Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди непротеиногенных аминокислот особое место занимают различные нуклеоаминокислоты, сочетающие в себе структурные элементы двух важнейших классов биополимеров -белков и нуклеиновых кислот.
В настоящей работе под этим термином подразумеваются ос-аминокарбоновые кислоты, несущие в боковой цепи пиримидиновое или пуриновое нуклеиновое основание, присоединенное к аминокислотному фрагменту по атому »г(пиримидин) и Ng (пурин). На рис.1.показаны некоторые представители нуклеоаминокислот, а именно, 3-(урацилил-І)аланин (і, ті), 3-(тиминил-1)аланин -(2, Таї) и 3-(аденинил-9)аланин (з, Ааі).
иам-сн-соон
(1)
HjN-Ot-COOH
(2)
мн2
сн,
(3)
Рисі
Пептида, в состав которых входят нуклеоаминокислоты, получили название нуклеопептидов.
Нуклеопептиды можно разделить на 3 . основных типа: I) гомонуклеопептиды (построенные из остатков одной и той же нуклеоаминокислоты); 2) гетеронуклеопептида (построенные из остатков различных нуклеоаминокислот); 3) нуклеопептиды смешанного типа, содержащие наряду с остатками нуклеоаминокислот, остатки других, в частности белковых аминокислот.
Гомо- и гетеронуклеопептида мокно рассматривать как аналоги олигонуклеотидов, в которых сахарофосфатный остов заменен на пептидную цепь, что делает их неуязвимыми для ферментов нуклеинового обмена. Обладая всеми необходимыми структурными элементами для
участия в комплементарных взаимодействиях, эти соединения могут найти широкое применение в молекулярной биологии для регуляции экспрессии генов.
Предметом данного исследования являются , главным образом, нуклеопептида смешанного типа, а именно, аналоги природных пептидов, содержащие в своем составе остатки нуклеоаминокислот.
Интерес к аналогам биологически активных пептидов особенно возрос в связи с обнаружением в 70-х годах нового класса природных биорегуляторов - нейропептидов.т.е. пептидов, влияющих на центральную нервную систему. Эти вещества, действующие высокоспецифич-. но и в низких концентрациях, оказались весьма перспективными прототипами для целенаправленного создания лекарственных средств. Дело в том, что эндогенные нейропептида имеют ряд недостатков, в частности таких, как быстрая деградация под действием протеаз организма, а также, в некоторых случаях, широкий спектр биологических эффектов. Поэтому актуальной задачей является создание фермен-тостабильных аналогов нейропептидов, обладающих селективностью действия и высокой биологической активностью.
Объектами данного исследования явились такие нейропептида, как киоторфин, энкефалины, дерморфин (dm) и дельторфин, проявляющие опиоидную активность,гистидинсодержащие пептиды карнозин и циклогистидилпролин (ЦГП), обладающие антиоксидантной активностью, а также С-концевые фрагменты желудочно-кишечного гормона гастри-на.
Для синтеза фершнтоустойчивых аналогов нейропептидов использован подход, основанный на замене определенных аминокислотных остатков природного биорегулятора остатками непротеиногенных аминокислот.
В настоящее время насчитывается несколько сотен небелковых аминокислот, природного или синтетического происхождения,которые широко используются в мировой практике с целью создания аналогов эндогенных пептидов. Введение в структуру пептида остатков небелковых аминокислот преследует также такие цели, как улучшение ли-ганд-рецепторного связывания за счет электростатических и гидрофобных взаимодействий, формирование биологически активной конфор-мации, улучшение фармакокинетических свойств аналога, влияние на его транспорт, метаболизм и другие. Использование описанного под-
хода при синтезе аналогов приводит во многих случаях к соединениям с высокой биологической активностью.
Хотя нуклеоаминокислотн ранее не применялись в пептидном синтезе, они имеют ряд преимуществ перед другими непротеиногенными аминокислотами. Во-первых, это гибридные молекулы с уникальной структурой, сочетающие в себе структурные фрагменты белков и нуклеиновых кислот. Во-вторых, нуклеоаминокислотн и родственные им соединения широко распространены в природе, в том числе в составе пептидов, что делает их особенно привлекательными для модификации эндогенных нейропептидов. В-третьих, нуклеоаминокислотн являются нетоксичными веществами, продукты метаболизма нуклеопептидов также нетоксичны, что имеет решающее значение для потенциальных лекарственных средств. Кроме того, нуклеоаминокислотн и их проиводные обладают рядом интересных биологических свойств.
В структурном отношении нуклеиновое основание, выступающее в роли бокового радикала аминокислота, способно благоприятно влиять на связывание с рецептором, на формирование биологически активной конформации за счет гидрофобных и электронных факторов, за счет наличия дополнительных донорно-акцепторных центров гетероаромати-ческого цикла.
