Содержание к диссертации
Введение
1 Литературный обзор 12
1.1 Хитозан 12
1.1.1 Структура. Физико-химические свойства 12
1.1.2 Биологическая активность хитозана 14
1.1.2.1 Антивирусная активность хитозана 17
1.1.2.2 Иммуномодулирующая и противовоспалительная активность 18
1.1.3 Применение хитозана 19
1.2 Каррагинан 20
1.2.1 Структура. Физико-химические свойства 20
1.2.2 Биологическая активность каррагинана 23
1.2.2.1 Антивирусная активность 24
1.2.2.2 Иммуномодулирующая активность 26
1.2.3 Применение каррагинана 27
1.3 Полиэлектролитные комплексы 29
1.3.1 Общее представление о формировании полиэлектролитных комплексов 29
1.3.1.1 Формирование полиэлектролитных комплексов на основе хитозана 30
1.3.1.2 Формирование полиэлектролитных комплексов каррагинан-хитозан 34
1.3.2 Методы изучения полиэлектролитных комплексов 35
1.3.2.1 Основные понятия реологии. Классификация материалов по их реологическому поведению 36
1.3.3 Применение полиэлектролитных комплексов 39
2 Результаты и обсуждение 42
2.1 Получение и характеристика исходных компонентов комплекса 42
2.1.1 Выделение и фракционирование каррагинана из водоросли Tichocarpus
crinitus 42
2.1.2 Получение образцов низкомолекулярного и N-дезацетилированного хитозана 2.1.3 Физико-химические характеристики полисахаридов. 46 2.2 Получение полиэлектролитных комплексов каррагинан-хитозан 46
2.2.1 Подбор условий для формирования растворимых комплексов каррагинан хитозан 46
2.2.1.1 Влияние способа получения полиэлектролитного комплекса на его растворимость 47
2.2.1.2 Влияние параметров среды на процесс формирования комплексов каррагинан-хитозан 49
2.2.1.3 Влияние структуры и молекулярной массы каррагинана на процесс формирования комплексов каррагинан-хитозан 51
2.2.1.4 Влияние концентрации каррагинана на процесс формирования комплексов каррагинан-хитозан 52
2.2.1.5 Влияние молекулярной массы и степени N-ацетилирования хитозана на процесс формирования комплексов каррагинан-хитозан 53
2.3 Характеристика образования растворимых комплексов каррагинан-хитозан 56
2.3.1 Гель-проникающая хроматография 57
2.3.2 Центрифугирование в градиенте перколла 58
2.3.3 ИК-спектроскопия 63
2.4 Изучение in silico комплексов хитозана с -каррагинаном в растворе 64
2.5 Определение параметров связывания каррагинана с хитозаном 68
2.6 Размер и -потенциал комплексов -каррагинана с хитозаном 72
2.7 Исследование макромолекулярной организации полиэлектролитных комплексов методами микроскопии 75
2.7.1 Электронная микроскопия 75
2.7.2 Атомно-силовая микроскопия 76
2.8 Получение и реологические свойства гелевых комплексов каррагинан-хитозан 2.9 Биологическая активность in vitro комплексов каррагинан-хитозан 84
2.9.1 Антивирусная активность полисахаридов и их комплексов каррагинан-хитозан на модели вируса табачной мозаики 84
2.9.2 Цитокин-индуцирующая активность полисахаридов и их комплексов каррагинан-хитозан 2.9.3 Антиоксидантная активность полисахаридов и их комплексов каррагинан хитозан 86
2.10 Биологическая активность in vivo полисахаридов и их комплексов каррагинан хитозан 87
2.10.1 Противовоспалительное действие полисахаридов и их комплексов каррагинан-хитозан 88
2.10.2 Гастропротекторное и противоязвенное действие полисахаридов и их
комплексов каррагинан-хитозан 93
3 Материалы и методы 98
3.1 Используемые в работе полисахариды 98
3.2 N-Дезацетилирование хитозана 98
3.3 Получение низкомолекулярного хитозана 98
3.4 Выделение и фракционирование каррагинана 99
3.5 Приготовление растворимых и гелевых полиэлектролитных комплексов 100
3.5.1 Растворимые комплексы 100
3.5.2 Приготовление гелей 100
3.6 Определение молекулярной массы полисахаридов 100
3.7 Основные аналитические методы 101
3.8 Турбидиметрический метод 101
3.9 Гель-проникающая хроматография 102
3.10 Центрифугирование в градиенте перколла 102
3.11 ИК-спектроскопия 103
3.12 Компьютерное моделирование 103
3.13 Метод конкурентного связывания с использованием анионного красителя тропеолина 000-I 104
3.14 Измерение размера и -потенциала 105
3.15 Электронная микроскопия 105
3.16 Атомно-силовая микроскопия 106
3.17 Измерение реологических параметров 106
3.18 Биологическая активность in vitro 107
