Содержание к диссертации
Введение
2. Антимикробные пептиды беспозвоночных 7
2.1. Структура антимикробных пептидов беспозвоночных 12
2.1.1. Цистеин-содержащие пептиды 14
2.1.1.1. Пептиды с CSaP структурой 14
2.1.1.2. Пептиды, образующие двойной р-складчатый лист 21
2.1.1.3. Другие цистеин-содержащие пептиды 25
2.1.2. Линейные пептиды с a-спиральной структурой 33
2.1.3. Пептиды, обогащенные пролином 42
2.1.4. Антимикробные белки, обогащенные глицином 47
2.2. Биологическая активность 53
2.2.1. Антимикробная активность 53
2.2.1.1. Стадии взаимодействия пептидов с мембраной 55
2.2.1.2. Механизмы повышения проницаемости мембраны 59
2.2.1.3. Селективность мембранотропного действия 64
2.2.1.4. Альтернативные механизмы антимикробного действия 68
2.2.2. Другие виды активности 76
3. Материалы и методы 81
3.1. Оборудование 81
3.2. Реактивы и расходные материалы 82
3.3. Методы 86
3.3.1. Выделение суммарной РНК 86
3.3.2. Обратная транскрипция и амплификация концов кДНК (RACE)... 87
3.3.3. Клонирование и секвенирование продуктов ПЦР 89
3.3.4. Гетерологичная экспрессия антимикробных пептидов 89
3.3.4.1. Создание генно-инженерных конструкций 89
3.3.4.2. Получение штаммов-продуцентов 92
3.3.4.3. Оптимизация условий экспрессии 92
3.3.4.4. SDS-электрофорез 93
3.3.5. Выделение и очистка рекомбинантных пептидов 94
3.3.5.1. Препаративная экспрессия 94
3.3.5.2. Получение нерастворимой фракции клеточного белка 94
3.3.5.3. Металло-хелатная хроматография 95
3.3.5.4. Расщепление гибридных белков 95
3.3.5.5. Растворение пептидов 96
3.3.5.6. Ультрафильтрация 96
3.3.5.7. ВЭЖХ-очистка пептидов 96
3.3.5.8. Анализ фракций 97
3.3.6. Определение антимикробной активности 97
3.3.6.1. Метод радиальной диффузии в твердой питательной среде 97
3:3.6.2. Метод серийных разведений в жидкой питательной среде .:.. 98
Результаты и обсуждение 100
4.1. Определение полных последовательностей кДНК, кодирующих предшественники антимикробных пептидов ареницинов из морского кольчатого червя Arenicola marina, и соответствующей им полной аминокислотной последовательности препроареницинов 100
4:2. Определение полной последовательности кДНК, кодирующей предшественник антимикробного пептида аурелина из сцифоидной медузы Aurelia aurita, и соответствующей полной аминокислотной последовательности препроаурелина 112
4.3. Гетерологичная экспрессия и очистка антимикробных пептидов 122
4.3.1. Экспрессия и очистка ареницина-2 123
4.3.2. Экспрессией очистка буфорина-2 135
4.4. Антимикробная активность ареницина-2 и буфорина-2 138
Заключение 141
Выводы 142
Благодарности 143
Библиографический список 144
- Пептиды с CSaP структурой
- Антимикробные белки, обогащенные глицином
- Выделение суммарной РНК
- Определение полной последовательности кДНК, кодирующей предшественник антимикробного пептида аурелина из сцифоидной медузы Aurelia aurita, и соответствующей полной аминокислотной последовательности препроаурелина
Введение к работе
Эндогенные антимикробные пептиды (АМП) - эволюционно древние факторы врожденного иммунитета, играющие ключевую роль в защите многоклеточных организмов от инфекции. Сходные по строению и функции пептиды были выделены из тканей беспозвоночных и позвоночных животных, а также растений [36; 313]. У беспозвоночных, лишенных лимфоцитарного иммунитета, биосинтез защитных молекул пептидной природы составляет один из главных механизмов противодействия инфекции. К настоящему времени определены структуры более тысячи природных АМП ..По мере углубления наших знаний об этих веществах становится все более очевидным и другой аспект их функционирования, состоящий в-регуляции иммунных. процессов и регенерации тканей [82; 139)239].
