Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 4
2. Сфинголипиды губок, особенности строения, свойства и таксономическое распределение 9
2.1. Простые сфингозиновые производные 10
2.2. Церамиды 14
2.3. Гликосфинголипиды 20
2.4. Биполярные сфинголипидоподобные соединения 35
3. Обсуждение результатов 38
3.1. Ризохалин А из губки Rhizochalina incrustata 38
3.2. Сфинголипиды из губки Oceanapia sp 42
3.2.1. Оценалин А из губки Oceanapia sp 42
3.2.2. Церамиды из губки Oceanapia sp 58
3.2.3. Цереброзиды из губки Oceanapia sp 67
3.3. Цереброзиды из офиуры Ophiarachna incrassata 75
4. Экспериментальная часть 78
4.1. Приборы и материалы 78
4.2. Биологический материал 80
4.3. Выделение ризохалина А из губки Rhizochalina incrustata 81
4.4. Выделение оценалина А из губки Oceanapia sp 83
4.5. Выделение церамидов из губки Oceanapia sp 85
4.6. Выделение цереброзидов из губки Oceanapia sp 88
4.7. Выделение цереброзидов из офиуры Ophiarachna incrassata 91
Выводы 94
- Церамиды
- Биполярные сфинголипидоподобные соединения
- Церамиды из губки Oceanapia sp
- Биологический материал
Введение к работе
Актуальность проблемы. Сфинголипиды - это один из наиболее разнообразных по химическому строению и функциональной активности классов липидных молекул. Их название происходит от слова "sphinx" (греч.), что означает «загадочный». К этому классу относятся сфингозиновые основания и их производные: церамиды, фосфосфинголипиды и гликосфинголипиды (цереброзиды и ганглиозиды). К настоящему времени из различных биологических источников выделено несколько сотен сфинголипидов, в основном" производных сфингозиновых оснований, отличающихся друг от друга химическим строением. Наблюдающийся в последнее время повышенный интерес к структурным исследованиям сфинголипидов является следствием нескольких важных научных событий, К ним можно отнести открытие целого ряда новых структурных серий морских сфинголипидов и, в еще большей степени, установление важной роли отдельных сфинголипидов в регуляции процессов роста, дифференциации и апоптоза клеток. Кроме того, были найдены такие природные соединения, которые имеют определенное сходство в строении и, по-видимому, в биогенезе со сфинголипидами, но в то же время существенно отличаются от классических сфинголипидов и могут быть названы сфинголипидоподобными метаболитами.
Особый интерес из них представляют так называемые двухголовые сфинголипиды, которые были открыты в 1989 г. в Лаборатории химии морских природных соединений Тихоокеанского института биоорганической химии. В настоящее время не ясны биосинтетические пути образования таких липидов, приводящих к а,со-бифункционализации оснований сфингоидного типа. Эти соединения не имеют структурных аналогов среди известных природных соединений и чрезвычайно редки. До сих пор они были найдены только в некоторых губках. Двухголовые сфинголипиды замечательны и своими биологическими свойствами. Так, недавно было обнаружено, что некоторые из них в низких концентрациях ингибируют рост Candida glabrata. Этот вид грибов, наряду с другими видами рода Candida, вызывает кандидозы, которые являются одними из самых частых оппортунистических микозов при низком иммунном статусе, в том числе на любой стадии развития ВИЧ-инфекции, В настоящее время известны лишь единичные примеры веществ, способных подавлять рост Candida glabrata.
Поиск новых типов противогрибковых природных соединений - не только важный-этап разработки новых лекарственных средств. Он имеет и фундаментальное значение в плане открытия новых молекулярных мишеней, взаимодействие с которыми может привести к противогрибковому эффекту. Кроме того,, выделение новых вторичных метаболитов, в том числе сфинголипидов и сфинголипидоподобных соединений, и установление их химического строения обычно предшествует решению ряда других задач биоорганической химии, например, установлению их биологических функций, выявлению зависимости структура-активность, изучению биосинтеза, разработке схем полного химического синтеза, определению механизмов биологического действия и т.п.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось выделение и установление строения сфинголипидов и необычных сфинголипидоподобных вторичных метаболитов из губок Rhizochalina incrustata, Oceanapia sp. и офиуры Ophiarachna incrassata.
Для достижения этой цели были решены следующие задачи: 1) выбраны объекты исследования; 2) получены соответствующие экстракты; 3) разработаны схемы выделения целевых веществ; 4) осуществлено разделение соответствующих фракций, получены и очищены индивидуальные природные соединения или, в тех случаях, когда это было невозможно, суммы сфинголипидов; 5) выполнен анализ спектральных данных, получены производные, которые, в свою очередь, также исследованы с помощью ЯМР и масс-спектрометрии; 6) установлены структуры целевых соединений и 7) для некоторых из них изучена биологическая активность.