3.18.1 Антивирусная активность 107
3.18.2 Цитокин-индуцирующая активность 108
3.18.3 Антиоксидантная активность 108
3.19 Биологическая активность in vivo 108
3.19.1 Противовоспалительая активность 108
3.19.2 Иммуномодулирующая активность 109
3.19.3 Гастропротекторная и противоязвенная активность 110
Выводы 113
Список литературы
- Биологическая активность хитозана
- Формирование полиэлектролитных комплексов каррагинан-хитозан
- Влияние концентрации каррагинана на процесс формирования комплексов каррагинан-хитозан
- Центрифугирование в градиенте перколла
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Одной из актуальных задач современной биологии и медицины является создание новых композитных материалов с широким спектром биологической активности и минимальным побочным действием. В последние годы для их получения используются как синтетические, так и природные полимеры, в зависимости от структуры которых могут формироваться стехиометрические или нестехиометрические композиты в виде раствора, геля, нано- и микрочастиц, пленок, мембран, и жидкокристаллических дисперсий. В создании таких полимерных систем особая роль отводится полиионным полисахаридам морского происхождения благодаря их биоразлагаемости, биосовместимости, доступности и разнообразной биологической активности. Способность противоположно заряженных полиионов образовывать полиэлектролитные комплексы (ПЭК) открывает возможность создания на их основе различного рода биологически активных композитов.
Среди полианионных полисахаридов важное место занимают каррагинаны – линейные сульфатированные полисахариды красных водорослей, построенные из остатков D-галактозы и ее производных, соединенных -(14) и -(13) гликозидными связями. Структурное разнообразие каррагинанов обусловлено присутствием -(14)-связанной 3,6-ангидрогалактозы, местоположением и количеством сульфатных групп и нерегулярной или гибридной структурой полисахарида. Каррагинаны обладают уникальными физико-химическими свойствами и разнообразной биологической активностью, в том числе выраженной антивирусной, антимикробной, иммуномодулирующей и антикоагулирующей.
Хитозан – природный поликатионный линейный полисахарид,
полимерная цепь которого состоит из -(14)-связанных остатков
D-глюкозамина и N-ацетил-D-глюкозамина. К настоящему времени установлено,
что хитозан обладает широким спектром биологической активности, в том числе
гиполипидемической, гепатопротекторной, радиопротекторной,
антибактериальной и противовирусной.
Биологические и физико-химические свойства ПЭК, полученных на основе каррагинанов и хитозанов, могут существенно отличаться от свойств исходных полимеров и будут зависеть, как от структурных особенностей полисахаридов (молекулярной массы, плотности заряда, распределения ионизированных групп вдоль полимерной цепи, конформации в растворе и макромолекулярной организации), так и от условий, при которых происходит образование комплексов.
Сокращения, используемые в тексте: АСМ – атомно-силовая микроскопия; ВТМ – вирус табачной мозаики; ДРС – динамическое рассеяние света; ИК – инфракрасный; ИП – индекс Паулса; К – каррагинан; ММ – молекулярная масса; ПЭК – полиэлектролитный комплекс; СА – степень N-ацетилирования; СС – степень сульфатирования; ТИ – тиксотропный индекс; ФНО – фактор некроза опухоли; Х – хитозан; ЯМР – ядерный магнитный резонанс.
Изучение влияния всех этих факторов позволит дополнить представление о механизме образования ПЭК и расширит возможности получения новых композитных материалов с заданными физико-химическими характеристиками и биологической активностью. Наличие в нашем распоряжении ряда каррагинанов различных структурных типов с одной стороны и хитозанов разной степени N-ацетилирования и полимеризациии с другой, позволит получить широкий набор ПЭК и выбрать наиболее эффективные из них.
Получение растворимых форм комплексов каррагинан-хитозан позволит расширить возможности применения ПЭК и увеличить их биодоступность. В связи с этим, в данной работе основное внимание уделено получению растворимых форм ПЭК каррагинана с хитозаном и изучению их состава, макромолекулярной организации и биологической активности.
