Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Конструирование нерадиоактивно меченных гибридизационных диагностикумов на базе синтетических олигодезоксирибонуклеотидов Лебедева, Ирина Владимировна

Данная диссертационная работа должна поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Лебедева, Ирина Владимировна. Конструирование нерадиоактивно меченных гибридизационных диагностикумов на базе синтетических олигодезоксирибонуклеотидов : автореферат дис. ... кандидата химических наук : 02.00.10.- Москва, 1993.- 26 с.: ил.

Введение к работе

Актуальность работы. Гибридизационный анализ нуклеиновых кислот (НК) является уникальным по простоте и специфичности методом, позволяющим выявлять заданные последовательности в структуре НК. Именно поэтому он получил широкое распространение не только в научных исследованиях, но и при решении практических задач. Наиболее перспективным оказалось применение его для диагностики вирусных, инфекционных, генетических заболеваний, детекщи различных патогенов и бактерий внешней среды, генотипирования и фингерпринтинга ДНК (в медицине, криминалистике и сельском хозяйстве).

Существующие к настоящему моменту методы анализа НК основаны на использовании радиоактивных зондов, что существенно одерзмвает широкое внедрение метода молекулярной гибридизации в практику. Поэтому весьма актуальным представляется совершенствование методов получения нерадиоактивно меченных гибридизациояных зондов, разработка систем нерадиоак-тшной детекции таких зондов, а также создание быстрых и удобных схем диагностики с их использованием.

Описанные в литературе методы нерадиоактивной диагностики сложны и недоступны для широкого применения в отечественной практике. В связи с этим дальнейшая разработка удобных л доступных нерадиоактивных диагностических методов остается на сегодняшний день ваяяой и перспективной задачей.

Наиболее перспективными для практического применения в качестве гибридазационных зондов представляются синтетические олигонуклеотиды, благодаря их высокой специфичности и легкости синтеза и мечения.

Проблеме получения нерадиоактивно меченных зондов на основе синтетических олигонуклеотидов и отработке методологии их использования для создания гибридизационкых диагностикумов посвящена настоящая работа.

Целью настоящей работы явилось создание общих химических и методологических подходов к конструированию нерадиоактивно меченных гибридазационных диагностикумов на базе синтетических олигодезоксирибонук-леотидов. Для решения этой задачи необходимо было, во-первых, выработать химические подходы, позволявшие путем пост-синтетической модификации получать на базе готовых синтетических олигонуклеотидов зонды с различными нерадиоактиЕнкми метками. Во-вторых, разработать методологию использования полученных нерадаюактивно меченных олигонуклеотидных зондов в гибридизациокном анализе, включая подбор услоЕП?. гибридизации

- г -

и нерадиоактивной детекции гибрида. И, наконец, мы хотели показать возможность применения разработанной методологии при конструировании диагностикумов для выявления вироидных заболеваний растений, точечных мутаций (3-глобинового гена человека, а также для создания системы нерадиоактивного фингерпринтинга ДНК растений.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые в качестве универсальной базы для создания нерадиоактивных гибридизационных диагностикумов предложена общая химическая методология получения оли-гонуклеотидных гибридизационных зондов, несущих нерадиоактивные метки различного типа. Отработаны новые методики получения биотинилированных и флуоресцентно меченных олигонуклеотидов, позволяющие, в отличие от использовавшихся ранее, получать требуемые соединения с количественным выходом. Оптимизирована методика детекции биотинилированных олигонук-леотидных зондов в дот-гиОридизационном анализе. Отработанные условия позволяют надежно детектировать I нг анализируемой ДНК за 3 часа анализа.

Предложены три новых метода получения фермент-меченных зондов, являющихся ковалентними конъюгатами олигонуклеотидов с ферментами -щелочной фосфатазой (!!№) и пероксидазой хрена (ПОХ). Отработана методология использования этих зондов в гибридизационном анализе НК без выделения их из реакционной смеси после синтеза.

Для выявления вироидных заболеваний картофеля и хризантем предложена 26-звенная олигонуклеотидная последовательность, универсальная для вироида веретеновидности клубней картофеля и карликовости хризантем. На основе этого зонда, меченного биотином, создан гибридизацион-ный диагностикум. Проведена апробация гибридизационной тест-системы и показана ее пригодность для широкомасштабного и быстрого выявленияви-роидов в клеточных культурах растений.

Для диагностики точечной мутации IVS 1-110 р-глобинового гена человека, вызывающей р-талассемию, были подобраны оптимальные структуры олигонуклеотидных 19-зввнных зондов. На основе этих зондов, меченных биотином и ПОХ, и в сочетании с амплификацией ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) был создан диагностикум. Впервые для диагностики этой мутации были применены биотинилированные зонды.

Для определения точечных мутаций р-глобинового гена, вызывающих серповидно-клеточную анемию, впервые в нашей стране был разработан диагностикум на основе биотинилированных аллель-специфичных олигонуклеотидов в сочетании с методом ПЦР.

Предложен универсальный диагностикум для определения точечных мутаций р-глобинового гена, основанный на методе обратной гибридизации. Методика позволяет проводить массовый скрининг клинических образцов, банков крови и т.п., в том числе на множественные мутации.

Впервые для генетической паспортизации растений применен метод нерадиоактивного олигонуклеотидного фингерпринтинга. Оптимизированы и сравнены методики нерадиоактивного фингерпринтинга ДНК растений в геле и на мембранах с использованием биотинилированного 15-звенного олигонуклеотида.

Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 6 работ, I находится в печати. Материалы диссертации докладывались на 2-ой международной конференции по фингерпринтингу ДНК, Бело Оризонте (Бразилия), 1992.

Структура и объем работы, диссертация изложена на страницах машинописного текста и содержит 12 таблиц, /У рисунков и список цитируемой литературы ( 3>58 ссылок). Работа состоит из введения, трех глав и выводов. Глава первая - обзор литературы, посвященный новым направлениям использования нерадиоактивно меченных олигонуклеотидных зондов в анализе НК. Глава вторая - обсуждение результатов. Глава третья - экспериментальная часть.

Похожие диссертации на Конструирование нерадиоактивно меченных гибридизационных диагностикумов на базе синтетических олигодезоксирибонуклеотидов