Научная новизна и практическая ценность работы. Из двух видов губок было выделено 2 новых сфинголипидоподобных метаболита и 39 новых сфинголипидов, установлены их структуры. Впервые в офиурах идентифицированы 12 цереброзидов. Изучены ЯМР и масс-спектры этих природных соединений, исследованы некоторые химические свойства. Получены новые данные о противогрибковой активности некоторых сфинголипидоподобных веществ морского происхождения, что открывает возможности дальнейшего поиска в этом ряду высокоактивных соединений для создания на их основе новых лекарственных средств.
Публикация результатов исследования. Основные результаты данной работы опубликованы в таких научных журналах как: «Organic Letters», «Journal of Natural Products», «Биоорганическая химия». Материалы работы были представлены на четвертой Европейской Конференции по Морским природным соединениям в 2005 году в Париже; на одиннадцатом международном симпозиуме по Морским природным соединениям в 2004 году в Сорренто (Италия); на Региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии», Владивосток, 2004. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, посвященного особенностям химического строения сфинголипидов морских губок, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего 106 цитируемых работ. Работа изложена на 106 страницах, содержит 13 таблиц, 1 схему и 15 рисунков. Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю д.х.н. Макарьевой Т.Н., а также благодарит академика Стоника В.А. за консультации и помощь в работе. Автор благодарит к.х.н. Денисенко В.А. и к.х.н. Дмитренка А.С. за съемку спектров ЯМР, Дмитренка П.С. и Моисеенко О.П. - за получение масс-спектров, д.б.н. Светашева В.И. и к.х.н. Родькину С.А. - за идентификацию жирных кислот и их производных, Красохина В.Б. - за определение видовой принадлежности исследованных губок и к.б.н. Чернышева А.В. - за определение офиуры.
Церамиды
Церамиды. являются производными, образующимися при N- ацилировании сфингоидного основания жирной кислотой. Эти производные широко распространены в природе, и в последнее время в морских организмах было найдено много новых соединений этой серии. формула церамидов Гроуд и Карделлина в 1983 году выделили серию церамидов с негидроксилированными (14) и сс-гидроксилированными (15) жирными кислотами, включая длинноцепные или так называемые демоспонгиевые кислоты, из губки Dysidea etheria [9]. 14Х = Н, п= 12-15, 19-21 15Х = ОН,п=19-21 Хирш и Кашман в 1989 году сообщили о выделении сфинголипидов из красноморских морских организмов, включая церамиды из губки Ptilocaulis spiculifer [10]. При выделении так называемых птилоцерамидов применяли тест на противогрибковую активность против Candida albicans. При структурном изучении этих веществ использовали сочетание масс-спектрометрии и спектроскопии ядерного магнитного резонанса перацетатов, а кислотный гидролиз птилоцерамидов дал серию а-гидрокси жирных кислот, которые анализировали в виде метиловых эфиров. Хотя индивидуальные компоненты смеси так и не были выделены, структура птилоцерамидов (16) была установлена. Мейер и Гуйот выделили из губки Grayella cyatophora серию гомологичных сфинголипидов (21), ацилированных одной и той же кислотой. Структура установлена спектроскопическими и химическими методами [16]. В этих соединениях сфигозиновые основания представлены смесью гомологов, причем длина цепи этих соединений достигает 22 атомов углерода. Восемь церамидов (22) были идентифицированы в губке Haliclona cribricutis при помощи ионизационной тандемной масс-спектрометрии (ESI-MS/MS) [17]. Характерной особенностью этих соединений является наличие длинноцепных жирных кислот. Из морской губки Ircinia fasciculate был выделен новый 4-сульфатированный церамид, ирцисульфамид [Л -(15 ,25 Ис,ЗЛ )-2-гидрокси-1-(гидроксиметил)-3-(сульфокси)-гептадецил-гексадеканамид (23)] [18]. Сульфатированные церамиды - редкая группа природных соединений, представленная, в основном, в морских беспозвоночных. Таким образом, литературные данные показывают, что губки являются богатым источником новых структурных вариантов церамидов. Разнообразие структур этих липидов в губках связано с тем, что в процессе биосинтеза здесь-используются не только Сі8-сфингоидньіе основания неразветвл енного строения, как в большинстве других животных, но и основания, имеющие большую или меньшую длину углеводородной цепи, а иногда и разветвления, в особенности на конце цепи.