Целью диссертационной работы является получение и характеристика полиэлектролитных комплексов каррагинан-хитозан, изучение влияния структурных особенностей полисахаридов на процесс формирования комплексов, а также экспериментальное обоснование возможности использования полиэлектролитных комплексов для биомедицинского назначения.
Основные задачи диссертационной работы:
-
Получить и охарактеризовать каррагинаны различных структурных типов и хитозаны с разной степенью N-ацетилирования и полимеризации;
-
Подобрать условия образования растворимых комплексов каррагинан-хитозан;
-
Изучить влияние на процесс формирования комплексов структуры и молекулярной массы полисахаридов, концентрации и соотношения исходных компонентов, а также условий среды;
-
Охарактеризовать полученные ПЭК (определить их размер, -потенциал, константы связывания каррагинана с хитозаном и изучить макромолекулярную организацию комплексов);
5. Получить гелевые формы ПЭК и оценить их реологические свойства;
6. Изучить биологическую активность полученных комплексов в сравнении с
исходными полисахаридами.
Научная новизна работы. Впервые охарактеризованы растворимые ПЭК каррагинан-хитозан (К-Х), полученные на основе каррагинанов различных структурных типов с хитозанами разной степени N-ацетилирования и полимеризации. Показано влияние структурных особенностей полисахаридов на процесс формирования комплексов. Впервые определены константы связывания каррагинана с хитозаном, методом компьютерного моделирования рассчитаны теоретические модели пространственных структур комплексов. Впервые методом атомно-силовой микроскопии изучена надмолекулярная структура комплексов К-Х, и показана ее зависимость от соотношения исходных компонентов. Впервые показано, что комплексы К-Х обладают гастропротекторной активностью, которая зависит от их состава.
Практическая значимость работы. На основе полисахаридов морских гидробионтов создано средство, обладающее гастропротекторной активностью и
представляющее собой водорастворимый ПЭК каррагинана с хитозаном при
соотношении Х:К 10:1 в/в. Показано, что парентеральное введение ПЭК
каррагинан-хитозан экспериментальным животным достоверно снижает
выраженность воспалительной реакции организма, индуцированной гистамином.
Полученный ПЭК может найти применение в медицине для профилактики и
лечения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, а также для
снижения побочного ульцерогенного действия нестероидных
противовоспалительных средств и других лекарственных препаратов.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Подобраны условия для получения комплексов каррагинан-хитозан в растворимой и гелевой форме.
-
Образование растворимых ПЭК в широком диапазоне соотношений исходных компонентов определяется степенью сульфатирования каррагинанов и степенью N-ацетилирования хитозанов.
-
Высокосульфатированный x-К полностью связывается с хитозанами различной степени полимеризации, а хитозан с низкой степенью полимеризации полностью связывается с каррагинанами (-К и x-К).
-
Гелевые формы полученных ПЭК представляют собой неньютоновские псевдопластичные жидкости с тиксотропными свойствами.
-
Макромолекулярная структура ПЭК зависит от концентрации и соотношения исходных полисахаридов.
-
Комплексы с высоким содержанием каррагинана проявляют цитокин-индуцирующую, антивирусную и антиоксидантную активности in vitro.
-
ПЭК каррагинан-хитозан снижают выраженность воспалительной реакции, индуцированной гистамином, и проявляют гастропротекторную активность, которая зависит от их состава.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены автором в виде устных и стендовых сообщений на XIII и XIV Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, Россия, 2010, 2012); «Renewable wood and plant resources: chemistry, technology, pharmacology, medicine» (Санкт-Петербург, Россия, 2011); «2nd International symposium on life sciences» (Владивосток, Россия, 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в международных журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 7 тезисов докладов в материалах научных конференций.
Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании отдела молекулярной иммунологии ТИБОХ ДВО РАН 18 февраля 2014 г.
Личный вклад соискателя в проведение исследования.
Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором и совместно с сотрудниками ЛМОАБИ и других лабораторий ТИБОХ ДВО РАН, а также совместно с сотрудниками ИАПУ ДВО РАН и НИОХ СО РАН. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль соискателя была определяющей.
Структура и объем диссертации. Диссертация содержит разделы: Введение, Литературный обзор, Результаты и обсуждение, Материалы и методы,
Выводы и Список литературы, включающий 217 наименований. Диссертация изложена на 137 страницах. Результаты представлены в 18 таблицах и иллюстрированы 30 рисунками.
