Содержание к диссертации
Введение
1. Иссщование мешизма действия ферментов и строения их активного центра с помощью метода аффинной модификации 12
1. Оксиредуктазы 13
2. Трансферази 30
3. Гидролазы 41
4. Лиазы 52
5. Изомеразы 61
6. Лигазы 66
2. Особенности взаимодействия неорганической пирофосфатазы из дрожжей с моноэфирами фосфорной кислоты различного строения 70
1. Центры связывания аффинных ингибиторов неорганической пирофосфатазы 70
2. Кооперативные взаимодействия субъединиц в неорганической пирофосфатазе 86
3. Роль четвертичной структуры пирофосфатазы в аффинной модификации 94
4. Расположение аффинных ингибиторов в активном центре неорганической пирофосфатазы 100
3. Экспериментальная часть.
1. Исходные вещества 109
2. Методы исследования 111
2.1. Хроматография 111
2.2. Обнаружение веществ на хроматограммах 111
2.3. Определение радиоактивности 111
2.4. Количественное определение неорганического фосфата 112
2.5. Количественное определение содержания фосфора в модифицированном белке 112
2.6. Определение концентрации белка 113
а) Определение концентрации нативного фермента 113
б) Определение концентрации иммобилизованного фермента 113
2.7. Определение ферментативной активности пирофосфатазы 113
3. Исследование реакции неорганической пирофосфатазы с моноэфирами фосфорной кислоты 114
3.1. Инактивация пирофосфатазы под действием метилфосфата, фосфогликолевой кислоты, И-ацетилфос- фосерина, О-фосфоэтаноламина, 0-фосфопропанол~ амина и метилового эфира О-фосфосерина 114
3.2. Реакция пирофосфатазы с монозфирами фосфорной кислоты в присутствии субстрата « неорганического пирофосфата 114
3.3. Расчет констант скорости и констант ингибирования 115
3.4. Модификация неорганической пирофосфатазы моноэфирами фосфорной кислоты 115
3.5. Зависимость скорости инактивации фермента от концентрации моноэфиров фосфорной кислоты 115
3.6. Влияние ингибиторов на кинетику гидролиза пирофосфата магния 116
3.7. Получение фермент-субстратного комплекса, стабилизированного фторидом 117
3.8. Влияние моноэфиров фосфорной кислоты на реактивацию фермент-субстратного соединения пирофосфатом натрия 117
3.9. Влияние моноэфиров фосфорной кислоты на реактивацию фермент-субстратного соединения триполифосфатом натрия 117
3.10. Получение пирофосфатазы, модифицированной на 50$ метилфосфатом, Ы-ацетилфосфосерином, О-фосфопропаноламином или О-фосфоэтаноламином 118
3.11. Изучение кинетики реактивации фермента, модифицированного метилфосфатом, Ы-ацетилфос фосерином или О-фосфопропаноламином, под действием пирофосфата натрия, триполифосфата натрия и хлористого магния 118
4. Кооперативные взаимодействия субъединиц в неоргани ческой пирофосфатазе. 119
4.1. Получение пирофосфатазы с одной модифицированной субъединицей 119
4.2. Протеолиз субтилизином нативной и модифицированной пирофосфатазы 120
4.3. Протеолиз субтилизином неорганической пирофосфатазы, модифицированной Н-ацетилфосфосерином, в присутствии имидодифосфата натрия и Ша 120
5. Исследование значения четвертичной структуры пиро фосфатазы для протекания аффинного ингибирования 120
5.1. Иммобилизация пирофосфатазы 120
5.2. Получение иммобилизованной субъединицы неорганической пирофосфатазы и реконструкция димерной формы фермента 121
5.3. Исследование влияния монофосфатов на иммобилизованные производные пирофосфатазы во времени 122
5.4. Влияние моноэфиров фосфорной кислоты на кинетику гидролиза пирофосфата магния иммобилизованными производными фермента 122
6. Выделение пептида, содержащего аминокислоту, модифицированную метилфосфатом 122
6.1. Последовательная модификация пирофосфатазы метилфосфатом и [- ]-Ы-метилгидроксиламином 122
6.2. Выделение и характеристика пептида, содержащего аминокислоту, модифицированную метилфосфатом 123
6.3. Определение Ы-концевой аминокислоты методом дансилирования /208/ 124
6.4. Определение аминокислотного состава меченого пептида 126
Выводы 127
- Трансферази
- Кооперативные взаимодействия субъединиц в неорганической пирофосфатазе
- Обнаружение веществ на хроматограммах
- Получение иммобилизованной субъединицы неорганической пирофосфатазы и реконструкция димерной формы фермента
Введение к работе
Объектом исследования настоящей работы является неорганическая пирофосфатаза (КФ 3.6.I.I) из пекарских дрожжей, катализирующая гидролиз пирофосфата, триполифосфата и их моноэфиров в присутствии ионов двухвалентных металлов /1-5/. Специфичность фермента зависит от природы ионов металла: в присутствии rig проходит только гидролиз неорганического пирофосфата /2/ и три полифосфата /3/, a Zn. , lfz и to активируют реакцию расщепления как этих соединений, так и их моноэфиров /1,6/. Пирофосфатаза имеет три центра связывания ионов металла, отличающиеся по сродству. Один из них имеет высокое сродство (Kj = 2«10 5 М). Считают, что этот центр необходим для связывания комплекса /7/. Заполнение ионами металла второго центра с меньшим сродством (К2 = Ю" М) обеспечивает протекание каталитической реакции в фермент-субстратном комплексе. Третий центр имеет очень низкое сродство (К = 8»I0"3 М) /7-Ю/ и проявляется при рН 8,5.