Сфингоидные основания в губках могут иметь дополнительный гидроксил при С-4 (т.е. в губках наряду с обычными сфингозиновыми производными встречаются также производные фитосфингозинов, характерные в основном для растений и грибов, но не для высших животных). Наконец, набор жирных кислот, которыми ацилируются сфингоидные основания в губках, также необычно широк и включает кислоты от Си до С28, причем либо гидроксилированные, либо негидроксилированные по а-положению относительно карбоксильной группы. Губки являются богатым источником гликосфинголипидов [23, 24]. Гликосфинголипидные соединения из губок чаще всего содержат разветвленные и неразветвлеиные фитосфингозины, а большинство их жирнокислотных остатков являются (Я)-ос-гидрокси-производными. Как фитосфингозиновая, так и жирнокислотная части их молекул, ограничены в ряде видов типичными Cig-фитосфингозинами и, в основном, С24-жирными кислотами. Необычной структурной чертой гликосфинголипидов из губок Agelas spp. является наличие а-гликозидной связи в углеводной части. Гликосфинголипиды из различных видов Agelas показали сильные противоопухолевую и иммуностимулирующую активности. Так, Натори и др. [25, 26] выделили из губки Agelas mauritianus, собранной у берегов о. Окинава, серию гликосфинголипидов, названных агеласфинами. Они содержат остатки галактопиранозы, но, в отличие от большинства других сфинго-О-галактопиранозидов, в агеласфинах галактопираноза связана с агликоном, не (3-, а а- гликозидной связью Костантино и др. [33] выделили аксицерамиды А (47) и В (48) из губки Axinella sp. и показали, что они имеют структуры, в основном такие же, как у гликосфинголипидов из Agelas dispar, за исключением строения трисахаридной части.
Хаяши и др. [34] показали, что основным сфинголипидом в губке Halichondria japonica является 49. Это соединение содержит чуть укороченное разветвленное фитосфингозиновое основание, С22-ос-гидроксилированную жирную кислоту и углеводную цепь в Ли и др. [35] получили серию гликосфинголипидов из губки Halichondria cylindrata, которые они назвали халицилиндрозидами (51, 52). Полученные соединения проявляли противогрибковую и цитотоксическую активности. Для установления присутствия в них разветвленного фитосфингозинового основания и pGlcNAc углеводного остатка в углеводной цепи были использованы спектроскопические методы и химическая деградация. Как было показано Хиршем и Кашманом, губка Amphimedon viridis содержит гликосфинголипид (50) с практически такой же, как у халицилиндрозидов структурой [10]. В 2001 году Денг и др. выделили новый цитотоксичный иотроридозид А (53) из губки lotrochota ridley, собранной в Южно-Китайском море [36]. Это новое соединение проявляло сильную цитотоксичность по отношению к клеткам мышиной лейкемии линии L1210 in vitro (ЛД5о 0.08 мкг/мл). Из морской губки Chondrilla nucula была выделена смесь цереброзидов (55) [37]. Метанол из цереброзидной смеси, катализируемый кислотой, дал метилгликозиды, три длинноцепочечных основания и смесь метиловых эфиров а-гидрокси жирных кислот. Основания были идентифицированы как насыщенные С\ъ С]8, и С19 1,3,4-тригидрокси-2-аминоалканы с помощью хромато-масс-спектрометрии их триметилсилильных производных. Фракция метиловых эфиров содержала смесь гомологов - производных Сіб-Сгб насыщенных неразветвленных а-гидрокси-жирных кислот и следовые количества метилового эфира насыщенной Сгб-шо-а-гидрокси жирной кислоты. Хотя большинство гликосфинголипидов губок содержит насыщенную фитосфигозиновую часть, существуют многочисленные примеры соединений, содержащих линейные и разветвленные основания с одной или несколькими двойными связями. Хирш и Кашман [10] выделили серию разветвленных ненасыщенных гликосфинголипидов из губки Amphimedon viridis с а- или [3-GlcNAc углеводной частью. Они были названы амфицереброзидами (56, 57). Похожий ненасыщенный гликосфинголипид (58) был получен из губки Haliclona sp., он отличается наличием p-Glc в углеводной части.
Биполярные сфинголипидоподобные соединения
В губках была найдена особая группа сфинголипидоподобных соединений, так называемых двухголовых липидов. Двухголовые сфинголипиды из морских губок отличаются своими редкими ос,ш-бифункциональными структурами и высокой биологической активностью. Со времени открытия в 1989 году ризохалина, первого представителя этой серии, были обнаружены только два новых биполярных гликосфинголипида. Одно из этих соединений, оцеанапизид (81) из Oceanapia phillipensis, проявляет значительную противогрибковую активность против патогенных дрожжей Candida glabrata, устойчивых к действию флуконазола [46]. Ризохалин (82) показал антибактериальную активность против Staphylococcus aureus и цитотоксическую активность против мышиной карциномы Эрлиха (ЛД5о 10 мкг/мл) [47]. Другой биполярный липид этой серии, каликсозид (83), селективно разрушающий ДНК, и не проявивший ингибирующую активность против топоизомераз I и II, был выделен из Calyx sp. [48]. Кроме гликолипидов (81-83), в губках были найдены другие родственные сфинголипидоподобные биполярные метаболиты. Леуцеттамол А (84) и леуцеттамол В (85) были выделены из Leucetta sp. [49], соединение BRS1 (86) - из неидентифицированной губки [50], родственные соединения кориаценины - из средиземноморской Clathrina coriacea [51], рапсамин - из антарктической Leucetta leptorhapsis [52]. Рассмотренный в настоящем обзоре литературный материал показывает разнообразие химических структур сфинголипидов и - родственных соединений в губках, включая весьма редкие вторичные метаболиты. Для всего этого класса веществ из губок характерны интересные виды физиологического действия, в том числе противоопухолевые и противогрибковые свойства. Это и послужило причиной нашего выбора в качестве объектов исследований двух видов губок, в которых ранее уже обнаруживали необычные сфинголипидоподобные соединения. Молекулярная формула C49H84N2O16 была рассчитана из масс-спектра высокого разрешения HRMALDIOF-MS перацетатного производного ризохалина А (87а). В этом спектре зарегистрирован пик иона [M+Na+] при m/z 979.5759. Соответственно, в FABMS имелись пики при m/z 957 [М+Н]+ (регистрация положительно заряженных ионов) и при m/z 955 [il -H]" (регистрация отрицательно заряженных ионов). В EIMS имелся небольшой пик молекулярного иона при m/z 956. В спектрах ЯМР Н и 13С соединения 87а (табл. 3) присутствовали сигналы, типичные для гликозидов псевдо-димерных аминоспиртов, аналогов ризохалина (82).