Вся длительная эволюция многоклеточных организмов протекала в непрерывном контакте с патогенной микрофлорой, поэтому наличие эффективных защитных, механизмов было необходимым условием их выживания. Зачастую остается в тени1 тот факт, что в процессе эволюции лимфоцитарный иммунитет возник с появлением челюстных рыб и, таким образом, существует лишь примерно у 1,5% видов многоклеточных организмов. Но даже те животные, которые обладают способностью вырабатывать антитела, в первые минуты и часы взаимодействия с патогеном вынуждены полагаться только на врожденные механизмы антимикробной защиты. Поэтому поиск и исследование новых АМП у эволюционно древних видов животных является перспективным для понимания закономерностей функционирования врожденного иммунитета у высших позвоночных и человека.
Фундаментальные структурно-функциональные исследования АМП тесно связаны с их важным прикладным значением: природные пептиды могут стать прототипами новых антибиотиков широкого спектра действия, способных решить проблему резистентности к существующим антимикробным средствам. Поразительная генетическая изменчивость и скорость размножения микроорганизмов являются факторами, создающими для человека серьезные проблемы в борьбе с возбудителями инфекционных заболеваний [1]. В связи с этим поиск природных АМП и создание новых пептидных антибиотиков на их основе- являются актуальными задачами современной биологической науки. Традиционно применяемые антибиотики микробного происхождения; решая основную задачу, связанную с инактивацией микроорганизмов, вызывают и ряд нежелательных побочных эффектов, а именно: состояние иммунодефицита, эндотоксемию, повсеместное развитие резистентности со стороны микроорганизмов. Пептидные антибиотики лишены этих недостатков. Более того, многие катионные АМП обладают эндотоксин-нейтрализующей и иммуномодулирующей активностью. Развитие резистентности патогенов к АМП значительно затруднено, поскольку требует внесения серьезных изменений в структуру и электрофизиологические свойства клеточной мембраны. Являясь факторами, повышающими проницаемость мембраны, АМП усиливают действие традиционно используемых антибиотиков. Все это является предпосылкой для создания антимикробных препаратов на основе природных молекул. Первые представители нового поколения антибиотиков уже проходят клинические испытания [102; 154; 218]. Дальнейшие структурно-функциональные исследования АМП, вырабатываемых различными группами животных, могут внести существенный вклад в развитие этого перспективного направления медико-биологической науки.
Подавляющее большинство известных в настоящее время АМП животного происхождения были выделены из тканей млекопитающих, земноводных и насекомых. Арсенал АМП других классов животных до сих пор остается малоисследованным. Целью нашей работы было изучение структуры и свойств АМП морских беспозвоночных. В качестве объектов исследования были выбраны представители двух типов беспозвоночных: морской червь Arenicola marina [тип - кольчатые черви (Annelida), класс - многощетинковые (Polychaeta)] и медуза Aurelia aurita [тип — кишечнополостные, класс — сцифоидные (Scyphzoa)]. В задачи работы входило определение последовательностей кДНК, кодирующих АМП, конструирование систем для их гетерологичной экспрессии, разработка методики выделения и очистки генно-инженерных АМП, а также исследование свойств этих веществ.
Пептиды с CSaP структурой
Среди АМП, содержащих остатки цистеина, можно выделить две основные группы, представителей которых связывает общность пространственных структур молекул [78]: 1)пептиды, содержащие а-спиральный и Р-складчатый участки, стабилизированные тремя или четырьмя дисульфидными связями (CSap структура); 2)пептиды, образующие двойной р-складчатый лист, соединенный р-изгибом и стабилизированный одной или двумя дисульфидными связями (Р шпилька). Цистеин-содержащие пептиды, пространственная структура которых либо остается до сих пор, неисследованной, либо отличается от двух названных типов, можно условно отнести к третьей группе.