Молекула пирофосфатазы состоит из двух химически идентичных субъединиц, аминокислотная последовательность которых полностью установлена /11-13/. В настоящее время группой советских ученых завершено исследование фермента с разрешением о ЗА, на основании которого построена пространственная модель белка /14,15/. индивидуальная субъединица обладает активностью, т.е. четвертичная структура не является необходимой для катализа /16/. Кроме активного центра, каждая субъединица имеет регуляторный центр, способный связывать фосфат, фосфорилироваться под действием АТР и присоединять полианионы - пирофосфата, , ЭДТА и другие. Связывание этих анионов способствует удалению пирофосфата из активного центра фермент-субстратного комплекса, стабилизированного фторидном /17,18/.
При взаимодействии фермента с фосфатом ( 20 мМ) одновременно с фосфорилированием регуляторного центра происходит синтез пи-рофосфата в активном центре /19/.
На основании изучения взаимодействия пирофосфатазы с фосфа TR том в реакциях 0-обмена и синтеза пирофосфата удалось описать промежуточные продукты превращения фермент-субстратного комплекса и определить константы скорости отдельных стадий:
Согласно предложенной схеме, образующиеся в результате гидролиза две молекулы неорганического фосфата оказываются связанными с ионами магния. Они имеют разное сродство к пирофосфатазе и уходят с фермента не одновременно, а последовательно, причем первым освобождается фосфат, имеющий более электрофильный характер. Стадиями, определяющими скорость всего процесса гидролиза субстрата, является расщепление пирофосфата и уход обоих фосфатов из активного центра /20,21/.
Важным для понимания функционирования фермента является выявление существенных для активности аминокислотных остатков. Для неорганической пирофосфатазы известен ряд остатков, модификация которых приводит к ее инактивации.
Куперман и сотр. установили наличие в активном центре фермента остатка аргинина. Этот вывод сделан на основании исследования ингибирующего действия фенилглиоксаля - специфического реаген та на аргинин и лизин /24/. Использование меченого реагента позволило локализовать существенный остаток аргинина в первичной структуре белка, им оказался Аго 11 /25/. Роль этого остатка, по-видимому, заключается в связывании субстрата.
Окисление одного остатка триптофана на субъединицу Н-бром-сукцинимидом приводит к полной инактивации пирофосфатазы. Модифицированный таким образом фермент имеет меньшее сродство к ионам металла по сравнению с нативным /26/,
Для функционирования фермента важны также остатки тирозина, т.к. блокирование 3-4 таких остатков с помощью тетранитрометана и П-ацетилимидазола приводит к полной потере пирофосфатазной активности /27/.
С модификацией существенных остатков метионина, по-видимому, связана инактивация фермента при карбоксиметилировании пирофосфатазы иодацетамидом при рН 5,5 /28/.
Наличие остатков лизина в активном центре фермента было доказано при исследовании реакции белка с тринитробензолсульфокис-лотой /29,30/. Один остаток лизина в каждой субъединице реагирует с модифицирующим агентом быстрее, чем остальные 26. Такая модификация ведет к инактивации пирофосфатазы. рК блокируемого остатка белка составляет 8,6. Эта группа несет положительный заряд при нейтральном рН и может выступать в качестве донора протона на стадии распада пирофосфатной связи. Используя данные ре/нтгено-структурного адализа, можно предположить, что функционально важный остаток лизина занимает положение 197 в полипептидной цепи белковой молекулы.
Таким образом, неорганическая пирофосфатаза из пекарских дрожжей принадлежит к числу детально изученных в структурном отношении ферментов. Дальнейший прогресс в понимании механизма действия фермента требует идентификации аминокислотных остатков, участвующих в связывании субстрата и его каталитических превращениях, являющихся лигандами металлов-активаторов, а также установления функциональной роли четвертичной структуры. Последняя проблема представляет особый интерес, так как она является общей для понимания механизма функционирования олигомерных ферментов, состоящих из одинаковых субъединиц. Хотя мономер неорганической пиро-фосфатазы из дрожжей обладает полной ферментативной активностью, свойства субъединиц в составе димера существенно различаются. Очень ярко это проявляется, например, при взаимодействии пирофос-фатазы с моноэфирами фосфорной кислоты, являющимися ее аффинными ингибиторами. Можно было думать, что детальное исследование реакции пирофосфатазы с аффинными реагентами приблизит к пониманию значения субъединичной структуры и окажется плодотворным подходом для выявления функциональных групп фермента, участвующих в катализе. Поэтому целью настоящей работы являлось изучение особенностей взаимодействия пирофосфатазы с моноэфирами фосфорной кислоты различного строения, В работе показано, что ингибирование неорганической пирофосфатазы моноэфирами фосфорной кислоты является результатом модификации активного центра. Установлено, что для протекания необратимой инактивации необходима четвертичная структура. Экспериментально доказано, что причиной неодинакового поведения субъединиц в реакциях с аффинными ингибиторами являются кооперативные взаимодействия субъединиц, а не предсуществующая асимметрия димера. Предложена гипотеза расположения моноэфиров фосфорной кислоты в активном центре пирофосфатазы и высказано предположение о важности остатка Gtu 147 для катализа. Полученные результаты вносят вклад в понимание регуляторной роли четвертичной структуры фермента и намечают пути локализации групп активного центра,
В обзоре литературы обсуждается использование аффинных реагентов, являющихся производными фосфорной, пирофосфорной и три-полифосфорной кислот, для исследования механизма действия ферментов различных классов.