Это сигналы двух вторичных метальных групп (8Н 1.11 д и 1.17 д; 5с 18.8 и 18.6), двух N-замещенных СН групп (5Н 3.92 м и 4.10 м; 5с 48.8 и 46.7), двух оксиметиновых групп (5ц 4.84 тд и 3.50 дт; 5С 76.4 и 82.5) и одной карбонильной группы (5с 211.6), окруженной с двух сторон а-СН2 группами (5ц 2.37 т и 2.36 т; 5с 42.8 и 42.7). Кроме того, в ЯМР спектрах обнаруживались сигналы ( групп углеводородной цепи (5ц 1.25 уш. с; 5с 29.1-29.8). Спектры ЯМР перацетата 87а, полученного из 87, имеют большое сходство со спектрами перацетата ризохалина, за исключением амидного дублета, сдвинутого в сильное поле с 5н 5.63 до 4.71. Следовательно, соединение 87 - это аналог ризохалина с модификацией при С-27, что было показано анализом спектров ЯМР 13С, COSY и НМВС. В спектре ЯМР 13С соединения 87а имелись сигналы этоксигруппы (ОСН2СН3: Ьц 1.25 т, J=6.8 Гц, ЗН и 4.10 м, 2Н; 5С 14.6 и 60.8). Химический сдвиг (8С 156.2) согласовывался с резонансным сигналом карбонила карбамоильной группы. НМВС корреляция СНз-28 (5Н 1.11)/CH-N (5С 48.8) (рис. 4) подтвердила, что метиновая группа, к которой относится сигнал при 5ц 4.71, находится рядом с одним из концов молекулы, и тем самым - положение №1(СО)ОСН2СНз группы при С-27 в 87. Галактопиранозильная фуппа в 87 присоединена к агликону (3-гликозидной связью, как показала КССВ аномерного Н-1" (8ц 4.48 д, J=7.8 Гц). Кросс-пик Н-17С-3 (8С 82.5) в НМВС спектре показал место присоединения моносахарида при С-3. В результате гидролиза 87а (6N НС1, 100С, 2.5 ч) получили D-галактозу и два соединения, производные агликона, которые ацетилировали, разделили и очистили колоночной хроматографией на силикагеле. Продукт, элюированный первым, был идентифицирован как перацетат карбамоильного производного агликона ризохалина (88), вторым оказался перацетат агликона ризохалина (89), который по данным ЯМР, EIMS, и [cc]D идентичен соответствующему соединению, полученному ранее из ризохалина (82) [47]. Следовательно, кето-группы в 82 и 87 локализованы в одинаковом положении (С-18), и абсолютная конфигурация 87 - точно такая же, как в 82, т.е. (2R,3R26R27R) [53]. Ризохалин А - первый представитель двухголовых сфинголипидов, ф содержащий редкую iV-алкилкарбамоильную группу. Ранее //-карбаматы были обнаружены в некоторых морских алкалоидах [54-56]. Кроме того, такие поликетиды, как дискодермолид А [57] и кабирамид С [58], содержат Оалкил-карбамоильные группы.