Автор выражает искреннюю благодарность своему руководителю д.х.н. И.М. Ермак за неоценимую помощь в выполнении диссертационной работы, к.х.н. В.Н. Давыдовой, к.х.н. В.И. Горбачу за любезное предоставление образцов полисахаридов и помощь при проведении экспериментов, д.х.н. Т.Ф. Соловьевой и всем сотрудникам ЛМОАБИ ТИБОХ ДВО РАН, В.П. Глазунову за получение и помощь в интерпретации ИК-спектров, д.б.н. А.В. Реунову и к.б.н. В.П. Нагорской за проведение экспериментов по антивирусной активности полисахаридов и их комплексов, к.ф-м.н. Г.Н. Лихацкой за компьютерное моделирование взаимодействия каррагинана с хитозаном. Сотрудникам ИАПУ ДВО РАН к.ф-м.н. Е.А. Чусовитину и С.А. Балагану за предоставление возможности проведения экспериментальных работ на атомно-силовом микроскопе и помощь в интерпретации результатов, а также сотрудникам НИОХ СО РАН д.б.н. И.В. Сорокиной, д.б.н. Т.Г. Толстиковой и М.П. Долгих за проведение экспериментов по изучению биологической активности in vivo.
Биологическая активность хитозана
Несмотря на простую структуру, хитозан имеет достаточно сложные физико химические свойства. Степень N-дезацетилирования (СД) – один из наиболее важных химических параметров, влияющих на свойства хитозана и обуславливающих области его применения. Этот показатель определяет значение pKa, которое может варьироваться в пределах от 6,46 до 7,32 [10-12]. Основная трудность, с которой сталкиваются исследователи при работе с хитозаном, заключается в его растворимости. Установлено, что физико-химические характеристики хитозана и конформационное состояние его молекул в растворе главным образом зависят от СД хитозана, распределения ацетильных групп вдоль полимерной цепи, рН и ионной силы среды [13-15]. При СД 80 % в определенном интервале значений ионной силы кулоновское отталкивание протонированных аминогрупп хитозана является доминирующим. При 50 СД 80 % дополнительный вклад в межмолекулярные взаимодействия вносят водородные связи, образующиеся с участием ацетильных групп хитозана. Объемность ацетильных остатков и сеть водородных связей создают стерические затруднения в макромолекуле полимера и затормаживают вращение пиранозных звеньев вокруг Р-гликозидной связи, в результате чего повышается жесткость полисахаридной макромолекулы. По мере уменьшения СД влияние этих эффектов возрастает, усиливаются гидрофобные взаимодействия, что в результате приводит к усилению самоагрегации молекул хитозана в растворах [11].
Большинство образцов хитозана растворяется в разбавленных кислых растворах, проявляя свойства катионного полиэлектролита [13], для которого характерен полиэлектролитный эффект, приводящий к аномально высоким значениям характеристической вязкости и молекулярной массы (ММ) полимера [16]. Наблюдаемая для хитозана нелинейная зависимость приведенной вязкости от концентрации полимера, характерная для полиэлектролитов, объясняется явлением полиэлектролитного набухания полимера [13]. Как было показано [15], проявление полиэлектролитного эффекта увеличивается с уменьшением ионной силы раствора. В связи с этим для получения достоверных значений физико-химических параметров хитозана влияние полиэлектролитного эффекта компенсируют добавлением в раствор полимера низкомолекулярного электролита [14].
Для разбавленных кислых растворов хитозана отмечается высокое значение характеристической вязкости (г), что, наряду с полиэлектролитным эффектом, объясняется еще и образованием водородных связей между молекулами полимера [17]. Благодаря своей гидрофильной природе, поликатион образует в растворе ассоциаты, значительную роль, в образовании которых, играют водородные связи [18, 19]. Процесс агрегации хитозана зависит также от концентрации полимера в растворе [11].
К настоящему времени установлено, что хитозан обладает гиполипидемической, гипополихолестеринемической, гепатопротекторной, антитоксической, радиопротекторной, иммуностимулирующей, антиоксидантной, антибактериальной, противовирусной активностями, он также регулирует кислотность желудочного сока, обладает противоязвенным действием, нормализует микрофлору кишечника [20].
Несмотря на обширный спектр биологической активности, практическое применение хитозана зачастую ограничено плохой растворимостью в воде. Именно поэтому большую ценность представляют его деполимеризованные продукты [21].