Трансферази
Трансферази - это ферменты, переносящие ту или иную группу от одного соединения к другому. Большинство реакций переноса фосфатных групп протекает с участием АТР и ферментов, известных под названием киназ. Эти реакции имеют большое значение, т.к. благодаря им осуществляется перенос энергии от одной системы к другой в форме богатых энергией фосфатных связей АТР. Для исследования АТР-связывающего участка киназ широко используются 2 ,3/-диальде-гидное производное АТР - оксо-АТР. Традиционно считают, что этот реагент может модифицировать в белках только остатки лизина (пути I и 2), однако теоретически возможна реакция по остаткам цистеина (путь 3) /54/: В случае взаимодействия оксо-АТР с остатками лизина возможны два продукта модификации - либо основание Шиффа, которое после восстановления боргидридом натрия превращается во вторичный амин (путь I), либо производное морфолина (путь 2). Меченый [ с]-оксо-АТР успешно применили для изучения строения локуса связывания полифосфатной цепочки АТР в цикло-АМР-за-висимой протеинкиназе (КФ 2.7.1.37) из мозга свиньи. Этот фермент ответственен за перенос концевого фосфата АТР на сериновые остатки белков-субстратов» Холофермент представляет собой тетрамер, состоящий из двух каталитических (С) и двух регуляторных (R ) субъединиц. В присутствии аллостерического регулятора - цикло-АМР -- происходит диссоциация белка вследствие связывания циклического нуклеотида с регуляторной субъединицей, а высвобождающаяся каталитическая субъединица и является собственно протеинкиназой. [с]-Оксо-АТР является аффинным ингибитором каталитической субъединицы протеинкиназы /55/. Установлено, что падение фермен тативной активности вызвано блокированием остатка лизина в актив ном центре за счет образования альдимидной связи с реагентом. Вы делен меченый пептид активного центра и определен его состав: Л/Ы , PrO,Glui, Aruf , LrUS{- Кроме того, показано учас- тие остатка гистидина в расщеплении А-У-евязи АТР /55-57/, На основании проведенных исследований было высказано предложение о расположении АТР в активном центре протеинкиназы: Согласно предложенной схеме, АТР связывается в активном центре каталитической субъединицы за счет электростатического взаимодействия оС -фосфатного остатка с в -аминогруппой остатка лизина фермента. В результате этого происходит изменение электронной плотности на #-концевом фосфатном атоме АТР, что облегчает нук-леофильную атаку электронной парой имидазольного кольца остатка гистидина.
Таким образом, происходит расщепление р fl -связи АТР и в ферменте образуется фосфогистидин. Вторая стадия реакции заключается в переносе фосфата от остатка гистидина фермента к белковому субстрату /58,59/. Для изучения цикло-АМР-зависимой протеинкиназы использовались, кроме оксо-АТР, и другие аналоги АТР, например, 8-азидо-АТР /60/. Последний необратимо инактивирует фермент при облучении видимым светом за счет взаимодействия образующегося высокореакционноспо-собного нитрена с существенными для проявления активности группами фермента. Конкурентный по отношению к АТР характер ингибирова-ния, а также сильный защитный эффект АТР позволили предположить, что блокированию подвергается АТР-связывающий участок протеинкиназы. В работе не проведена идентификация модифицируемого аминокислотного остатка, но показано, что он находится в каталитической субъединице. Киназа фосфорилазы из мышц кролика (КФ 2.7.1.38) является ключевым ферментом в каскаде реакций, связанных с гликогенолизом. В присутствии АТР она катализирует фосфорилирование фосфорилазы & , тропонина І, тропонина Т, гликогенсинтазы, а также может осуществлять автофосфорилирование. Фермент представляет собой гексадекамер, состоящий из 4-х различных типов субъединиц -- L црц 4 Ч настоящее время нет единого мнения о функциональной роли субъединиц. Поскольку оС- и ув -субъединицы фосфо-рилируются цикло-АМР-зависимой протеинкиназой и самой киназой фосфорилазы и при этом фосформирование / -субъединицы коррелирует с увеличением ферментативной активности, Хаякава, Коэн и др. считают /61,62/, что каталитической субъединицей является р , а d - выполняет регуляторную функцию /63/. По мнению Карлсон и др. /64/, каталитическими субъединицами являются не только р , но и В работах Е.С.Северина и сотр. /65/» которые использовали набор алкилирующих производных АТР, показано, что только /В -субъединица обладает каталитическими свойствами, т.к. потеря ферментативной активности при обработке реагентами связана с модификацией р -субъединиц, а не f S -Субъединица, по-видимому, ответственна за связывание ионов Са /66/, Значительный вклад в изучение механизма действия киназы фосфорилазы внесли Кинг и Карлсон /54,67/, которые использовали ок-со-АТР. Фермент инактивируется 2/,3/-диальдегидным производным АТР при рН 6,8 в соответствии с реакцией псевдопервого порядка. Это вызвано модификацией существенного остатка лизина, причем продуктом реакции является не основание Шиффа, а очень устойчивое диоксиморфолиновое производное. Ингибирование происходит как в присутствии, так и в отсутствие Са и Mo , однако наличие ионов двухвалентных металлов увеличивает скорость реакции. При рН 8,2 падение ферментативной активности под действием оксо-АТР не наблюдается, и реагент может служить субстратом киназы при фосфори-лировании фосфорилазы S Последний факт, а также защитный эффект АТР в инактивирующих условиях указывают на связывание оксо-АТР в активном центре киназы фосфорилазы.