Данная структура является широко распространенной формой пространственной укладки пептидной цепи, встречающейся, в белках животного и растительного происхождения. К пептидам с CSap структурой относятся многие АМП растений, ингибиторы a-амилазы и сериновых протеиназ, короткие и длинные токсины скорпионов, сладкий белок браззеин [40]. Из числа АМП беспозвоночных в эту группу входят [356]: 1)антибактериальные дефенсины членистоногих (насекомых, клещей и скорпионов); 2)дефенсины моллюсков; 3 Противогрибковые пептиды насекомых - дрозомицин, гелиомицин, термицины; 4)пептиды семейства ASABF {Ascaris suum antibacterial factor) из круглых червей. В составе этих пептидов присутствует шесть или восемь остатков цистеина, образующих три или четыре внутримолекулярные дисульфидные связи. 1)Дефенсины членистоногих Подавляющее- большинство известных в настоящее время дефенсинов членистоногих было-выделено из представителей шести отрядов насекомых: двукрылых, перепончатокрылых, жесткокрылых, чешуекрылых, полужесткокрылых и стрекоз. Значительно меньшее число- публикаций посвящено изучению их гомологов из скорпионов [62; 84; 268], клещей [91; 137; 232], пауков и многоножек [260]. Эти пептиды, состоящие из 38-43 аминокислотных остатков, отличаются характерным блоком из шести консервативно» расположенных остатков цистеина, соединенных дисульфидными связями (1—4, 2-5, 3-6), фиксирующими жесткий каркас молекулы (рис. 1). Похожей первичной и пространственной» структурой обладает харибдотоксин из яда скорпиона, являющийся блокатором калиевых каналов [28].
Установленные методом Н-ЯМР трехмерные структуры дефенсинов из двукрылых Sarcophaga peregrina [108] и Protophormia terranovae [65] включают три различно организованных участка в пептидной цепи: 1)гибкий и малоупорядоченный N-концевой фрагмент, соединенный дисульфидной связью с первой Р-цепью; 2)а-спиральный фрагмент, соединенный двумя дисульфидными связями со второй 3-цепью; 3)двойной антипараллельный 0-складчатый лист. Предполагается, что все пептиды этого семейства построены по единой схеме. Размеры а-спирального и Р-структурного участков, составляющие жесткую часть молекулы, у всех дефенсинов членистоногих приблизительно равны, в то время как гибкая N-концевая петля может иметь разную протяженность. Консервативные остатки цистеина выделены жирным шрифтом, указан порядок их соединения. Черным цветом выделены остатки аргинина и лизина, серым - остатки глутаминовой и аспарагиновой кислот. Амидированные С-концевые аминокислотные остатки. на один - два порядка более высокие концентрации для проявления их активности в отношении грам-отрицательных бактерий, и еще более высокие -для подавления роста низших грибов. Этим дефенсины насекомых отличаются от дефенсинов позвоночных, которые являются в целом более универсальными антимикробными агентами. Данный пробел в антимикробной обороне восполняется у насекомых синтезом АМП других семейств. В концентрациях близких к минимальным ингибирующим (МИК), дефенсины насекомых не вызывают лизиса эритроцитов млекопитающих и дрожжевых клеток. Активность дефенсинов всех типов существенно снижается в растворах с высокой ионной силой, и особенно в присутствии ионов кальция.
Антимикробные белки, обогащенные глицином
Известные представители этой группы являются небольшими белками с молекулярной массой 8-30 кДа (Рис. 10). Они были выделены из гемолимфы насекомых нескольких отрядов: чешуекрылых (аттацины, гловерины), двукрылых (диптерицины, аттацины, саркотоксины-П), жесткокрылых (колеоптерицины, холотрицины, акалолептины, риноцерозин, тенецин-3), перепончатокрылых (хименоптецин), полужесткокрылых (хемиптерицин).
Первые шесть представителей семейства аттацинов, глицин-богатых белков с молекулярной массой 20 кДа, были выделены из того же источника (Hyalophora cecropia, отряд Lepidoptera), что и первые цекропины [127]. Гены, ответственные за синтез гомологичных полипептидов были найдены позднее у D. melanogaster (отряд Diptera) [9; 83] и представителей отряда Lepidoptera: Bombyx mori [304], Trichoplusia пі [140] и Samia cynthia ricini [149]. Существует два подсемейства аттацинов, различающихся содержанием остатков аспарагиновой кислоты: основные (pi 9) и нейтральные (pi 7). Гомология первичной структуры между ними составляет приблизительно 80%. Обе формы содержат три гидрофобные области в N-концевой части цепи. В отличие от цекропинов, аттацины проявляют активность лишь в отношении некоторых штаммов грам-отрицательных бактерий. Отщепляемый продомен аттацинов обогащен пролином (см. п. 2.1.3). К аттацин-подобным белкам можно отнести саркотоксины II (Па, II-1, П-2 и П-3) - полипептиды с массой около 28 кДа, обнаруженные в гемолимфе серой мясной мухи Sarcophaga peregrine [5].
