Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из важных и актуальных задач биоорганической химии является исследование высокомолекулярных биорегуляторов и выяснение взаимосвязи между их структурой и биологической активностью. Пектины и сульфатированные полисахариды являются физиологически активными биополимерами, строение макромолекул которых обусловливает их активность (Toida et al., 2003; Оводов и др., 2009; Попов, 2010). Наличие сульфатных групп и их распределение обусловливает не только полианионный характер сульфатированных полисахаридов, но и их антикоагулянтные свойства (Hirsh et al, 2005; Coombe et al., 2005). В клинической практике в качестве антикоагулянта используется гепарин, сульфатированный полисахарид животного происхождения, существенными недостатками применения которого являются сложность стандартизации его состава и возможность передачи споровых форм бычьего энцефалита человеку (Hirsh et al., 2004; Diaz-Nido et al., 2002). Поэтому ведется поиск аналогов гепарина среди полисахаридов растительного происхождения. Однако антикоагулянтная активность исследованных к настоящему времени природных и синтетических сульфатированных полисахаридов, полученных на основе целлюлозы (Wang et al., 2007), декстранов (Huynh et al., 2001) и пуллуланов (Mahner et al., 2001), ниже активности гепарина. Вероятно, антикоагулянтная активность сульфатированных полисахаридов обусловлена не только наличием сульфатных групп и их распределением, но и строением углеводных цепей полисахаридов, присутствием других функциональных заместителей, их положением и распределением. Большинство синтетических аналогов гепарина представляют собой производные нейтральных полисахаридов, и строение их макромолекул отличается от строения гепарина, в состав которого входят остатки гликуроновых кислот. Остатки галактуроновой кислоты являются главными структурными компонентами углеводных цепей пектиновых полисахаридов, поэтому сульфатирование пектинов позволит получить производные, максимально приближенные по структуре к гепарину. Более того, манипуляция условиями экстракции дает возможность получать пектины гомогенные по составу и молекулярной массе.
Цель работы:
Получение сульфатированных производных пектинов и определение влияния сульфатных групп на их свойства.
Задачи исследования:
-
Разработать метод сульфатирования пектиновых полисахаридов.
-
Получить набор сульфатированных производных с различной молекулярной массой и степенью сульфатирования на основе пектинов, отличающихся строением углеводных цепей.
-
Определить влияние степени замещения сульфатированных производных пектинов на их физико-химические свойства.
-
Определить влияние степени сульфатирования и молекулярной массы полученных производных пектинов на их способность связывать липопротеины низкой плотности.
-
Установить влияние степени сульфатирования полученных производных пектинов на их антикоагулянтную активность.
Положения, выносимые на защиту:
-
-
Сульфатирование пектиновых полисахаридов хлорсульфоновой кислотой обеспечивает получение производных с высокой степенью замещения.
-
В процессе сульфатирования пектиновых полисахаридов происходит замещение гидроксильных групп при втором и третьем атомах углерода остатков галактуроновой кислоты.
-
Степень связывания липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) зависит от количества сульфатных групп и молекулярной массы сульфатированных производных пектинов. Наибольшей способностью связывать липопротеины низкой плотности обладают сульфатированные производные пектинов с молекулярной массой выше 200 кДа, содержащие две сульфатные группы в одном мономерном звене.
-
Сульфатирование пектинов приводит к появлению антикоагулянтной активности, нехарактерной для пектинов, которая зависит от количества сульфатных групп, введенных в состав их макромолекулы.
Научная новизна. Впервые на основе пектиновых полисахаридов получен набор сульфатированных производных с различной молекулярной массой и с различным содержанием сульфатных групп.
Впервые показано, что при сульфатировании пектиновых полисахаридов происходит замещение гидроксильных групп при втором и третьем атомах углерода остатков галактуроновой кислоты.
Впервые установлено, что сульфатированные производные пектиновых полисахаридов обладают антикоагулянтной активностью, отсутствующей у исходных пектинов.
Впервые установлено, что способность сульфатированных производных пектинов связывать ЛПНП зависит от степени их сульфатирования и молекулярной массы.