Кроме того, для расширения спектра физиологической активности хитозана получают его сульфатированные, карбоксилированные и другие призводные.
Показано, что биологическая активность хитозана напрямую зависит от химической структуры молекулы, в частности, от молекулярной массы, а также от степени его N-ацетилирования [21, 22]. Низкомолекулярный хитозан обладает мощным липотропным действием – способностью связывать жиры, что является важнейшим фактором предупреждения атеросклероза и ожирения. Еще одно его важное качество – способность связывать радионуклиды, тяжелые металлы и токсины, а также нарушать целостность наружной оболочки вредных микроорганизмов и бактерий, что существенно снижает риск их развития в организме [21, 23]. На моделях язвы желудка у крыс, индуцированной этанолом, уксусной кислотой или индометацином, показано, что низкомолекулярный хитозан (25-50 кДа) проявляет гастропротекторную активность, носящую дозозависимый характер (250 - 1000 мг/кг) [24, 25].
Хитозан проявляет себя как антимикробный препарат по отношению к некоторым видам грибов, дрожжей и бактерий. Противогрибковая активность хитозана выше при низких значениях pH [26]. Кроме того, исследования показывают, что антибактериальная активность хитозана существенно зависит от таких факторов, как рН среды, ионная сила раствора, наличия кислоты, присутствия катионов металлов [27].
Рядом исследований показано, что водорастворимые формы хитозана, преимущественно в высоких концентрациях, проявляют антибактериальную активность по отношению к микроорганизмам видов Bacillus sp., Pseudomonas Fragi и Cryptococcus Albidus. [21].
Антибактериальный эффект хитозана в отношении Escherichia coli и Staphylococcus aureus оценивали по количеству разрушенных клеточных стенок и степени их поврежденности, регистрируемой наличием некоторых ферментов, нуклеотидов и других компонентов, присутствие которых в клетке определяет ее жизнеспособность. Было установлено, что в основе механизма действия хитозана на бактерии лежат два последовательных процесса: отделение клеточной стенки от клеточной мембраны, а затем собственно разрушение клеточной мембраны [28].
Формирование полиэлектролитных комплексов каррагинан-хитозан
Таким образом, результаты гель-проникающей хроматографии и центрифугирования в градиенте перколла позволили установить, что каррагинан с высокой СС (x-К) полностью связывается с хитозанами различной степени полимеризации. При взаимодействии менее сульфатированных каррагинанов с хитозаном наряду с образованием ПЭК в системе остаются несвязанные исходные полисахариды. Хитозан с низкой степенью полимеризации полностью связывается с -К и x-К.
Формирование ПЭК К-Х регистрировали методом ИК-спектроскопии (рис. 18), проведя разложение спектров на индивидуальные компоненты и сравнив соотношение характерных для каррагинана полос поглощения в исходном полисахариде и его комплексе с хитозаном. Эта работа была выполнена совместно с к.ф-м.н. В. П. Глазуновым в ТИБОХ ДВО РАН.
ИК-спектр исходного -К содержит полосы поглощения: валентных колебаний сульфатных групп при 1259 см"1, скелетных колебаний углеводного кольца при 1065 см"1, 3,6-ангидрогалактозы при 930 см"1, сульфатной группы при четвертом атоме углерода при 842 см"1.
ИК-спектр хитозана содержит полосы поглощения при 1655 см"1 (c=o), 1593 см"1 (NH2), соответствующие амиду I и амиду II, и полосы в области 1200-800 см"1, характерные для колебаний углеводного скелета.
Разложение ИК-спектра на индивидуальные компоненты позволило оценить образование ПЭК вследствие связывания сульфатных групп каррагинана с аминогруппами хитозана. Для этого были рассчитаны отношения площадей полос поглощения каррагинана и его комплекса с хитозаном при 1259 см"1 (валентные колебания v(S03")) и при 842 см"1 (деформационные колебания 5(S-0-C(4)).
В литературе при анализе спектров ПЭК на основе хитозана, как доказательство их образования, обычно приводят изменение интенсивности поглощения полос в области 1400 - 1600 см"1, которые относят к группе NH3+ [143, 185, 192]. Однако, мы считаем, что подобное соотнесение является некорректным, так как область, соответствующая этой полосе поглощения, перекрывается с областями, характерными для других групп свободного хитозана. Поэтому при анализе ИК-спектров исходных компонентов и регистрации образования ПЭК были использованы полосы поглощения каррагинана при 1259 см"1 (валентные колебания v(S03")) и при 842 см"1 (деформационные колебания 5(S-0-C(4)), поскольку вклад от поглощения хитозана для этих полос (1259 и 842 см"1) примерно одинаков. Расчет показал, что для -К отношение (R) площадей полос S1259 и Sg42 равно 4.0, в то время как в комплексе К-Х R = 1.7. Такое уменьшение отношений площадей полосы поглощения сульфатных групп в комплексе (более, чем в два раза) указывает на связывание этих групп -К с аминогруппами хитозана.