Черным и серым цветами вьщелены гомологичные участки. Амидированные С-концевые остатки. Z - пироглутамат. Сокращения: Dm - Drosophila mehnogaster, Не - Hyalophora cecropia, Za - Zophobas atralus, Hg - Hyalophora gloveri, Ms - Manduca sexta, Tn richoplusia ni. ходе процессинга и входит в состав зрелой молекулы.
Диптерицины - антибактериальные полипептиды с молекулярной массой 9 кДа, выделенные из насекомых отряда двукрылых: Protophormia terranovae [79], Sarcophaga peregrina [133], D. melanogaster [332]. Диптерицины относятся к полипептидам смешанного типа, домены которых принадлежат к разным структурным группам: за коротким участком (15 аминокислотных остатков), богатым пролином, следует длинный амидированный С-концевой фрагмент (67 остатков), богатый глицином. N-концевой домен обладает гомологией с обогащенными пролином пептидами семейства апидецина (см. п. 2.1.3), а С 49
концевая область несет черты сходства с аттацинами (Рис. 11). Диптерицин Р. terranovae гликозилирован по остатку треонина в каждом из двух доменов. В отличие от него диптерицин из S. peregrina не содержит модифицированных остатков. Ранее считалось, что сахарные остатки необходимы для проявления пептидом из P. terranovae антибиотических свойств [35], но в дальнейшем это утверждение было экспериментально опровергнуто [67; 334]. Как и пептиды семейства апидецина, диптерицины активны только в отношении грам-отрицательных бактерий. Структура диптерицина из P. terranovae была исследована методами Н-ЯМР и КД, одинаково показавшими отсутствие каких-либо признаков упорядоченности.
Хемиптерицин из красноклопа-солдатика Pyrrhocoris apterus [отряд — полужесткокрылые (Hemiptera)] - 133-членный полипептид, обладающий гомологией с глицин-богатым доменом диптерицина [60]. Каждый третий из входящих в его состав аминокислотных остатков является положительно или отрицательно заряженным, причем содержание тех и других примерно одинаково, а суммарный заряд белка при рН 7,0 составляет всего +3,6. Хемиптерицин активен в отношении грам-отрицательных бактерий.
Такой же специфичностью действия обладают полипептиды из представителей отряда жесткокрылых (Coleoptera): холотрицин-2 из хруща Holotrichia diomphalia [181], акалолептины (Al, А2, A3) из жука-дровосека Acalolepta luxuriosa [130] и колеоптер ицин из жука-чернотелки Zophobas atratus [33]. Спектр действия колеоптерицина из жука Allomyrina dichotoma дополнительно включает грам-положительные виды: Staphilococcus aureus и Bacillus subtilis [274].
Лишь небольшая часть богатых глицином полипептидов действует в равной степени эффективно и на грам-положительные и на грам-отрицательные бактерии.
Гловерины — семейство глицин-богатых белков, выделенных из гемолимфы бабочек, Hyalophora gloveri [10] и Helicoverpa armigera [197]. С помощью дифференциального дисплея и вычитающей гибридизации получены гомологичные последовательности из представителей того же отряда, совки Trichoplusia пі [196] и бражника Manduca sexta [364]. Гловерины имеют молекулярную массу 14 кДа, содержание глицина в них составляет около 18%. Аминокислотная последовательность обладает незначительным сходством с аттацинами. При переходе из водного раствора в гидрофобную среду молекула гловерина претерпевает конформационные изменения: из неупорядоченной структуры формируется а-спираль [10]. Как и большинство других обогащенных глицином пептидов гловерины обладают узким спектром активности, ориентированным на грам-отрицательные виды бактерий.
В отдельную группу можно выделить глицин-богатые белки, обладающие противогрибковым действием. Их молекулы длиной 70 - 80 аминокислотных остатков обогащены не только глицином, но и гистидином, однако лишены при этом сходства с еще одной группой гистидин-богатых пептидов беспозвоночных - клаванинами. По содержанию гистидина (15-20%) и по спектру активности эти вещества можно считать ближайшими аналогами гистатинов - фунгистатических АМП из слюны человека [238]. AFP (antifungal protein), противогрибковый белок из серой мясной мухи Sarcophaga peregrina, конститутивно присутствует в высокой концентрации в гемолимфе насекомого [129]. В зависимости от штамма он может проявлять.как фунгистатическое, так и фунгицидное действие. Фунгицидная активность значительно возрастает в присутствии небольших количеств саркотоксина IA (цекропина S. peregrina), несмотря на то, что последний до недавнего времени считался исключительно антибактериальным пептидом. AFP имеет 30-35% гомологии с холотрицином-3, еще одним глицин-богатым белком из жука Holotrichia diomphalia [182], а также с тенецином-3 из мучного хрущака Tenebrio molitor [183]. Тенецин-3 действует на Candida albicans и не влияет на рост бактерий. Его молекула состоит из 78 аминокислотных остатков, среди которых глицин, гистидин и глутамин составляют около 80%, и не имеет строго упорядоченной пространственной структуры [184]. В аминокислотной последовательности можно выделить многократно повторяющийся мотив Gly-X-X-Gly, где X - His, Gin или Leu.