Все эти соединения были выделены из метанольных экстрактов морских организмов, а ризохалин А был получен после этанольной экстракции образца губки R. incrustata. Возможно, что 87 и другие природные карбаматы происходят из пока не идентифицированных -предшественников, взаимодействующих с метанолом или этанолом в процессе выделения. Губки рода Oceanapia содержат целый ряд необычных сфинголипидов и " сфинголипидоподобных соединений, а также серию других биологически активных вторичных метаболитов. Из их экстрактов ранее были выделены биполярный липид оцеанапизид [46], новые церамиды [22], пиридоакридиновые, пирролопиридиновые [59-62] и сесквитерпеновые [63] алкалоиды, дитиоцианаты [64], бромзамещенные полиненасыщенные Сіб жирные кислоты [65], ацетиленовые Си кислоты [66] и бромтирозиновые ф алкалоиды [67]. 3.2.1. Оценалин А из губки Oceanapia sp. Из этанольного экстракта лиофилизированной губки Oceanapia sp. нами был выделен вторичный метаболит с беспрецедентной структурой, Ч названный оценалином А (90). Сконцентрированный досуха этанольный экстракт распределили между водным этанолом и гексаном. Водно-этанольный слой экстрагировали бутанолом. Бутанольный экстракт разделили С-18 флеш-хроматографией и Многократной ВЭЖХ на обращенной фазе (рис. 5). В результате в виде аморфного бесцветного порошка получили соединение 90, которое обнаруживалось нингидрином на ТСХ. На основе данных HRFABMS и ЯМР для оценалина А (90) была предложена молекулярная формула C41H72N2O9. В самом деле, FABMS высокого разрешения дал пик иона с m/z 737 .5286 [М+Н]+ (рассчитанное значение для C41H73N2O9 737.5311). ESIMS дал интенсивный пик молекулярного иона при m/z 1Ъ1 (100 %) [M+Na]+, что отличало это соединение от ризохалина и его производных. УФ-Спектр (МеОН) указывал на наличие ароматического хромофора [А,тах 288 нм]. В ESI спектре 90 имелся пик дважды протонированного молекулярного иона (m/z 369, 30%, [М+2Н]2+). Подобные двухзарядные ионы характеристичны для соответствующих масс-спектров двухголовых сфинголипидов [46, 47]. Из данных спектров ЯМР (табл. 4) следовало, что в 90 присутствуют моносахаридный остаток (8Н 4.32 д, J=7.2 Гц; 8с 104.8) и шесть ароматических атомов углерода, два из которых протонированы (5Н 6.60 с и 6.64 с; 8С 124.2, 116.8, 147.3, 146.5, 114.5 и 124.8). Кроме того, в ЯМР спектрах имелись сигналы метиленовой группы, связанной с азотом (8н 3.50 м и 3.54 м; бс 41.6), двух метиновых групп, связанных с азотом (5ц 4.32 дд и 3.17 м; 8с 57.3 и 52.7), двух гидроксиметиновых групп (8ц 3.68 дцц и 3.50 м; 8с 80.9 и 84.7). Также наблюдались сигналы дизамещенной двойной связи (6ц 5.20 дд и 5.63 дт; 5С 136.6 и 132.2), вторичного метила (8н 1-27 д; 8С 16.0), одной ОМе группы (5ц 3.20; 5с 56.6) и сигнал длинноцепочечной полиметиленовой цепи (5ц 1.20-1.30). Спектры полученного в результате ацетилирования октаацетильного производного 90а подтверждают присутствие шести ОН групп, первичной NH2 и вторичной NH группы.
Церамиды из губки Oceanapia sp
Нам представлялось интересным выяснить, реализуется ли в губках рода Oceanapia биосинтез обычных сфинголипидов. С этой целью из экстрактов губки этого рода нами была выделена фракция церамидов. Следует отметить, что губки обычно представляют собой комплексы, включающие значительные количества симбиотических микроводорослей и бактерий. Поэтому решить вопрос о том, в каких именно компонентах комплекса (клетках самой губки или в микросимбионтах) биосинтезируется та или иная группа природных соединений очень трудно. Церамиды были выделены нами из этанольного экстракта губки Oceanapia sp. Концентрированный этанольный экстракт распределяли между бутанолом и водой, затем полученный бутанольный экстракт хроматографировали на колонке с силикагелем. Фракцию, элюированную этилацетатом, далее очищали колоночной хроматографией на сефадексе LH-20 и силикагеле, в результате получили сумму церамидов (96) (рис. 11). Структурная идентификация компонентов полученной фракции проводилась методами ЯМР-спектроскопии (табл. 6). Широкий дублет NH при 6.35 м.д., два дублета дублетов при 3.75 и 3.93 м.д. (СН?ОН), мультиплетные сигналы при 4.14 (CH-N), 3.57 (СН-О) и 3.62 м.д. (СН-О) подтвердили, что выделенные нами церамиды являются производными фитосфингозинов [16, 92]. Интенсивный сигнал при 5н 1.20-1.39 [(ОНУп] и два сигнала метальных групп (8Н 0.88, т, J=7.0, ЗН и 0.85, д, J=6.6, 6Н) в спектре ЯМР Н указывали на присутствие длинных алкильных цепей с я- и изо-концами. Пальмитиновая кислота вместе с Сі7-С28-насьіщенньши нормальными кислотами составляет более 79% от общей фракции жирных кислот. Только около 14 и 6% жирных кислот имеют изо- и ш/темзоструктуры, соответственно. Полученные в результате метанолиза сфингозиновые основания анализировали в виде перацетатов методом MALDIOF-масс-спектрометрии. Псевдомолекулярные [M+Na]+ ионные пики при m/z 508 и 522 соответствовали Cjg- и Сі9-фитосфингозинам. В спектре ЯМР Н этой смеси наблюдались сигналы трех метановых групп, связанных с гетероатомами, дублет при 8н 5.91 (NH) и два дублета дублетов протонов СН2ОАс-группы. Более того, триплет при 8Н 0.88 и дублет при 8Н 0.86 указывали на присутствие как нормальных, так и шоконцов в сфингозиновых основаниях. Присутствие н- и шоконцов было подтверждено ГЖХ-МС-анализом //-ацетил- 1,3,4-три-О-триметилсилильных производных, полученных из сфингозиновых оснований обработкой 20% уксусным ангидридом в метаноле с последующим силированием А ,0-бис-(триметилсилил)-трифторацетамидом.
