Введение к работе
Актуальность работы. Гибридизационный анализ нуклеиновых кислот (НК) является уникальным по простоте и специфичности методом, позволяющим выявлять заданные последовательности в структуре НК. Именно поэтому он получил широкое распространение не только в научных исследованиях, но и при решении практических задач. Наиболее перспективным оказалось применение его для диагностики вирусных, инфекционных, генетических заболеваний, детекции различных патогенов и бактерий внешней среды, генотипирования и фянгерпринтинга ДНК (в медицине, криминалистике и сельском хозяйстве).
Существующие к настоящему моменту методы анализа НК основаны но использовании радиоактивных зондов, что существенно сдерживает широкое внедрение метода молекулярной гибридизации в практику. Поэтому весьма актуальным представляется совершенствование методов получения нерадиоактивно меченных гибридизационных зондов, разработка систем нерадиоак-тишой детекции таких зондов, а такке создание быстрых и удобных схем диагностики с их использованием.
Описанные в литературе методы нерадиоактивной диагностики сложны и недоступны для широкого применения в отечественной практике. В связи с этим дальнейшая разработка удобных л доступных нерадиоактивных диагностических методов остается на сегодняшний день важной и перспективной задачей.
Наиболее перспективными' для практического применения в качестве гибридизационных зондов представляются синтетические олигонуклеотиды, благодаря их высокой специфичности и легкости синтеза и мечения.
Проблеме получения нерадиоактивно меченных зондов на основе синтетических олигонуклеотидов и отработке методологии их использования для создания гибридизационных диагностикумов посвящена настоящая работа.
Целью настоящей работы явилось создание общих химических и методологических подходов к конструированию нерадиоактивно меченных гибридизационных диагностикумов на базе синтетических олигодезоксирибонук-леотидов. Для решения этой задачи необходимо было, во-первых, выработать химические подхода, позволяющие путем пост-синтетической модификации получать на базе готовых синтетических олигонуклеотидов зонды с различными нерадиоактивными метками. Во-вторых, разработать методологию использования полученных нерадиоактиЕНО меченных олигонуклеотидкых зондов в гибридизационном анализе, включая подбор условий гибридизации
- г -
и нерадиоактивной детекции гибрида. Л, наконец, мы хотели показать возможность применения разработанной методологии при конструировании даагностикумов для выявления вироидных заболеваний растений, точечных мутаций р-глобинового гена человека, а также для создания системы нерадиоактивного фингерпринтинга ДНК растений.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые в качестве универсальной базы для создания нерадиоактивных гибридизационных даагностикумов предложена общая химическая методология получения оли-гонуклеотидных гибридизационных зондов, несущих нерадиоактивные метки различного типа. Отработаны новые методики получения биотинилированных и флуоресцентно меченных олигонуклеотидов, позволяющие, в отличие от использовавшихся ранее, получать требуемые соединения с количественным выходом. Оптимизирована методика детекции биотинилированных олигонук-леотидных зондов в дот-гибридизационном анализе. Отработанные условия позволяют надежно детектировать I нг анализируемой ДНК за 3 часа анализа.
Предложены три новых метода получения фермент-меченных зондов, являющихся ковалентними конъюгатами олигонуклеотидов с ферментами -щелочной фосфатазой (ЩЕ) и пероксидазой хрена (ПОХ). Отработана методология использования этих зондов в гибридизационном анализе НК без выделения их из реакционной смеси после синтеза.
Для выявления вироидных заболеваний картофеля и хризантем предложена 26-звенная олигонуклеотидная последовательность, универсальная для вироида веретеновидности клубней картофеля и карликовости хризантем. На основе этого зонда, меченного биотином, создан гибридазацион-ный даагностикум. Проведена апробация гибридизационной тест-системы и показана ее пригодность для широкомасштабного и быстрого выявления ви-роидов в клеточных культурах растений.
Для диагностики точечной мутации 1VS 1-110 р-глобинового гена человека, вызывающей р-талассемию, были подобраны оптимальные структуры олигонуклеотидных 19-звенных зондов. На основе этих зондов, меченных биотином и ПОХ, и в сочетании с амплификацией ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) был создан даагностикум. Впервые для диагностики этой мутации были применены биотинилированные зонды.
Для определения точечных мутаций 0-глсбинового гена, вызывающих серповидно-клеточную анемию, впервые в нашей стране был разработан даагностикум на основе биотинилированных аллель-специфичных олигонуклеотидов в сочетании с методом ПЦР.
Предложен универсальный диагностикум для определения точечных мутаций р-глобинового гена, основанный на методе обратной гибридизации. Методика позволяет проводить массовый скрининг клинических образцов, банков крови и т.п., в том числе на множественные мутации.
Впервые для генетической паспортизации растений применен метод нерадиоактивного олигонуклеотидного фингерпринтинга. Оптимизированы и сравнены методики нерадиоактивного фингерпринтинга ДНК растений в геле и на мембранах с использованием биотинилированного 15-звенного олиго-нуклеотида.
Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 6 работ, I находится в печати. Материалы диссертации докладывались на 2-ой международной конференции по фингерпринтингу ДНК, Бело Оризонте (Бразилия), 1992.
Структура и объем работы, диссертация изложена на oiQ$ страницах машинописного текста и содержит ^JQ таблиц, "Й? рисунков и список цитируемой литературы ( Э^Гссылок). Работа состоит из введения, трех глав и выводов. Глава первая - обзор литературы, посвященный новым направлениям использования нерадиоактивно меченных олигонуклеотидных зондов в анализе НК. Глава вторая - обсуждение результатов. Глава третья - экспериментальная часть.