Интересные результаты получены при исследовании влияния ио- нов металлов на реакцию ингибирования. Са и Ма проявляют син- ергидный эффект при подавлении ферментативной активности под действием оксо-АТР, что, по-видимому, связано с конформационными изменениями в области нуклеотидсвязывающего центра. В результате -Злотого значительно повышается скорость инактивации киназы фосфорилазы и сродство ингибитора к ферменту, что проявляется в уменьшении КС для оксо-АТР. Существенно, что синергизм проявляется больше для фосфорилированного с помощью оксо-АТР фермента, чем для не-фосфорилированного. Величина синергидного эффекта изменяется при варьировании рН. Считают, что этот феномен является также отражением конформационных перестроек в белке. Таким образом, реакция оксо-АТР с ферментом может служить чувствительным инструментом для обнаружения конформационных изменений в районе активного центра киназы фосфорилазы. Выше было сказано, что, по мнению большинства исследователей, каталитический центр киназы фосфорилазы располагается на р -субъединице. Использование оксо-АТР помогло также ответить на вопрос, один или два типа каталитических центров существуют в ки-назе фосфорилазы /67/. Было проведено сравнительное изучение кинетики уменьшения ферментативной активности под действием оксо-АТР с использованием в качестве субстратов фосфорилазы і и одного из следующих соединений: гликогенсинтазы, тропонина I, тропонина Т, киназы фосфорилазы и тетрадекапептида,соответствующего последовательности с 5 по 18 аминокислотный остаток фосфорилазы 6 . Оказалось, что скорости ингибирования фермента под действием оксо--АТР различны для каждой пары субстратов. Эти результаты свидетельствовали о том, что в киназе фосфорилазы существуют, по крайней мере, два типа каталитических центров. Авторы не решили окончательно вопрос о причине этого явления, но можно предположить, что либо каталитические центры расположены на разных типах субъединиц, либо только на р -субъединицах, но под действием оксо-АТР они по-разному меняют свои свойства, либо ингибитор связывается с регуляторними об -субъединицами, что приводит к неодинаковым конформационным перестройкам в каталитических центрах р -субъеди- Таким образом, использование только одного аффинного ингибитора позволило выявить функционально важный остаток лизина в ки-назе фосфорилазы, обнаружить два типа каталитических центров в ферменте и предложить удобный метод слежения за конформационными перестройками в белке в присутствии ионов Са и Mg . Фосфофруктокиназа (КФ 2.7.1.II) осуществляет в присутствии АТР фосфорилирование Ъ -фруктозо-б-фосфата, в результате чего образуется АДР и Ъ «фруктозо-1,б-дифосфат.
Кооперативные взаимодействия субъединиц в неорганической пирофосфатазе
В реакциях пирофосфатазы с аффинными ингибиторами наблюдается неодинаковое поведение субъединиц. При взаимодействии белка с метилфосфатом, фосфогликолевой кислотой и Ы-ацетилфосфосерином модифицируется только одна субъединица, т.е. проявляется реакционная способность половины активных центров. Реакция с 0-фосфо-этаноламином и О-фосфопропаноламином не останавливается на 50$, и вслед за быстрой модификацией одной субъединицы происходит более медленное присоединение реагента ко второй субъединице, причем, как было показано Кузнецовым А.В., Склянкиной В.А. и Авае-вой СМ. /198/, ингибитор связывается в этом случае двухточечно -- фосфатной группой в активном центре и аминогруппой - в регуля-торном. Если такой фермент выдерживать с пирофосфатом, происходит восстановление активности фермента, что является следствием разрыва связей между белком и фосфатной частью ингибитора. Этот процесс проходит в две стадии, различающиеся по скоростям. Восстановление активности до 50$ сопровождается потерей одной молекулы нгибитора, а при дальнейшем увеличении активности фермента количество связанного ингибитора не изменяется. Объяснение неодинакового поведения химически идентичных субъединиц может быть представлено в рамках двух возможных моделей ассоциации протомеров в димер - симметричной и асимметричной. В первом случае протомеры в отсутствие лигандов существуют в одинаковой конформации, и неодинаковое поведение субъединиц является следствием индуцируемой асимметрии димера. Она возникает в результате того, что присоединение лиганда к одной субъединице вызывает конформационные изменения, которые передаются на вакантную субъединицу, и ее свойства становятся отличными от нативного состояния. В другом случае химически идентичные протомеры находятся в разных конформациях, и неодинаковое поведение субъединиц может являться следствием предсуществующей асимметрии димера, в котором субъединицы изначально имеют различные свойства. Таким образом, принципиальное отличие этих двух вариантов состоит в том, что в первом случае различное поведение субъединиц является следствием их кооперативного взаимодействия, приводящего к индуцируемой асимметрии молекулы, а во втором - оно может быть объяснено предсуществующей асимметрией независимо от того, существует ли взаимодействие субъединиц или нет. В настоящей работе для решения этой дилеммы проведено сравнительное изучение конфор-мационных состояний свободных субъединиц в пирофосфатазе, модифицированной по одной субъединице моноэфирами фосфорной кислоты различного строения.