Теоретическая и практическая значимость. Результаты исследования вносят вклад в понимание взаимосвязи между структурой полисахаридов, их физико-химическими свойствами и физиологической активностью. Выявлено, что введение сульфатных групп в макромолекулу пектинов изменяет их реологические свойства и физиологическую активность. Присутствие сульфатных групп в макромолекуле пектинов уменьшает их характеристическую вязкость и увеличивает растворимость в воде, а также приводит к появлению у них антикоагулянтных свойств, не характерных для пектинов. Кроме того, введение сульфатных групп повышает способность пектинов связывать ЛПНП, при этом степень связывания зависит от количества сульфатных групп и от молекулярной массы полисахарида.
Разработан оптимальный метод сульфатирования пектинов и показано, что, манипулируя условиями реакции сульфатирования, можно регулировать глубину замещения и получать на основе пектиновых полисахаридов сульфатированные производные с разным содержанием сульфатных групп. При сульфатировании пектинов происходит замещение гидроксильных групп при втором и третьем атомах углерода остатков галактуроновой кислоты с преимущественным первоначальным замещением по второму положению.
Полученные результаты позволяют расширить исследования по созданию антикоагулянтных препаратов на основе пектиновых полисахаридов.
Полученные данные об антикоагулянтной активности и способности сульфатированных производных пектинов связывать ЛПНП в большей степени, чем гепарин, открывают перспективы для использования их в медицинской практике при гемодиализе.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены лично в виде устных и стендовых докладов на II-ой Международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (г. Алма-Ата, Казахстан, 2007 г.), III-ей Всероссийской научной конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (г. Барнаул, 2007 г.), III-ей Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (г. Уфа, 2008 г.), XII-ой Всероссийской молодежной школе-конференции «По актуальным проблемам химии и биологии» (г. Владивосток, 2009 г.), VIII-ой Молодежной научной конференции Института физиологии Коми НЦ УрО РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (г. Сыктывкар, 2009 г.), VI-ой Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (г. Санкт-Петербург, 2010 г.), VII-ой Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (г. Сыктывкар, 2011 г.), 16-ом Европейском симпозиуме по углеводам (г. Сорренто-Неаполь, Италия, 2011 г.).
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ, в том числе две статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ, и один патент Российской Федерации.
Личный вклад автора. Вклад в работы, выполненные в соавторстве и включенные в диссертацию, состоял в проведении анализа литературы, планировании экспериментов, получении экспериментальных данных, интерпретации и систематизации полученных результатов и оформления их для публикации. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль автора была определяющей.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав: обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 199 источников, в том числе 162 на английском языке. Работа изложена на 125 страницах, содержит 34 рисунка и 21 таблицу.
Работа выполнена в лаборатории гликологии Отдела молекулярной иммунологии и биотехнологии Института физиологии Коми НЦ УрО РАН в рамках плановой темы НИР «Выделение, структурная характеристика и физиологическая активность пектин-белковых комплексов» № ГР 01201050888 (2010-2013 гг.).
Работа частично получила финансовую поддержку Программ интеграционных проектов фундаментальных научных исследований, выполняемых в УрО РАН совместно с СО РАН.
Сокращения и условные обозначения. ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография, ДМФА - диметилформамид, ТФУ - трифторуксусная кислота, GalA - галактуроновая кислота, Rha - рамноза, Ara - арабиноза, Xyl - ксилоза, Man - манноза, Glc - глюкоза, Gal - галактоза, MeO - метоксильные группы, SO3 - сульфатные группы, ИК-спектр - инфракрасный спектр, ЯМР-спектр - спектр ядерного магнитного резонанса, Mn - среднечисловая молекулярная масса, Mw - средневесовая молекулярная масса, Mw / Mn - степень полидисперсности, BC - пектин бадана толстолистного Bergenia crassifolia L. (бергенан), LM - пектин ряски малой Lemna minor L. (лемнан), PN - пектин рдеста плавающего Potamogeton natans L. (потамогетонан), BCH - галактуронан, полученный из бергенана, ЛПНП - липопротеины низкой плотности, DS - степень сульфатирования, Ts-OH - толуолсульфоновая кислота, RG-I - рамногалактуронан I, ПС - полисахарид.
Похожие диссертации на Сульфатированные производные пектиновых полисахаридов
-