Изучение in silico комплексов хитозана с к-каррагинаном в растворе Широко используемые в последние годы методы компьютерного моделирования были использованы для изучения взаимодействия хитозана с каррагинаном и оценки структур образующихся комплексов. Были рассчитаны теоретические модели пространственных структур хитозана, -К и их комплексов в
водной фазе. Эта работа была выполнена совместно с к.ф-м.н. Г. Н. Лихацкой в ТИБОХ ДВО РАН.
Теоретическая модель структуры -К (рис. 19) в водном растворе получена с использованием кристаллической структуры -К (код PDB 1CAR), в молекуле которого имеется дополнительная сульфатная группа. Модификация структуры -К, построение двойной спирали и оптимизация структуры -К в водном растворе проводились с помощью программы MOE 2011.10. Расчеты показали, что структура двойной спирали -К стабилизируется внутри- и межмолекулярными водородными связями. Электростатический потенциал молекулярной поверхности двойной спирали -К имеет электроотрицательные участки.
Согласно полученным данным (рис. 20) структура протонированной формы хитозана в водной фазе стабилизируется внутримолекулярными водородными связями НО3-О и N2-О6. Молекулярная поверхность хитозана имеет положительный потенциал.
В первой серии экспериментов была получена полноатомная модель комплекса пентасахаридного фрагмента хитозана с -К (рис. 21) и рассчитаны структуры 30 возможных комплексов. В таблице 4 представлены результаты анализа контактов, стабилизирующих структуру комплекса.
Влияние концентрации каррагинана на процесс формирования комплексов каррагинан-хитозан
Известно, что основные эффекты гистамина опосредованы его взаимодействием с Н1- и Н2-гистаминовыми рецепторами сосудов, нервных окончаний и клеток-эффекторов воспаления. При субплантарном введении гистамин вызывает дилатацию мелких сосудов и повышение проницаемости сосудистой стенки. Это приводит к выходу белков и жидкости из сосудистого русла и возникновению местного отека. Гистамин также вызывает раздражение чувствительных нервных окончаний, что вызывает боль. Кроме того, гистамин повышает адгезивные свойства эндотелия сосудов и способствует миграции лейкоцитов и макрофагов в очаг острого воспаления. Таким образом, гистамин запускает острый воспалительный ответ, который в последующем пролонгируется другими гуморальными и клеточными медиаторами воспаления. В частности, на фоне гистамина происходит стимулирование синтеза провоспалительных простагландинов в результате активации циклооксигеназы.
Исследование противовоспалительной активности проводили на модели воспаления, индуцированного гистамином. Эта работа была выполнена совместно с сотрудниками лаборатории фармакологических исследований НИОХ СО РАН.
Как видно из таблицы 11, предварительное парентеральное введение ПЭК К-Х и отдельно взятых полисахаридов мышам достоверно снизило выраженность воспалительной реакции, индуцированной гистамином, во всех группах. Наиболее высокий эффект среди комплексов выявлен у Х:-К 10:1 в/в (51%), который не имел достоверных различий с эффектом референсного агента индометацина (65%). Соответствующая активность остальных комплексов была несколько ниже, чем у индометацина. Высокую активность, не уступающую референс-агенту, продемонстрировали свободные полисахариды -К и хитозан (соответственно 52 и 53%). По-видимому, их высокая активность определила и высокую эффективность комплексов, где их массовая доля превалировала (Х:-К 10:1 в/в и -К:Х 10:1 в/в). Наименее выраженные противовоспалительные свойства в ряду протестированных соединений обнаружены у комплекса с высоким содержанием -К (37%), а также у свободного -К (37%). При этом отмечена обратная зависимость противовоспалительного действия ПЭК с -К от его содержания в комплексе. Чтобы подтвердить это предположение, был проведен дополнительный эксперимент, в котором концентрация свободного -К точно совпадала с его содержанием в соответствующем комплексе (таблица 12).