На хроматограмме два пика веществ, дающих в масс-спектрах пики молекулярных ионов с m/z 575, соответствовали производным изо- и н-Сі8:о-фитосфинганинов, и два пика, имеющих молекулярные ионы с m/z 589, соответствовали изо- и н-Сі9:о-фитосфинганинам [93] (приблизительное соотношение площадей пиков в обоих случаях составляло 2 : 3). Стереохимия оснований определена как 2S$S,4R сравнением спектров ЯМР !Н их перацетатов со спектрами перацетатов стандартных сфингозиновых оснований и их диастереомеров и на основании значения угла вращения церамидов [94]. Дополнительная информация о составе церамидов была получена ГЖХ-МС-анализом 1,3,4-три-О-триметилсилильных эфиров церамидов. На хроматограмме имелись пики, соответствующие церамидам состава Ионные пики в этих соединениях можно разделить на несколько групп (схема 1): 1) относящиеся к фрагментам, характеризующим молекулярную массу; 2) относящиеся к фрагментам, характеризующим длину сфингозиновых оснований; 3) относящиеся к фрагментам, характеризующим длину жирнокислотных цепей [95-97]. Например, расщепление связи между С-3 и С-4 (с) дает пик m/z 299 (основание Ci8:0) или m/z 313 (основание С9:о)-Другой характерный для сфингозиновых оснований фрагмент (M-d) имеет величину m/z 401 для оснований Ci8:o и 415 для оснований Ci9:o-Жирнокислотные фрагментарные ионы с m/z 256, 270 и 284 были образованы переносом двух протонов на фрагмент b и демонстрировали, что церамиды содержат соответствующие 16:0, 17:0 и 18:0 жирнокислотные остатки. Основные пики с m/z 328, 342 и 356 соответствуют иону, который содержит одну триметилсилильную группу и жирнокислотный остаток (b+H+триметилсилильный радикал) [96]. Эти пики подтверждают, что основная жирная кислота в церамидах (96) - это Сіб:о- Полученные масс-спектры (см. «Экспериментальную часть») подтверждают также, что основные компоненты церамидной фракции (96) являются производными н-и изо Cj8:o- и С9;о-фитосфингозинов [95] и насыщенных жирных кислот.
Дополнительные доказательства структур были получены разделением смеси церамидов методом ВЭЖХ с последующим ГЖХ-МС-анализом подфракций в виде 1,3,4-три-0-триметилсилильных производных. Результаты анализа приведены в таблице 8. Принимая во внимание, что С\(, - Сг4-жирные кислоты в наших церамидах имеют исключительно нормальное строение (табл. 7), мы установили на основании хроматографического поведения и масс-спектроскопических данных, что два компонента фракции А - это изо- и н-1,3,4-три-0-триметилсилил-Л -пальмитоил-С8:о -фитосфингозины. Фракция В содержит единственный компонент - н-1,3,4-три-0-триметилсилил-іУ-пальмитоил-Сі8-фитосфингозин. ГЖХ-МС-анализ фракции С показал, что она включает 1,3,4-три-О-триметилсилилпроизводные ранее неизвестного изо-М-пальмитоил Сі9:о фитосфингозина и его н-изомера. Производное, соответствующее новому мзо-С9:о/Сі7:о компоненту, обнаружено во фракции D. Наконец, производное нового изо-С о/Сівя церамида найдено во фракции Е. Масс-спектры высокомолекулярных компонентов церамидной смеси не были получены из-за недостаточной летучести в условиях ГЖХ соответствующих производных. Для их идентификации использовали MALDIOF-масс-спектры смеси церамидов (96), полученные в присутствии LiCl. Наличие в спектре [М+1л]+-пиков ионов с m/z 562, 576, 590, 604, 646, 660, 674, 702, 716, 730, 744, отличающихся друг от друга на величину, кратную 14, указывает на строение дополнительных компонентов этой фракции, содержащих длинноцепочечные (т.н. демоспонгиевые) жирные кислоты. Обобщенные данные, касающиеся структурной идентификации церамидов, основанные на анализе жирных кислот и сфингозиновых оснований и MALDIOF-масс-спектров, даны в таблице 9. Приведенное содержание церамидов рассчитано из интенсивностеи соответствующих пиков в MALDIOF-масс-спектрах. н-Сі8-Фитосфингозин - обычное тригидроксилированное длинноцепочечное основание церамидов из растений и дрожжей [98-100]. В морских беспозвоночных производные мзо-С]8-фитосфингозина впервые были обнаружены в асцидии Cystodytes cf. dellechiajei [101]. Однако, в отличие от выделенных нами церамидов, эти вещества были ацилированы ос-гидроксикислотами. Хотя к-Сі9-фитосфингозин был ранее обнаружен в церамидах из многих видов дрожжей [102], есть только одно сообщение об этом типе церамидов в морских беспозвоночных: //-С9-фитосфингозин, ацилированныи негидроксилированными кислотами, идентифицирован в губке Iotrochota baculifera [15]. О церамидах, содержащих изо-С\д-фитосфингозин, ранее не сообщалось. Таким образом, мы идентифицировали серию новых структурных вариантов церамидов, содержащих изо-С\ - и С19-фитосфингозины и ацилированных по аминогруппе негидроксилированными жирными кислотами.