Акантоскуррин — антимикробный полипептид из гемолимфы тарантула Acanthoscurria gomesiana [192] благодаря чрезвычайно-высокому содержанию глицина (73%) занимает в структурной классификации особое место. Известны две изоформы акантоскуррина, с длиной цепи 130 и 132 аминокислотных остатка. Обе изоформы активны в отношении Candida albicans и E.coli. В аминокислотной последовательности можно выделить трижды повторяющийся мотив из 26 остатков (GGGLGGGGLGGGGLGGGKGLGGGGLG). Из-за преобладания в последовательности остатков глицина акантоскуррин демонстрирует значительный уровень гомологии с холотрицином-3, на 63% состоящим из остатков этой же аминокислоты. Однако сходство в данном случае едва ли можно назвать существенным: акантоскуррин не содержит гистидина, его положительный заряд (+8 при рН 7,0) обеспечивается сильноосновными аргинином и лизином, в последовательности гораздо больше гидрофобных остатков. Список АМП непрерывно пополняется как представителями уже известных семейств, так и принципиально новыми молекулами, проявившими в экспериментах in vitro антимикробную активность и не обладающими гомологией с пептидами других функциональных классов.
Выделение суммарной РНК
Крупноизмельченные ткани хранили при температуре минус 70С в растворе «RNA-Later», ингибирующем активность РНКаз. Для выделения и очистки суммарной РНК использовали набор реактивов и микроцентрифужные колонки «SV Total RNA Isolation System». Навеску массой около 1 г растирали в ступке с жидким азотом. Приблизительно 30 мг гомогенизированных тканей смешивали с 175 мкл лизирующего буфера (рН 7,5), содержащего 4М гуанидин-тиоцианата и 1% Р-меркаптоэтанола. Добавляли 350 мкл буфера для разбавления лизата и прогревали на водяной бане при 70С в течение 3 мин. Образец центрифугировали, после чего к супернатанту добавляли 200 мкл 95% этанола. Весь полученный раствор наносили на колонку, через которую затем последовательно пропускали раствор ДНКазы I с ЮмМ МпСЬ и отмывочный буфер. Очищенную суммарную РНК элюировали 100 мкл деионизированной воды, не обладающей нуклеазной активностью. РНК переосаждали 95% этанолом в присутствии подкисленного ацетата натрия (рН 4,5). Осадок растворяли в 10 мкл воды.
смешивали с 2 мкл раствора праймера ТЗОСар (10 пмоль/мкл) и 2 мкл воды и инкубировали при температуре 70С в течение 2 мин, после чего добавляли смесь остальных компонентов, включающую 4 мкл 5х M-MLV буфера (250 мМтрис-НС1.(рН8 3); 375 мМКЄІ; 30 M№MgCl2); 2 мкл раствора dNTP (концентрация каждого нуклеотида 10 тМ), 1 мкл дитиотреитола (10 мМ), 1 мкл раствора обратной транскриптазы M-MLV (200 ед/мкл) и 7 мкл воды. Реакция длилась 90 мин при 45-50С. По окончании реакции объем смеси доводили водой до 200 мкл, затем инактивировали фермент нагреванием (5 мин при 80DG). Раствор кДНК хранили при температуре минус 20О.
Обратная транскрипция для 5 -RACE проводилась по аналогичной методике. Вместо олигонуклеотида ТЗОСар в реакционную смесь добавляли по 10 пмоль олигонуклеотидовТ25 и SMART П.