Если неодинаковое поведение субъединиц возникает в результате индукции, можно ожидать, что в зависимости от природы реагента конформации модифицируемых субъединиц будут разными, и вследствие этого вакантные субъединицы также будут находиться в отличающихся конформациях и иметь разные свойства, С другой стороны, если неодинаковое поведение субъединиц обусловлено предсуществующей асимметрией и активные центры фермента не взаимодействуют друг с другом, свойства немодифицированной субъединицы не будут зависеть от изменений, которые произошли в соседней субъединице в результате ее модификации. В качестве модифицирующих агентов использовали метилфосфат, Ы-ацетилфосфосерин, 0-фосфоэтаноламин и О-фосфопропаноламин. Получение производных пирофосфатазы представлено на схеме: Фермент (УП) выдерживали с I0 2 М ингибиторами при 25С в течение 1,5 часов в случае метилфосфата и Гі-ацетилфосфосерина и 2,5 минут - в случае О-фосфоэтанол- и 0-фосфопропаноламинаи модифицированный белок выделяли гель-фильтрацией. Полученные производные фермента (І-ІУ) имеют 50$ активности, и ингибитор присое- динен к активному центру одной субъединицы посредством фосфатной части молекулы. Кроме того, получали пирофосфатазу, модифицированную по одной субъединице О-фосфопропаноламином так, чтобы молекула ингибитора была связана с белком либо двухточечно - за счет фосфатной группы в активном центре и аминогруппы - вне его (У), либо только за счет аминогруппы вне активного центра пирофосфа-тазы (УІ). Для этого фермент выдерживали с О-фосфопропаноламином в течение двух часов до полного подавления активности. Полученный в результате модификации белок содержал два моля реагента на моль фермента /198/. Его обрабатывали 10 М пирофосфатом натрия в течение I или 3 часов и полученные соответственно производные У и УІ выделяли гель-фильтрацией. Активность первого из них составляла 50$, а второго - 100$ от исходной. Конформационные состояния свободных субъединиц в производных пирофосфатазы, модифицированных по одной из двух субъединиц, оценивали по их устойчивости к действию субтилизина. Для этого белок инкубировали с субтилизином и определяли ферментативную активность через определенные промежутки времени.
Под действием субтилизина происходит быстрый протеолиэ фермента, следствием чего является уменьшение каталитической активности немодифицированной субъединицы. Зависимость остаточной активности нативной и модифицированной различным образом пирофосфатазы от времени представлена на рис. 7. Этот процесс описывается реакцией псевдопервого порядка. В табл. 5 приведены периоды полуина.ктивации ( 1/2) различных производных фермента. Период полуинактивации нативного белка в данных условиях составляет 10 мин. Присоединение к ферменту ме-тилфосфата и Ы-ацетилфосфосерина (I и П соответственно) приводит к значительной стабилизации немодифицированной субъединицы. В производном I скорость инактивации меньше, чем в нативном ферменте в 2,5 раза, а в случае П-в 1,6 раза. Протеолиэ свободной субъединицы в ферменте, содержащем в одном активном центре остатки О-фосфоэтаноламина (Ш) или О-фосфопропаноламина (1У); не отличается от протеолиза в нативном димере. В производном фермента (У), содержащем двухточечно связанный О-фосфопропаноламин, инактивация субтилизином активной субъединицы протекает в 1,5 раза медленнее, чем в нативном ферменте. Освобождение активного центра от ингибитора, приводящее к производному УІ, делает устойчивость белка к протеолизу аналогичной исходной. Таким образом, природа модифицирующего агента по-разному вли- яет на устойчивость к действию субтилизина немодифицированной субъединицы. Это указывает на различные конформации последней в составе производных фермента І-УІ. Следовательно, в димерной пи-рофосфатазе имеет место индуцируемая асимметрия, возникающая в результате кооперативных взаимодействий субъединиц, и исключается объяснение неодинакового их поведения с позиции предсуществующей асимметрии. Можно было ожидать, что различия конформации свободных субъединиц в ферменте, модифицированном моноэфирами фосфорной кислоты различного строения,проявятся в их каталитических свойствах, т.е. кинетические параметры вакантных субъединиц будут отличаться от соответствующих значений для нативного белка. Однако определение КШг и Умах свободных субъединиц в пирофосфатазе, модифицированной метилфосфатом (I), Ы-ацетилфосфосерином (П) и 0-фосфопропа-ноламином (ІУ),показало, что эти величины практически одинаковы и не отличаются от соответствующих значений для нативного фермента. Причина этого, на первый взгляд, противоречия может заключаться в том, что в присутствии субстрата - пирофосфата магния - кон-формация активной субъединицы в модифицированном белке изменяется и становится аналогичной нативной. Для проверки этой гипотезы в условиях протеолиза к ферменту, модифицированному Ы-ацетилфос-фосерином (П), и нативному ферменту (УП) был добавлен негидроли-зуемый аналог субстрата - имидодифосфат магния. Результаты исследования показали, что разница в скорости протеолиза модифицированного и нативного белков исчезла. На рис. 8 представлена зависимость остаточной активности пирофосфатазы от времени при про-теолизе П и УП в отсутствие имидодифосфата магния (скорости инактивации отличаются в 1,6 раза) и в присутствии аналога субстрата (скорости уравниваются, и кривые инактивации сливаются - УШ). Таким образом, предположение о конформационной перестройке актив-