Сравнение данных таблицы 12 подтверждает, что противовоспалительная активность -К падает с увеличением дозы.
Модель формалинового отека лапы является примером ноцицептивно-экссудативного воспаления, опосредованного, главным образом, калликреин кининовой системой. Кинины образуются в тканях при воспалении. Они действуют местно, вызывая боль, повышение проницаемости и расширение сосудов, усиливая синтез простагландинов. Формалин вызывает характерный двухфазный болевой ответ: ранняя фаза отражает острую боль, а поздняя фаза отражает хроническую боль, которая связана с центральной ноцицепцией. Ведущим провоспалительным медиатором в данном случае является брадикинин, который образуется из XII фактора системы свертывания крови (фактор Хагемана). Активность калликреин-кининовой системы при воспалении тесно связана с ее влиянием на гуморальные факторы систем фибринолиза и свертывания крови. Мишенью брадикинина являются кининовые рецепторы В1 и В2.
Следующая серия экспериментов по исследованию противовоспалительной активности была проведена на модели воспаления, индуцированного формалином (таблица 13). Результаты эксперимента на формалиновой модели воспаления не выявили противовоспалительного действия у всех протестированных агентов. Все полисахариды и их комплексы проявили небольшой провоспалительный эффект. Это может быть связано как со спецификой данной модели воспаления и, соответственно, с отсутствием эффекторов, чувствительных к действию полисахаридов, так и с низкими значениями индекса отека в контроле. С последним, вероятно, также связана низкая активность индометацина.
Проведенное исследование противовоспалительных свойств полисахаридов -К и хитозана и их полиионных комплексов на моделях воспаления различного генеза показало, что они наиболее эффективны при эксудативном воспалении, вызванном гистамином. В этих условиях их активность сравнима с нестероидными противовоспалительными средствами, действие которых основано на неизбирательном угнетении циклооксигеназы 1 и 2 на мембранах эндотелия и клеток крови с последующим нарушением синтеза простагландинов E2 и F2, тромбоксана A2, простациклина, лейкотриенов и выбросом лизосомальных ферментов в очаге воспаления. Возможно, полисахариды используют аналогичный механизм в результате непосредственного контакта с мембранами эффекторных клеток. В этом случае нельзя также исключить и возможности «перехвата» полисахаридами в очаге воспаления других провоспалительных медиаторов и цитокинов, активирующих клетки-эффекторы воспалительного ответа. Следует подчеркнуть, что в условиях гистаминного воспаления в комплексе К-Х не снижается противовоспалительная активность свободных полисахаридов.
На модели «псевдоаллергического» воспаления лапы, индуцированного конканавалином А, был также оценен противовоспалительный эффект полисахаридов и их комплексов К-Х.
Поливалентный лектин конканавалин А стимулирует высвобождение гистамина и лейкотриенов из тучных клеток и базофилов, активирует нейтрофилы, повышает активность циклооксигеназы-2 и стимулирует пролиферацию и дифференцировку лимфоцитов (митоген для Т-хелперов). Активированные лектином клетки выделяют различные медиаторы воспаления, быстро вызывая выраженный отек и воспаление по типу аллергической реакции, но без контакта с аллергеном.
Центрифугирование в градиенте перколла
Индукция цитокинов ФНО-альфа. Процесс обработки крови проводили согласно методике [217]. Способность высокомолекулярного хитозана и его комплексов с различными типами каррагинанов индуцировать синтез фактора некроза опухоли - а (ФНО-а) в опытах in vitro. Венозная кровь была собрана в 5 мл стерильные пробирки, содержащие 1501 U гепарина, разбавлена 1:5 в стерильной среде 199 (Sigma, США), содержащей 300 мг/л L-глютамина (Sigma, США) и 50 мкг/мл гентамицина («Белмедпрепарат», Белоруссия). Разбавленную кровь (по 0.1 мл в каждой ячейке) в стерильном 96-луночном планшете (Costar, США) инкубировали с каррагинаном, хитозаном или комплексами. Через 24 часа супернатанты были собраны и цитокины определены с помощью специфической тест-системы (ООО «Цитокин», Россия). Для индукции использовали растворы с концентрациями: каррагинана - 100 и 1 нг/мл; хитозана - 100 и 1 нг/мл; и комплекса К:Х 200 и 2 нг/мл.