Качество полученной кДНК проверяли с помощью ПЦР на фрагменты последовательности, кодирующей глицеральдегидфосфатдегидрогеназу (GAPDH). Для матрицы, выделенной из A. marina, использовали пары праймеров 5/6 и 7/8, а для A. aurita - пару 27/28. ПЦР проводили в объеме 20 мкл, смешивая 2 мкл 10х буфера [670 мМ трис-НС1 (рН 8,8); 160 MM(NH4)2S04; 25 мМ MgCb], 3 мкл эквимолярной смеси dNTP (по 1,25 мкМ), по Г мкл раствора каждого из праймеров (10 пмоль/мкл), 2 мкл раствора кДНК, 0,5 мкл CnemTaq-полимеразы; (5 ед/мкл). и требуемое количество воды. Смесь прогревали 10 мин при 95С («горячий старт») и далее проводили 30-35 циклов амплификации в режиме: 94С - 30 с, 55С - 40 с, 72С - 1 мин.
Амплификацию концов кДНК проводили с помощью ДНК-полимеразы Taq Advantage 2 (BDBiosciences), обладающей повышенной процессивностью и точностью чтения. В 20 мкл реакционной смеси для RACE содержалось 2 мкл 10х буфера, 3 мкл раствора эквимолярной смеси dNTP (по 1,25 мкМ), 2 мкл раствора кДНК, 0,5 мкл раствора ДНК-полимеразы Taq Advantage 2, 60 пмоль вырожденного ген-специфического праймера, 2,0 и 0,2 пмоль адаптер-специфических праймеров Т7 и СарТ7, соответственно.
В качестве ген-специфических праймеров для амплификации 3 -концевого фрагмента последовательности из A. marina были взяты праймеры М9 и М10. Температурный режим реакции З -RACE был следующим: 95С - 1 мин («горячий старт»), далее (94С - 30 с, 50С - 40 с, 68С - 2 мин); 35 циклов. 5 -RACE проводили с праймерами М24 и М27 по той же схеме, но с более высокой температурой на стадии отжига (64С).
Амплификацию 3 - и 5 -концевых фрагментов кДНК из A. aurita выполняли в два последовательных этапа: продукты RACE разводили водой в 30 раз и 2 мкл раствора, полученного после разведения, использовали для реамплификация с ген-специфическим праймером, отжигающимся на внутренней части ампликона («semi-nested PCR»). З -RACE проводили с праймерами 1, 2, 13, 14, 33, 34, 35, 36 и далее реамплифицировали каждый из полученных продуктов с парами праймеров 11/Т7 и 12/Т7. Для З -RACE был выбран режим ступенчатого понижения температуры на стадии отжига («stepdown»): 95С - 1 мин, далее (94С - 30 с, 65...53С - 40 с, 68С - 2 мин); 35 циклов. Температура понижалась на 2С через каждые 5 циклов. Режим реамплификации продуктов З -RACE был следующим: 95С - 1 мин, далее (94С - 30 с, 45С - 40 с, 68С - 2 мин); 30 циклов. 5 -RACE и реамплификацию проводили с комбинациями праймеров 52/СарТ7/Т7 и 53/Т7, соответственно. В обоих случаях реакция длилась 30 циклов, а температура на стадии отжига составляла 50С. Остальные параметры не отличались от указанных выше.
Продукты ПЦР фракционировали в агарозном геле, элюировали стандартными способами (из легкоплавкой агарозы, электроэлюцией в 15% PEG-6000) или с использованием набора «Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System» (Promega) и клонировали по аденилированным 3 -концам в векторе pGEM. Процедуры трансформации, скрининга, выделения и очистки плазмидной ДНК на данном и последующих этапах работы проводили согласно руководству [279]. Отбор клонов, содержащих требуемую вставку, осуществляли с помощью сине-белой селекции и ПЦР. Секвенирование ДНК проводилось в Центре коллективного пользования «ГЕНОМ» ИМБ РАН с помощью набора реактивов ABI PRISM BigDye Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant (Applied Biosystems). Для повышения достоверности полученных данных каждый клонированный фрагмент секвенировался дважды в противоположных направлениях.