Обнаружение веществ на хроматограммах
Хроматографию на бумаге (Ватман 3 мм, Англия) проводили при 20 методом нисходящей хроматографии в системе изопропанол-вода--трихлоруксусная кислота-концентрированный аммиак (75:25:5:0,3). 2.2. Обнаружение веществ на хроматограммах. Соединения, содержащие аминогруппу, обнаруживали по нингид-риновой реакции. Хроматограммы опрыскивали 0,5$ раствором нингид-рина в ацетоне и нагревали до 60 в течение 10-15 мин. Соединения, содержащие фосфор, обнаруживали по методу Ханеса и Шервуда /202/. Для этого хроматограмму опрыскивали раствором, состоящим из 10 мл бО#-ной хлорной кислоты, 10 мл I н соляной кислоты, 25 мл 4$-ного раствора молибдата аммония и 55 мл воды, высушивали на воздухе и помещали на 10-15 мин. в атмосферу сероводорода до появления синих пятен. 2.3. Определение радиоактивности. Радиоактивность образцов, содержащих тритий, определяли, помещая аликвоту исследуемого раствора в сцинтиллятор ЖС-8 (10 мл), содержащий 9% этилового спирта, и просчитывая на жидкостно-сцин-тилляционном счетчике "Марк П" или "Марк Ш" фирмы "Нуклеар-Чика-го" (США) или "Ультрабета" фирмы "ЛКБ" (Швеция). Для количественного определения неорганического фосфата использовали полуавтоматический прибор, сконструированный А.А.Байковым /203,204/. Анализируемый раствор смешивался с раствором мо-либдата аммония в 3 н серной кислоте (17,5 мг/мл) и затем с раствором красителя - метилового зеленого (0,13 г/л), содержащим детергент - тритон Х-305 (1,2 г/л). Абсорбция раствора измерялась в проточной кювете фотометра при 620 нм и регистрировалась на самописце. Количество фосфата определяли по калибровочной прямой. 2.5. Количественное определение содержания фосфора в модифицированном белке. Количество фосфора, содержащегося в модифицированном моно-эфирами фосфорной кислоты ферменте, определяли по методу Гесса /205/. 0,15-0,5 мг модифицированного белка, освобожденного от фосфорсодержащих соединений гель-фильтрацией на колонке 1x50 см с сефадексом 6-50, тонкий, упаривали досуха при 110, добавляли 10 мкл 10 н раствора серной кислоты, 50-300 мкл концентрированной хлорной кислоты и нагревали при 190 в течение 2,0-6,0 часов до прекращения выделения белого дыма. К охлажденным пробам добавляли 0,5 мл воды и I мл свежеприготовленного реактива для определения неорганического фосфата.
После развития окраски (в течение 10 минут) измеряли поглощение полученного раствора при 660 нм на приборе "Спекорд" (ГДР). Количество неорганического фосфата определяли по калибровочной прямой. Реактив для определения неорганического фосфата готовили следующим образом: 0,045$ водный раствор малахитового зеленого и 4,2$ раствор молибдата аммония в 4 н соляной кислоте в соотношении 3:1 перемешивали в полиэтиленовом стакане в течение 30 мин., отфильтровывали и смешивали с 2$-ным раствором Х-305 из расчета а) Определение концентрации нативного фермента. Концентрацию пирофосфатазы определяли спектрофотометрически, измеряя оптическое поглощение раствора белка при 280 нм на приборе "Спекорд" (ГДР) и считая, что I мг/мл имеет поглощение 1,45 /2/. Концентрацию рассчитывали по формуле С мг/мл « А28(/ » 5. б) Гидролизат кипятили с активированным углем до обесцвечивания раствора и затем для удаления соляной кислоты трижды упаривали с водой на роторном испарителе. Далее определяли аминокислотный состав гидроли-зата с помощью аминокислотного анализатора фирмы "Хитачи" (Япония). Концентрацию иммобилизованного фермента рассчитывали по содержанию QLL , $е , Va, . 2.7, Определение ферментативной активности пирофосфатазы. Активность неорганической пирофосфатазы определяли по скорости образования неорганического фосфата из пирофосфата магния при 25 Скорость образования фосфата определяли двумя методами: а) путем непрерывного измерения концентрации фосфата в реакци онной смеси в ходе гидролиза, как описано в 2.4; б) по накоплению фосфата при гидролизе пирофосфата магния за определенный промежуток времени. Для этого по истечении 3-5 минут ферментативную реакцию останавливали прибавлением 0,1 мл 10 н серной кислоты.
