Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Конструирование нерадиоактивно меченых гибридизационных диагностикумов на базе синтетических олигодезоксирибонуклеотидов Лебедева, Ирина Владимировна

Данная диссертационная работа должна поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Лебедева, Ирина Владимировна. Конструирование нерадиоактивно меченых гибридизационных диагностикумов на базе синтетических олигодезоксирибонуклеотидов : автореферат дис. ... кандидата химических наук : 02.00.10.- Москва, 1993.- 26 с.: ил.

Введение к работе

Актуальность работы. Гибридизационный анализ нуклеиновых кислот (НК) является уникальным по простоте и специфичности методом, позволяющим выявлять заданные последовательности в структуре НК. Именно поэтому он получил широкое распространение не только в научных исследованиях, но и при решении практических задач. Наиболее перспективным оказалось применение его для диагностики вирусных, инфекционных, генетических заболеваний, детекции различных патогенов и бактерий внешней среды, генотипирования и фянгерпринтинга ДНК (в медицине, криминалистике и сельском хозяйстве).

Существующие к настоящему моменту методы анализа НК основаны но использовании радиоактивных зондов, что существенно сдерживает широкое внедрение метода молекулярной гибридизации в практику. Поэтому весьма актуальным представляется совершенствование методов получения нерадиоактивно меченных гибридизационных зондов, разработка систем нерадиоак-тишой детекции таких зондов, а такке создание быстрых и удобных схем диагностики с их использованием.

Описанные в литературе методы нерадиоактивной диагностики сложны и недоступны для широкого применения в отечественной практике. В связи с этим дальнейшая разработка удобных л доступных нерадиоактивных диагностических методов остается на сегодняшний день важной и перспективной задачей.

Наиболее перспективными' для практического применения в качестве гибридизационных зондов представляются синтетические олигонуклеотиды, благодаря их высокой специфичности и легкости синтеза и мечения.

Проблеме получения нерадиоактивно меченных зондов на основе синтетических олигонуклеотидов и отработке методологии их использования для создания гибридизационных диагностикумов посвящена настоящая работа.

Целью настоящей работы явилось создание общих химических и методологических подходов к конструированию нерадиоактивно меченных гибридизационных диагностикумов на базе синтетических олигодезоксирибонук-леотидов. Для решения этой задачи необходимо было, во-первых, выработать химические подхода, позволяющие путем пост-синтетической модификации получать на базе готовых синтетических олигонуклеотидов зонды с различными нерадиоактивными метками. Во-вторых, разработать методологию использования полученных нерадиоактиЕНО меченных олигонуклеотидкых зондов в гибридизационном анализе, включая подбор условий гибридизации

- г -

и нерадиоактивной детекции гибрида. Л, наконец, мы хотели показать возможность применения разработанной методологии при конструировании даагностикумов для выявления вироидных заболеваний растений, точечных мутаций р-глобинового гена человека, а также для создания системы нерадиоактивного фингерпринтинга ДНК растений.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые в качестве универсальной базы для создания нерадиоактивных гибридизационных даагностикумов предложена общая химическая методология получения оли-гонуклеотидных гибридизационных зондов, несущих нерадиоактивные метки различного типа. Отработаны новые методики получения биотинилированных и флуоресцентно меченных олигонуклеотидов, позволяющие, в отличие от использовавшихся ранее, получать требуемые соединения с количественным выходом. Оптимизирована методика детекции биотинилированных олигонук-леотидных зондов в дот-гибридизационном анализе. Отработанные условия позволяют надежно детектировать I нг анализируемой ДНК за 3 часа анализа.

Предложены три новых метода получения фермент-меченных зондов, являющихся ковалентними конъюгатами олигонуклеотидов с ферментами -щелочной фосфатазой (ЩЕ) и пероксидазой хрена (ПОХ). Отработана методология использования этих зондов в гибридизационном анализе НК без выделения их из реакционной смеси после синтеза.

Для выявления вироидных заболеваний картофеля и хризантем предложена 26-звенная олигонуклеотидная последовательность, универсальная для вироида веретеновидности клубней картофеля и карликовости хризантем. На основе этого зонда, меченного биотином, создан гибридазацион-ный даагностикум. Проведена апробация гибридизационной тест-системы и показана ее пригодность для широкомасштабного и быстрого выявления ви-роидов в клеточных культурах растений.

Для диагностики точечной мутации 1VS 1-110 р-глобинового гена человека, вызывающей р-талассемию, были подобраны оптимальные структуры олигонуклеотидных 19-звенных зондов. На основе этих зондов, меченных биотином и ПОХ, и в сочетании с амплификацией ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) был создан даагностикум. Впервые для диагностики этой мутации были применены биотинилированные зонды.

Для определения точечных мутаций 0-глсбинового гена, вызывающих серповидно-клеточную анемию, впервые в нашей стране был разработан даагностикум на основе биотинилированных аллель-специфичных олигонуклеотидов в сочетании с методом ПЦР.

Предложен универсальный диагностикум для определения точечных мутаций р-глобинового гена, основанный на методе обратной гибридизации. Методика позволяет проводить массовый скрининг клинических образцов, банков крови и т.п., в том числе на множественные мутации.

Впервые для генетической паспортизации растений применен метод нерадиоактивного олигонуклеотидного фингерпринтинга. Оптимизированы и сравнены методики нерадиоактивного фингерпринтинга ДНК растений в геле и на мембранах с использованием биотинилированного 15-звенного олиго-нуклеотида.

Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 6 работ, I находится в печати. Материалы диссертации докладывались на 2-ой международной конференции по фингерпринтингу ДНК, Бело Оризонте (Бразилия), 1992.

Структура и объем работы, диссертация изложена на oiQ$ страницах машинописного текста и содержит ^JQ таблиц, "Й? рисунков и список цитируемой литературы ( Э^Гссылок). Работа состоит из введения, трех глав и выводов. Глава первая - обзор литературы, посвященный новым направлениям использования нерадиоактивно меченных олигонуклеотидных зондов в анализе НК. Глава вторая - обсуждение результатов. Глава третья - экспериментальная часть.

Похожие диссертации на Конструирование нерадиоактивно меченых гибридизационных диагностикумов на базе синтетических олигодезоксирибонуклеотидов