Антиоксидантная активность Определение способности полисахаридов связывать оксид азота проводили на основе метода, описанного Грином с соавторами (1982) с небольшими модификациями. Реакционная смесь содержала нитропруссид натрия (10 мМ, 75 мкл) в ФСБ и образцы исследуемых веществ с различными концентрациями (0.25 -1.00 мг/мл, 75 мкл). Смесь инкубировали при 25С в течение 150 мин. Затем к смеси добавляли реактив Грисса (1% сульфаниламид, 0.1% К-(І-нафтил)-этилендиамина дигидрохлорид в 2% фосфорной кислоте) в соотношении 1:1. Оптическую плотность измеряли при 546 нм. Аскорбиновая кислота была использована в качестве положительного контроля.
Биологическая активность in vivo 3.19.1 Противовоспалительная активность Для оценки противовоспалительного эффекта комплексов брали беспородных мышей массой 25-30 г в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных». Все эксперименты с животными были проведены в соответствии с нормативами. Животные содержались в стандартных условиях, получая пищу и воду ad libitum.
Воспалительный отек вызывали введением в апоневроз задней лапы по 0.05 мл водных растворов 0.01% гистамина или 3% формалина. За 1 час до введения флогогенов опытным группам вводили внутрибрюшинно агенты, предварительно растворенные в воде: комплексы в дозе 10 мг/кг, исходные полисахариды (-К, -К, хитозан) – в дозе 9 мг/кг, которая соответствует их максимальной дозе в составе комплексов. Референсной группе вводили индометацин («Fluka Biochemica», Италия) в эффективной дозе 50 мг/кг. Через 5 часов после введения гистамина (формалина) мышей забивали цервикальной дислокацией.
Величину отека определяли по разности масс воспаленной и здоровой лап. Для каждого животного рассчитывали индекс воспаления как отношение этой разности к массе здоровой лапы. Различия считали достоверными с вероятностью Р 0.05. Для опытной и референсной группы рассчитывали величину отека относительно контроля, который принимали за 100%. За противовоспалительный эффект принимали разность относительной величины отека в контрольной группе и соответствующим значением в опытных группах.
Иммуномодулирующая активность
Для оценки иммуномодулирующей активности брали беспородных самцов мышей массой 25-30 г в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных». Все эксперименты с животными были проведены в соответствии с нормативами. Животные содержались в стандартных условиях, получая пищу и воду ad libitum.
На модели «псевдоаллергического» воспаления лапы, индуцированного конканавалином А, исследовали противовоспалительный эффект соединений. «Псевдоаллергический» отек вызывали у мышей введением в апоневроз задней лапы по 0.02 мл раствора конканавалина А в концентрации 5 мг/мл. За час до введения лектина опытным группам вводили внутрибрюшинно агенты, предварительно растворенные в воде: комплексы в дозе 10 мг/кг, исходные полисахариды (-К, -К, хитозан) – в дозе 9 мг/кг, которая соответствует их максимальной дозе в составе комплексов. Референсной группе вводили диклофенак в эффективной дозе 8 мг/кг. Через час после введения конканавалина А мышей забивали цервикальной дислокацией и определяли индекс отека лапы.
Величину отека определяли по разности масс воспаленной и здоровой лап. Для каждого животного рассчитывали индекс воспаления как отношение этой разности к массе здоровой лапы. Различия считали достоверными с вероятностью Р 0.05. Для опытной и референсной группы рассчитывали величину отека относительно контроля, который принимали за 100%. За противовоспалительный эффект принимали разность относительной величины отека в контрольной группе и соответствующим значением в опытных группах.
Оценку влияния агентов на клеточный иммунный ответ проводили с использованием в качестве модели реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана (ЭБ).
Изучаемые вещества вводили однократно до иммунизации внутрибрюшинно в объеме 0.2 мл/10г: комплексы в дозе 5 мг/кг, исходные полисахариды (-К, -К, хитозан) – в дозе 4.5 мг/кг, которая соответствует их максимальной дозе в составе комплексов. Контрольным животным в те же сроки вводили физиологический раствор. Через сутки после введения агентов индуцировали реакцию ГЗТ внутрибрюшинным введением суспензии эритроцитов барана (107 ЭБ). Для оценки величины реакции мышам на пятые сутки после иммунизации в подушечку одной из лап вводили разрешающую дозу антигена (108 ЭБ), в контрольную лапу -физиологический раствор. Через 24 ч после инъекции определяли массу опытной и контрольной лап и по разнице их масс, выраженной в процентах, рассчитывали индекс реакции (ИР).