Биологический материал
Губка Rhizochalina incrustata (Porifera, класс Demospongiae, подкласс Ceratinomorpha, отряд Haplosclerida, семейство Phloeodictydiae) была собрана водолазным способом на глубине 3-12 м во время научного рейса № 3 на НИС «Академик Опарин» (Ноябрь 1986, Сейшельские острова, 426 45" N, 5454 75" Е) и идентифицирована проф. Колтуном В.М. (Зоологический институт РАН, Санкт-Петербург). Образец морской губки (№ 03-297) хранится в коллекции морских беспозвоночных Тихоокеанского института биоорганической химии Губка Oceanapia sp. (отряд Haplosclerida. семейство Phloeodictyidae) была собрана с помощью драги на глубине 48 м во время научного рейса № 12 на НИС «Академик Опарин» возле рифа Скотта (Ноябрь 1990, северозападная Австралия, 16 ЗЗ б" S; 121 07 1" Е) и определена Красохиным В.Б. (Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток). Образец морской губки (№ 012-200) хранится в коллекции морских беспозвоночных Тихоокеанского института биоорганической химии. Офиура Ophiarachna incrassata (Ophiuroidea, Ophiodermatidae) была собрана на глубине 3 м во время научного рейса № 30 на НИС «Академик Опарин» (Январь 2005, бухта Ван-Фонг, Южно-Китайское море, 1238 73" N; 10922 4" Е) и определена к.б.н. Чернышевым А.В. (Институт биологии моря ДВО РАН, Владивосток). Образец офиуры (№ 030-134) хранится в коллекции морских беспозвоночных Тихоокеанского института биоорганической химии. 4.3. Выделение ризохалина А из губки Rhizochalina incrustata Свежесобранная губка была немедленно лиофилизирована и хранилась при -20С. Лиофильновысушенный материал (400 г) экстрагировали этанолом (1 л х 3). Этанольный экстракт после концентрирования в вакууме перерастворили в системе этанол : вода (9 : 1). Фракцию растворимую в гексане экстрагировали три раза равными объемами гексана. Водно-этанольный слой разбавили до соотношения этанол : вода (7 : 1). Хлороформ-растворимую фракцию экстрагировали тремя равными порциями хлороформа. Сконцентрированный досуха хлороформнный экстракт хроматографировали на колонке с Полихромом-1, элюируя градиентом вода-»50% этанол-»этанол. Фракцию биполярных сфинголипидов (проявляемую нингидрином на ТСХ) элюировали 50% этанолом. Ее разделили на колонке с силикагелем, используя градиент растворителей хлороформ-»хлороформ : этанол-»хлороформ : этанол : вода (10 : 1— 3 : 2- 3 : 2 : 0.2). Получили смесь (50 мг) ризохалина (82) и ризохалина А (87). Перацетатныс производные 82а и 87а.
Смесь ризохалина (82) и ризохалина А (87) (50 мг) растворили в пиридине (1 мл) и уксусном ангидриде (1 мл) и оставили на 18 ч при 25С. Раствор сконцентрировали в вакууме и получили остаток (55 мг),.содержащий перацетаты 82а и 87а. Смесь разделили колоночной хроматографией на силикагеле, используя этилацетат как элюент, получили 82а (30 мг) и фракцию, содержащую менее полярные соединения (10.7 мг), которые очищали методом препаративной ТСХ (силикагель, этилацетат), получили 87а (5.3 мг). После препаративной ВЭЖХ (YMC-Pack ODS-A, 80% этанол) получили перацетат ризохалина А (87а) (2.3 мг; 0.0006% на сухой вес губки). Перацетат ризохалина А (87а). Аморфный порошок, [ог] + 15(с 0.22, ЕЮН). Спектры ЯМР Н и 13С приведены в таблице 3. HRMALDI-Macc-спектр, m/z: 979.5759 [M+Na]+ (рассчитано для C49H84N2016Na 979.5719). EI-Масс-спектр, m/z: 956 [Щ+, 911, 897, 841, 798, 782, 609, 563. (+)-FAB-Macc-спектр, т/г. 957 [М+Н]+; (-)-FAB-Macc-cneKTp, m/z: 955 [АҐ-Щ. Гидролиз перацетата ризохалина А (87а) Раствор 87а в 6N НС1 нагревали при 100С в течение 2.5 ч. Смесь охладили и обработали ионно-обменной смолой Dowex (НСОз форма) и экстрагировали бутанолом. Водный слой отделили и концентрировали, получили D-галактозу (0.4 мг). Бутанольный слой концентрировали, остаток растворили в пиридине (0.5 мл) и уксусном ангидриде (0.5 мл) и оставили при 25 С в течение 18 ч. После упаривания получили остаток (1.6 мг), содержащий смесь 88 и 89, которую разделили на колонке с силикагелем в градиенте этилацетат-»этилацетат : этанол (100 : 3), получили чистые соединения 88 (0.3 мг) и 89 (1.1 мг). Соединение 88. Аморфный порошок, [а]\ +30 (с 0.03, СНСЬ). Спектр ЯМР Н см. в таблице 3. MALDI-Macc-спектр, m/z: 691 [M+Na]+, 707 [М+К]+. ЕІ-Масс-спектр, m/z: 623 [ЛҐ-45], 535, 519, 450, 434, 350, 340, 294, 280. FAB-Масс-спектр, m/z: 669 [МЧН]. Соединение 89.