Определение полной последовательности кДНК, кодирующей предшественник антимикробного пептида аурелина из сцифоидной медузы Aurelia aurita, и соответствующей полной аминокислотной последовательности препроаурелина
В ходе предшествующей работы, проведенной Учебно-научным центром ИБХ РАН (к.х.н. Т.В. Овчинникова) совместно с лабораторией общей патологии НИИ экспериментальной медицины РАМН (проф. В. Н. Кокряков), из сцифоидной медузы Aurelia aurita был выделен и охарактеризован пептид, обладающий антимикробной активностью в отношении грам-положительных (Listeria monocytogenes) и грам-отрицательных (Escherichia coli) бактерий. Пептид, названный аурелином, был выделен из мезоглеи Aurelia aurita с помощью препаративного гель-электрофореза и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Мезоглея содержит фагоцитирующие клетки и является прообразом соединительной ткани более высокоорганизованных видов животных. К началу работы были определены молекулярная масса (m/z [M+Hj+ 4297,8) и частичная N-концевая аминокислотная последовательность (35 аминокислотных остатков) аурелина, а также было установлено наличие в его структуре шести остатков цистеина, образующих три дисульфидные связи.
Первые эксперименты по амплификации З -концевой области кДНК, в ходе которых были последовательно опробованы десять ген-специфических праймеров, не дали ожидаемых результатов. Неудачи на этом этапе могли быть вызваны деградацией РНК при хранении и выделении или низким уровнем экспрессии данного гена. Были предприняты многочисленные попытки по оптимизации структуры праймеров и условий ПЦР, которые, в итоге, привели к разработке схемы двухстадийной амплификации с различными сочетаниями наружных и внутренних ген-специфических праймеров. Продукты З -RACE с каждым из восьми вырожденных праймеров (1, 2, 13, 14, 33, 34, 35, 36) подвергались реамплификации с парами праймеров 11/Т7 и 12/Т7 (рис. 17). Из шестнадцати полученных комбинаций лишь три оказались результативными - с праймерами 1, 13, 36 на первой стадии и праймером 11 на стадии реамплификации. Секвенирование (каждого в двух клонах) фрагментов длиной около 300 п.о. показало, что они содержали последовательность, кодирующую С-концевую область зрелого пептида, и область З -UTR. Длина З -UTR варьировала в клонах, полученных с разными наружными ген-специфическими праймерами. Причинами полиморфизма могли быть некорректная инициация синтеза кДНК в А-богатой области З -UTR (in vitro), либо использование альтернативного сигнала полиаденилирования (in vivo).
Дальнейшие эксперименты по амплификации и секвенированию 5 -концевой области кДНК позволили установить полную структуру транскрипта длиной около 500 п.о. (рис. 18). Анализ нуклеотидной последовательности показал наличие открытой рамки считывания, кодирующей предшественник антимикробного пептида аурелина, состоящий из 84 аминокислотных остатков. Шесть З -концевых и четыре 5 -концевых клона кодировали один и тот же белок; немногочисленные нуклеотидные замены не совпадали в разных клонах и, вероятнее всего, были вызваны ошибками синтеза на стадии ПЦР.
Предшественника непосредственно за последовательностью Arg-Ser-Arg-Arg, представляющей собой типичный сайт протеолиза для конвертаз семейства фурина (наличие этих ферментов у кишечнополостных было доказано экспериментально [51]). С помощью программы SignalP 3.0 была обнаружена вероятная N-концевая сигнальная последовательность, отщепляемая при гидролизе связи А1а22 - Glu23.
Антимикробный пептид аурелин из A. aurita имеет расчетную массу молекулярную массу 4296,95 Да, близкую к экспериментально полученному значению m/z [М+Н]+ 4297,8 Да. Следовательно, аурелин не должен содержать посттрансляционных модификаций. Результаты, секвенирования нуклеотидной последовательности кДНК подтвердили наличие в структуре пептида шести остатков цистеина. Это стало основанием для предварительного отнесения аурелина к семейству дефенсинов - наиболее распространенному и консервативному семейству АМП (см. п. 2.1.1.1). К дефенсин-подобным пептидам относятся дрозомицин, гелиомицин, термицины, скорпин, бутинин, ASABF, митилины и митицины. Кроме того, шесть остатков цистеина содержат молекулы тахистатинов, пенеидинов и микроплюзина, не обладающих гомологией с дефенсинами. Однако уникальный порядок расположения остатков цистеина в новом АМП аурелине, выделенном из A. aurita, отличает его от всех перечисленных здесь пептидов (табл. 2). Его ближайшими гомологами в настоящее время можно считать группу токсинов из яда морских анемон (класс Anthozoa, тип Coelenterata), блокирующих калий-селективные каналы нервных клеток [7; 43; 101; 160; 220; 285]. Выравнивание последовательностей хотя и требует введения достаточно большого числа разрывов, но позволяет убедиться в наличии 30-40% сходных остатков.