Все вышеуказанное делает нуклеоаминокислотн довольно перспективными структурами для целенаправленного конструирования аналогов олигонуклеотидов и пептидов, необходимых для фундаментальных и прикладных исследований.
Цель работы. Целью настоящей работы является препаративное получение оптически активных нуклеоаминокислот и разработка оптимальных методов синтеза и анализа нуклеопептидов; дизайн и синтез неизвестных ранее ферментостабильных аналогов нейропептидов, содержащих остатки нелротеиногенных аминокислот, в частности нуклеоаминокислот; изучение структурно-функциональных отношений в ряду этих соединений, а также поиск высокоактивных и селективных аго-нистов и антагонистов, представляющих интерес в качестве потенциальных лекарственных средств.
Научная новизна работа. В диссертационной работе впервые разработан метод препаративного разделения рацемических нуклеоаминокислот на оптические антипода. Метод основан на стереоизбиратель-ном ферментативном расщеплении фенацетильных производных
оь-нуклеоаминокислот под действием пенициллинамидззы из Е.сои. Предложен эффективный метод одновременного определения абсолютной конфигурации и количественного содержания стереоизомеров нуклео-аминокислот .Разработаны методики нуклеопептидного синтеза в растворе, на твердом носителе, а также с использованием ферментов. Впервые осуществлен химический синтез природных нуклеопептидов, выделенных из Fagus siivatica l., а также их аналогов, содержащих остатки тиминил- и аденинилаланинов. Получен новый класс аналогов нейропептидов - киоторфина, энкефалинов, дерморфина, дельторфина, циклогистидилпролина, карнозина и фрагмента гастрина, устойчивость которых к шптидазам обеспечивается введением в структуру пептидов остатков непротеиногенных нуклеоаминокислот. Исследована их биологическая активность в тестах in vitro и in vivo. Синтезированы нуклеопептиды, обладающие высокой селективностью в отношении огшоидных рецепторов, а также сильным анальгетическим действием. Показано, что ряд аналогов циклогистидилпролина и карнозина проявляют высокую антиоксидантную активность, причем для циклогистидилпролина эта активность обнаружена впервые. Получены аналоги фрагмента гастрина, проявляющие свойства антагонистов природного гормона.
Практическая ценность работы. Результаты настоящего исследования имеют общий характер и могут быть использованы в исследованиях по синтезу пептидных биорегуляторов и их аналогов, а также при изучении закономерностей связи между структурой и функцией в ряду этих соединений. Предложенный в работе метод разделения рацематов нуклеоаминокислот на оптические антиподы с применением пени-циллинамйдазы из Е.соїі может быть рекомендован в качестве препаративного метода получения стереоизомеров различных нуклеоаминокислот и родственных соединений. Использованный в работе метод определения абсолютной конфигурации и количественного содержания энан-тиомеров нуклеоаминокислот в реакционных смесях может быть применен также для определения скорости и стереоспецифичности ферментативного гидролиза ы-ацилированных производных белковых аминокислот. Использование нуклеоаминокислотных остатков для модификации пептидов с целью повышения их ферментостабильности является достаточно общим и перспективным подходом в решении подобных проблем. Результаты биологических испытаний позволяют рассматри-
взть ряд соединений в качестве потенциальных лекарственных препаратов .
Апробация работы. О результатах настоящей работы сообщалось на ряде всесоюзных и международных симпозиумов: XI Менделеевском сезде ( Алма-Ата, 1975 ), iv Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов ( Минск, 1977 ), і Всесоюзной конференции по химии нуклеозидов и нуклеотидов ( Рига, 1978 ), v Советско-индийском симпозиуме по химии природных соединений ( Ереван, 1978), III СССР-ФРГ симпозиуме по химии пептидов и белков ( Махачкала, 1980), v Всесоюзном симпозиуме по химии и физике белков и пептидов (Баку, 1980), Всесоюзном совещании "Аминокислоты для сельского хозяйства, пищевой промышленности, здравоохранения и научных исследований" (Фрунзе, 1981 ), Всесоюзном симпозиуме "Перспективы биоорганической химии в создании новых лекарственных препаратов" (Рига,1982 ), vii Советско-индийском симпозиуме по химии природных соединений ( Тбилиси , 1983 ), vi Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов ( Рига, 1983 ), ш Всесоюзном совещании по аминокислотам ( Ереван, Г984 ), і Всесоюзной конференции по нейропеп-тидам ( Томск, 1985 ), v Всесоюзном симпозиуме го инженерной энзи-мологии ( Олайне, 1985 ), vii Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов ( Таллинн, 1987 .), iv сезде физиологов Узбекистана ( Ташкент, 1988 ), Всесоюзном симпозиуме по химии пептидов ( Рига, 1990 ).