Стандартную реакционную смесь для определения активности составляли смешиванием I мл I мМ пирофосфата натрия, I мл I мМ MgCI2 и 4 мл 0,05 М трис-НС1 рН 7,2. 3. Исследование реакции неорганической пирофосфатазы с моно- зфирами фосфорной кислоты. В работе использовали растворы моноэфиров фосфорной кислоты, нейтрализованные до рН 7,0 с помощью 5 н раствора ДМаОН. 3.1. Инактивация пирофосфатазы под действием метилфосфата, фосфогликолевой кислоты, Ы-ацетилфосфосерина, 0-фос- фоэтаноламина, О-фосфопропаноламина и метилового эфи ра О«фосфосерина. Фермент (5-100 мкг) инкубировали в 0,3-1,5 мл буферного раствора (рН 6,5-7,2), содержащего 0,1-20 мМ моноэфир фосфорной кислоты при 25. Через определенные промежутки времени (0-120 мин.) отбирали аликвоты (5-40 мкл) для определения ферментативной активности. В контрольном опыте белок выдерживали в тех же условиях без ингибитора. 3.2. Реакция пирофосфатазы с моноэфирами фосфорной кислоты в присутствии субстрата - неорганического пирофосфата. Фермент (5-Ю мкг) инкубировали в 0,05 М трис-HCI буфере о рН 7,2, содержащем I мМ пирофосфат натрия, 10 и М фосфогликолевую кислоту или Ы-ацетилфосфосерии, или 10 J Ы метиловый эфир 0-фос-фосерина, при 25. Через определенные промежутки времени (0-60 мин.) из реакционной смеси отбирали аликвоты для определения активности фермента. В контрольном опыте белок выдерживали в тех же условиях, но без ингибитора и пирофосфата натрия. Для расчета наблюдаемых констант скорости инактивации строили графики зависимости ферментативной активности от времени инкубации пирофосфатазы с моноэфирами фосфорной кислоты в полулогарифмических координатах. Наблюдаемую константу скорости реакции рассчитывали по формуле Я на(5Лф= 0,693/ j/2» гДе \/2 " по лупериод инактивации /206/. Для определения константы ингибирования (К ) и константы скорости инактивации ( ) строили графики зависимости наблюдаемой константы скорости инактивации от концентрации реагента в обратных координатах и по отрезку, отсекаемому на оси абсцисс, определяли К, а по отрезку, отсекаемому на оси ординат - & . 3.4. Модификация неорганической пирофосфатазы моноэфирами фосфорной кислоты. Фермент (0,5 мг) инкубировали в 50 мл 0,025-0,050 М буфера МЭС-ЫаОН рН 6,5, содержащего 10 М реагент, в течение 0,5-120 мин. при 25. Раствор лиофильно высушивали, растворяли в 0,5-1,5 мл воды и освобождали от избытка ингибитора гель-фильтрацией на колонке 1x50 см с сефадексом G-50 тонкий, уравновешенной тем же буфером. Определение количества связанного с белком реагента проводили, как описано в п. 2.5.
Получение иммобилизованной субъединицы неорганической пирофосфатазы и реконструкция димерной формы фермента
Для получения иммобилизованной субъединицы пирофосфатазы к 10 мл реакционной смеси, приготовленной, как описано в п. 5,1, прибавляли равный объем буфера 0,6 М CAPS -НаОН рН 10,5 и перемешивали в течение 18 часов при 4. Конечная концентрация фермента составляла 0,5 мг/мл. Иммобилизованный мономер отфильтровывали, промывали тремя порциями равного объема 0,5 М хлористого натрия в 0,1 М буфере CAPS -ЫаОН.рН 10,5, затем .0,1. М буфером CAPS -ІіаОН рН 10,5 и буфером трис-HCI рН 7,2 до отсутствия поглощения при 280 нм и нулевой ферментативной активности. Содер- жание белка и пирофосфатазную активность в геле и растворе определяли, как указано в п. 2.6,6 и 2.7. Реконструкцию димерной формы пирофосфатазы из иммобилизованного мономера проводили, как описано в работе /207/, 5.3. Исследование влияния монофосфатов на иммобилизованные производные пирофосфатазы во времени. Иммобилизованный фермент промывали на колонке 5-кратным объемом 50 мМ ЭДТА (Иа+-соль) и 5-кратным объемом буфера 0,05 М трис-Ш1 рН 7,2 для удаления ионов магния. 0,1-0,5 г отжатого геля с иммобилизованным ферментом инкубировали в течение 1-2 часов в 0,05 М буфере МЭС-ЫаШ рН 6,5, содержащем 10" -10 М моноэфир фосфорной кислоты (метилфосфат, О-фосфоэтаноламин, О-фосфопропаноламин, К-хлорацетилфосфоэтанол-амин). Через определенные промежутки времени отбирали аликвоты для определения активности фермента. 5.4. Влияние моноэфиров фосфорной кислоты на кинетику гид ролиза пирофосфата магния иммобилизованными производ ными фермента. Для определения кинетических параметров гидролиза пирофосфата магния определяли начальные скорости ферментативной реакции, как описано в п. 3.7. Концентрация свободной формы Мо составляла I мМ, а концентрации ингибиторов варьировали от 0 до 2 мМ. б. Выделение пептида, содержащего аминокислоту, модифициро ванную метилфосфатом. 6.1. Последовательная модификация.пирофосфатазы метилфосфатом з и [нй]-Н-метилгидроксиламином. Фермент (0,5 мг) инкубировали при 25 в 20 мл 0,025 М буфера _p МЭС-NaOH рН 6,5, содержащего 10 \М метилфосфат, в течение 1,5 часов. Затем в реакционную смесь добавляли 10 мМ раствор пирофос-фата натрия до концентрации I мМ и I М РН] Ы-метилгидроксил амин, предварительно оттитрованный соляной кислотой до рН 6,5, до концентрации 0,1 М. Через определенные промежутки времени (0-60 мин.) отбирали аликвоты для определения активности.