Аморфный порошок, [а] +35 (с 0.11, СНСІз). Спектр ЯМР Н (CDC13): 5.59 (д, J=9.4, 2-NH, 27-NH), 4.85 (тд, J=4.2, J=6.6, Н-3, Н-26), 4.21 (ддд, J=6.7, J=4.2, J=9.4, Н-2), 4.21 (м, Н-27), 2.38 (т, J=7.0, Н-10, Н-12), 2.09 (6Н, с, Ас), 1.99 (6Н, с, Ас), 1,10 (д, J=6.6, Н-1, Н-28). EI-Macc-спектр, т/г. 638 [М\\ 595, 578, 553, 535, 519, 493, 450, 434, 350, 340, 294, 280. 4.4. Выделение оценалина А из губки Oceanapia sp. Лиофильно высушенную губку (327 г) " экстрагировали этанолом. Этанольный экстракт концентрировали (34.9 г) и распределили между 90% этанолом и гексаном. Водный слой (70% этанол) экстрагировали бутанолом. Бутанольный экстракт концентрировали в вакууме до сырого смолообразного остатка (9 г). Часть (3.4 г) разделили обратно-фазовой флэш хроматографией на твердофазовом картридже (Varian, 20 г, Qg связанная фаза) со ступенчатым градиентом 40—100% метанол. Сфинголипидная фракция (проявляемая нингидрином на ТСХ) элюировалась 60% водным метанолом. Оценалин А (90) (4.0 мг; 0.003%) на сухой вес губки) получен после многократной обратно-фазной ВЭЖХ, используя 80% метанол/0 Л % трифторуксусная кислота. Оценалин А (90). Аморфный порошок, [от] -5.7 (с 0.14, ЕЮН). Спектры ЯМР Н и 13С см. таблицу 4. HRFAB-Масс-спектр, т/г. 737.5286 [М+Н]+ (рассчитано для C41H73N2O9 737.5311). ESI-Macc-спектр, m/z (/0Tu.(%)): 737 (100 %) [M+Na]+, 369 (30%) [М+Щ2+. УФ-Спектр (МеОН), imax 238 нм (є 7600), 288 (7850). Ацетилирование оценалина А. Оценалин А (90) (1.5 мг) растворили в пиридине (0.5 мл) и уксусном ангидриде (0.5 мл) и оставили при 25С на 18 ч. Концентрировали досуха, получили остаток 90а (2.0 мг), Перацетат оценалина А (90а). Аморфный порошок, [а]\] 0 (с 0.15, СНСІз). Спектр ЯМР Н см. таблицу 5. MALDIOF- Масс-спектр, m/z: 1095 [M+Na]+. Гидролиз оценалина А (90). Раствор 90 (1.2 мг) в 6М НС1 (1 мл) нагревали при 100С в течение 2.5 ч. Смесь охладили и обработали ионно-обменной смолой Dowex (НС03 форма). Водный раствор отделили и концентрировали, получили D-галактозу (0.4 мг). Озонолиз и восстановление 90а. Озон пропускали через раствор 90а (2.0 мг) в метаноле при температуре от -20С до -30С в течение 4 ч. Раствор охладили и обработали избытком NaBH4 (5 мг). Смесь оставили при комнатной температуре на ночь и нейтрализовали уксусной кислотой (до рН=7). Смесь концентрировали досуха, обработали смесью уксусный ангидрид/пиридин (1 : 1) и оставили при комнатной температуре на ночь. После упаривания остаток разделили колоночной хроматографией на силикагеле, используя этилацетат как элюент, в результате получили смесь продуктов 91-94 (1.0 мг). Разделение смеси препаративной ВЭЖХ (YMC-Pack ODS-A, 80% этанол) дало соединения 91-94.
