Введение к работе
Актуальность проблемы. Разработка эффективных подходов к направленному воздействию на нуклеиновые кислоты является актуальной проблемой современной химической биологии, биотехнологии и фундаментальной медицины. Большой интерес исследователей вызывает поиск агентов, способных избирательно взаимодействовать с определенными последовательностями мРНК, с целью создания на их основе инструментов молеку-лярно-биологических исследований и новых терапевтических средств для лечения вирусных, онкологических и других заболеваний. Одним из перспективных подходов к селективному воздействию на РНК, имеющим как фундаментальное, так и прикладное значение, является использование ДНКзимов - олигодезоксирибонуклеотидов с характерной вторичной структурой, способных специфично катализировать гидролиз фосфодиэфир-ных связей в РНК. Наиболее эффективным среди них является ДНКзим «10-23», полученный методом SELEX (SantoroS. W., Joyce G. F., 1997) и представляющий собой консервативный каталитический домен, фланкированный двумя вариабельными субстрат-узнающими участками. Простота синтеза и высокая каталитическая активность ДНКзимов «10-23» позволили использовать их для расщепления множества РНК-мишеней как in vitro, так и in vivo. В настоящее время интенсивно ведется поиск новых вариантов каталитически активных конструкций на основе ДНКзима «10-23» с комплексом улучшенных физико-химических и биологических свойств. Решающими факторами, которые нужно учитывать при конструировании ДНКзимов «10-23», являются высокая эффективность расщепления, устойчивость к нуклеазам и способность воздействовать на природные РНК, имеющие сложную пространственную структуру. Цель и задачи исследования
Целью данной работы было создание новых устойчивых в биологических средах и эффективно расщепляющих протяженные структурированные РНК двухкомпонентных ДНКзимов, которые состоят из ДНКзима «10-23» и олигонуклеотидов-эффекторов, связывающихся с РНК-субстратом вблизи 3'- или 5'- конца ДНКзима. В ходе исследования решались следующие задачи:
разработка стратегии конструирования двухкомпонентных ДНКзимов, устойчивых в биологических средах;
конструирование двухкомпонентных ДНКзимов, направленных на мРНК генов множественной лекарственной устойчивости MDR1 и инсулиноподобного фактора роста IGF-I;
исследование закономерностей расщепления протяженных структурированных фрагментов MDR1 мРНК и IGF-I мРНК созданными двухкомпонентными конструкциями.
Научная новизна и практическая ценность работы. Разработана стратегия конструирования устойчивых в биологических средах двухкомпонентных ДНКзимов для эффективного расщепления протяженных структурированных РНК-мишеней, основанная на использовании ДНКзима «10-23» и олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов)-эффекторов, которые связываются с РНК «встык» с 3'- или 5'-концом ДНКзима, «разворачивая» ее вторичную структуру и облегчая тем самым ассоциацию ДНКзима с мишенью.
Впервые созданы и исследованы ДНКзимы и двухкомпонентные конструкции на их основе, направленные на короткие и протяженные фрагменты мРНК генов множественной лекарственной устойчивости MDR1 и инсулиноподобного фактора роста IGF-I. Показано, что ДНКзимы, содержащие дополнительный З'-концевой тимидин, присоединенный 3' -З'-фосфодиэфирной («инвертированной») связью, и 2'-0-метилрибонуклеотиды в суб-страт-связывающих участках и неконсервативных положениях каталитического кора, обладают наибольшей устойчивостью в биологических средах и высокой каталитической активностью при расщеплении протяженного транскрипта. Наличие дополнительного «инвертированного» тимидина на З'-конце ДНКзима не снижает активности двухкомпо-нентных систем. Изучено влияние типа эффектора и наличия в нем концевых модификаций на расщепление РНК созданными конструкциями. Показано, что оптимальным вариантом эффекторов являются олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды), содержащие З'-концевой «инвертированный» тимидин. Созданные двухкомпонентные ДНКзимные конструкции эффективно расщепляют фрагменты MDR1 и IGF I мРНК, обладающие сложной пространственной структурой. Эффекторы обладают более высокой скоростью ассоциации с мишенью, и их наличие в системе в 10-20 раз повышает скорость связывания ДНКзима с РНК-транскриптом. Общая каталитическая эффективность ДНКзимов в присутствии оли-гонуклеотидов-эффекторов возрастает в 10-100 раз за счет увеличения сродства ДНКзимов к протяженной РНК. Полученные результаты позволяют рассматривать созданные ДНКзимные конструкции как перспективные инструменты для подавления экспрессии генов на уровне мРНК.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ. Результаты работы были представлены на конференциях: Nucleic Acids Chemical Biology (NACB) PhD Summer School, Оденс, Дания, 2003 г, HUPO 2nd Annual and IUBMB XIX World Congress, Монреаль, Канада, 2003 г, XVI International Roundtable on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, Миннеаполис, США, 2004 г, 1st International Symposium on Biomolecules and Related Compounds, Монпелье, Франция, 2005 г, 13th Annual Congress of the European Society of Gene Therapy, Прага, Чехия, 2005 г, Международной конференции по химической биологии, Новосибирск, Россия, 2005 г, Международной конференции «Физико-химическая биология», посвященной 80-летию академика Д.Г. Кнорре, Новосибирск, Россия, 2006 г, XVII International Roundtable on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, Берн, Швейцария, 2006 г, Международной конференции "Фундаментальные науки - медицине", Новосибирск, Россия, 2007 г и др. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов, списка цитированной литературы и приложения. Работа изложена на 166 страницах, содержит 68 рисунков и 15 таблиц. Библиография включает 272 литературных источника.
