Исследования проводили в несколько этапов. Для начала были отобраны два образца гепатопанкреаса камчатского краба. Характеристики образцов представлены в табл. 9.
Для последующих экспериментов нами были отобраны 8 и 11 образцов гепатопанкреаса камчатского краба на 1-ой, 2-ой 3-ей и 4-й межлиночных стадиях. Основные характеристики образцов представлены в табл. 10. Подбор проб был продиктован сезоном линьки подопытных животных, когда большая часть особей находилась в предлиночном, линочном и послелиночном состоянии. Пробы отбирали с февраля по апрель 2006 года.
Содержание крабов в одинаковых условиях культивирования: с одинаковым рационом и идентичных температурах (4-7 С), на протяжении 5-6 месяцев дает возможность сравнивать липидные показатели гепатопанкреаса.
Данные литературы свидетельствуют о том, что липиды гепатопанкреаса камчатского краба изучали без корреляции с межлиночными стадиями, в связи с чем, в данных разных авторов наблюдается разброс показателей. Это может быть связано не только с физиологическим состоянием крабов, но и с районом и сезоном вылова, а также влиянием других факторов. Так, одни авторы считают, что общее содержание жира в гепатопанкреасе составляет 16,7 % (гепатопанкреас составляет 5% массы тела животного) (Справочник по химическому составу, 1999), а другие указывают на содержание жира - 3,7-15,7 % в зависимости от сезона (Зима — 9,3; Весна - 3,7, Лето - 8,91, Осень - 15,7) при массе гепатопанкреаса по отношению к массе тела краба: 4-8% (Камчатский краб..., 2003). По другим данным общее содержание жира в гепатопанкреасе составляет 13-20 % (Акулин, 2005).