Кроме того, определяли количество связанного с ферментом метилфосфата. Для этого 500 мкл раствора разбавляли в 500 раз 0,05 М буфером трис--HCI рН 7,2, содержащим I мМ пирофосфат натрия, выдерживали в течение часа, добавляли I мл I мМ Мо2+ и измеряли ферментативную активность. По окончании реакции раствор лиофильно высушивали. Остаток растворяли в минимальном количестве воды ( 3 мл), диали-зовали против 0,025 М МЭС-NaOH рН 6,5 при 4 в течение ночи и подвергали гель-фильтрации через колонку 1x50 см с сефадексом 6-50 тонкий, уравновешенную буфером 0,1 М трис-HCI рН 7,2. В белковых фракциях определяли количество связанного [ 3Н]-Ы метилгид-роксиламина, как описано в п. 2,3, и метилфосфата, как описано в п. 2.5. Контрольные образцы, в которых фермент обрабатывался либо только метилфосфатом, либо только Н-метилгидроксиламином, подвергался таким же исследованиям, как и опытный. 6.2. Выделение и характеристика пептида, содержащего аминокислоту, модифицированную метилфосфатом. Раствор, содержащий 15 мг модифицированной метилфосфатом пирофосфатазы, лиофильно высушивали, остаток растворяли в б мл воды, добавляли [ Н]-Ы-метилгидроксиламин и пирофосфат натрия до концентрации соответственно. 0,1 Ми I мМ и инкубировали в течение I часа при 25. Раствор диализовали против 0,025 М МЭС--ЫаОН рН 6,5 в течение 24 часов при 4 и затем проводили гель--фильтрацию через колонку 1x50 см с сефадексом 6-50 тонкий, урав- . новешенную 0,01 М ЫН НСО буфером рН 8,2. Фракции, содержащие радиоактивность, объединяли и лиофилизовали. Меченый белок растворяли в 0,23 мл 0,01 М ЫН НСО буфера рН 8,2 и прибавляли трипсин в количестве 2% от веса пирофосфата-зы в две порции - в начальный момент времени и через два часа. Гидролиз вели 4 часа при 37. Затем реакционную смесь лиофилизовали. К сухому остатку прибавили 300 мкл 0,01 М аммонийацетатного буфера рН 5,6 и нерастворившийся осадок отделяли центрифугированием. Гидролизат наносили на колонку Cg HPLC (" Яи Pont ynvtruinentg 850й, США) и проводили элюцию пептидов градиентом раствора ацетонитрила в 0,01 М аммонийацетатном буфере рН 5,6 со скоростью I мл/мин. В течение первых 10 мин. элюировали исходным буфером, затем 60 мин. - возрастающей от 0 до 50$ концентрацией ацетонитрила в буфере, в течение последующих 20 мин, - градиентом концентрации ацетонитрила в буфере от 50 до 100$ и затем 15 мин.-- 100# ным ацетонитрилом. За выходом пептидов следили спектрофото-метрически по поглощению растворов при 210 нм. Из каждой фракции отбирали аликвоты для определения радиоактивности, как указано в п. 2,3. Профиль элюции пептидов с колонки представлен на рис. 14. Разделение пептидов проводили в Институте биоорганической химии АН СССР совместно с Н.Н.Модяновым. Во фракциях Ш 37 и 38, содержащих меченый пептид, определяли N-концевые аминокислоты и аминокислотный состав. гидролиз в ваісууме при 105 в течение 18 часов.
Гидролизат упаривали, добавляли 10 мкл ацетона и проводили разделение ДНС-произ-водных аминокислот двумерной хроматографией на полиамидной пленке ("В7)НИ, Англия) размером Юхб см в следующих системах: муравьиная кислота-вода (10:0,15, Y/v) - в первом направлении и бензол-уксусная кислота (9:1, V/y) или этилацетат-метанол ук сусная кислота (10,0:0,5:0,5, V/v) - во втором. 6.4. Определение аминокислотного состава меченого пептида. Аминокислотный состав меченого пептида определяли после гидролиза 5,7 н HCI при 105 в течение 18 часов на аминокислотном анализаторе "7)игижп (США). Результаты анализа пептида, содер-жащегося во фракции № 38, представлены в табл. 7. 1. Проведено детальное исследование реакции неорганической пи-рофосфатазы из пекарских дрожжей с моноэфирами фосфорной кислоты, содержащими различные функциональные группы в органической части молекулы: метилфосфатом, фосфогликолевой кислотой, Н-ацетилфос-фосерином, метиловым эфиром фосфосерина, О-фосфоэтаноламином и О-фосфопропаноламином. 2. Доказано, что все эти реагенты взаимодействуют с активным центром пирофосфатазы. Введение дополнительных функциональных групп влияет на сродство ингибиторов к ферменту и на устойчивость образующейся ацилфосфатной связи. 3. Сравнение свойств иммобилизованных мономера и димера показало, что химическая модификация характерна для фермента, имеющего четвертичную структуру. 4. Установлено, что модификация пирофосфатазы моноэфирами фосфорной кислоты разного строения вызывает различные конформацион-ные изменения. Причиной неодинакового поведения субъединиц в ди-мере является их кооперативное взаимодействие. 5. Проанализированы возможности расположения аффинных ингибиторов в активном.центре пирофосфатазы и сделано предположение о модификации остатка Gtu-V\l . Высокая реакционная способность этого аминокислотного остатка и полная потеря ферментативной активности при его блокировании указывают на возможное участие С Си, 147 в катализе.
