Содержание к диссертации
Введение
1. Тритерпеновые гликозиды, содержащие d-глюкуроновую кислоту и особенности их строения. 7
2. Масс-спектрометрия тригерпеновых гликозидов ряда олеанена 37
2.1. 3-О-Гликозиды 38
2.2. 28-0-Гликозиды 41
2.3. 3,28-0-Бисгликозиды 4-І
2.4. Распад углеводных цепей и последовательность моносахаридных остатков 44
3. Тритерпеновые гликозиды сымасортева thansoxaka (iljih) botsch 46
3.1. Общие сведения о физиологически активных веществах растении сем. Chenopodiaceae 46
3.2. Выделение и разделение гликозидов из Olimacoptera transoxana 49
3.3. Строение коптерозидов В и С . 50
3.4. Строение коптерозида D 55
3.5. Строение коптерозидов Ей? 58
3.6. Строение коптерозидов G и Н 63
4. Тритерпеновые гликозиды salsola micraffiffieha botsch 74
4.1. Выделение и разделение гликозидов 74
4.2. Строение салсолозидов С и D 76
4.3. Строение салсолозида Е 83
4.4. О биогенезе гликозидов Glimacoptera transoxana И Salsola micrantliera 89
4.5. Перечень структурных формул, встречающихся в' разделах 3, 4 и 5 92
4.6. Биологическая активность-коптерозидов и салсолозидов 94
5. Экспериментальная часть 96
5.1. Общие сведения 96
5.2. Тритерпеновые гликозиды Glimacoptera transoxana 98
5.2.1. Выделение и разделение гликозидов 98
5.2.2. Коптерозиды В и G 101
5.2.3. Коптерозид D 104
5.2.4. Коптерозид Е 106
5.2.5. Коптерозид 109
5.2.6. Коптерозиды & и Н 111
5.3. Тритерпеновые гликозиды Salsola micranthera 114
5.3.1. Выделение и разделение гликозидов 114
5.3.2. Салсолозид С 115
5.3.3. Салсолозид D 118
5.3.4. Салсолозид Е 119
5.3.5. Лабораторный регламент получения препарата, обладающего гонадотропной активностью 123
Выводы 124
- 28-0-Гликозиды
- Строение коптерозидов Ей?
- Перечень структурных формул, встречающихся в' разделах 3, 4 и 5
- Тритерпеновые гликозиды Salsola micranthera
Введение к работе
Тритерпеновые гликозиды, лежащие в основе подавляющего большинства растительных сапонинов, вот уже в течение двух десятилетий являются объектом пристального изучения. Интерес к ним не ослабевает, наоборот, количество публикаций в этой области из года в год растет. В работу включаются новые исследовательские коллективы преимущественно из стран с богатой и разнообразной растительностью.
Такое повышенное внимание к тритерпеновым гликозидам обусловлено их важной ролью в жизнедеятельности растений. К настоящему времени накоплен достаточно обширный материал, свидетельствующий о том, что сапонины, в состав которых входят тритерпеновые гликозиды, имеют существенное значение в борьбе за существование при антагонистических взаимоотношениях биологических систем.
Тритерпеновые гликозиды обладают широким спектром физиологического действия. Большинство из них мембраняоактивные соединения. Если первые практические рекомендации по использованию тритерпенових гликозидов в медицине опирались на их отхаркивающее, седативное и гипохолестеринимическое действие, то в последние годы выявлен ряд веществ с адаптогенными, контрацептивными и гонадотропними свойствами.
В целом же возможности создания на основе тритерпенових гликозидов лекарственных препаратов реализуются не в полной мере. Причиной тому малая доступность индивидуальных гликозидов и трудности, возникающие при стандартизации суммарных препаратов.
Широкое и неконтролируемое использование сапонияоносных растений (в первую очередь красного, белого и туркестанского корня, а также солодки) в пищевой промышленности и в технических целях привело к истощению сырьевых запасов. Возникла необходимость научиться культивировать традиционные сапониноносы и изыскивать новые. Эти -поиски прежде всего следует вести среди растений, произрастающих на неиспользуемых для земледелия площадях. Немаловажное значение имеет доступность и ежегодная воспроизводимость такого рода сырья.
Из сказанного становится ясным актуальность научного поиска, осуществленного в рамках данной диссертации. Объектом исследования выбраны два растения из сем. Ghenopodiaceae (маревые ), обильно произрастающие на солончаках в пустынных и полупустынных зонах республик Средней Азии.
Основными целями данной работы являлись:
- Разработка методов выделения индивидуальных веществ и доказательство строения новых тритерпеновых гликозидов растений
Glimacoptera transoxana И Salsola micrantherа.
- Накопление достаточного количества тритерпеновых гликозидов, свободных от примесей, для испытания на биологическую активность,
В итоге выполнения настоящей работы получены следующие результаты, определяющие научную новизну и практическую значимость:
- Новыми, доступными источниками тритерпеновых гликозидов
ЯВЛЯЮТСЯ однолетние растения G.transoxana И S.micranthera .
- Из двух видов растений выделено и доказано строение 9 новых гликозидов олеаноловой кислоты, хедерагенина и гипсогеновои кислоты. Разработаны методы их выделения.
- Накоплена и переданы на биологические испытания суммарные препараты и отдельные индивидуальные гликозиды. В опытах на насекомых обнаружена гонадотропная активность отдельных препаратов.
Диссертация состоит из следующих разделов: введения, литературного обзора, обсуждения полученных результатов, экспериментальной части, выводов и списка используемой литературы.
Литературный обзор состоит из двух глав. Первая глава посвящена описанию свойств и особенностей строения тритерпеновых гликозидов, содержащих D -глюкуроновую кислоту. Этот выбор продиктован тем, что все выделенные нами гликозиды содержат D -глюкуроновую кислоту.
Во второй главе рассмотрена масс-спектрометрическая характеристика гликозидов олеаноловои кислоты и хедерагенина и их производных. Необходимость включения такого раздела возникла в связи с тем, что в доказательстве химического строения новых гликозидов широко применялись данные масс-спектрометрии.
Работа выполнена в лаборатории химии гликозидов ордена їрудового Красного Знамени Института химии растительных веществ АН УзССР в период 1279-1983 гг. Она является частью работ этой лаборатории по изысканию биорегуляторов на основе стероидов и тритерпеноидов растительного происхождения.
28-0-Гликозиды
При гликозилировании олеаноловой кислоты и её производных только по карбоксильной группе, масс-спектрометрическая картина резко меняется. Ионы с ш/ z 453 и 262, характерные для производных олеаноловой кислоты, у которых имеются заместители при С-3, отсутствуют. Наиболее интенсивным становится ион с m /z, 425, образующийся при распаде молекулярного иона по линии В (схема 2.2). Интенсивны также пики ионов с m/z 470, 248, 203, образующиеся из агликоновой части. На характер распада сахарной части то обстоятельство, что она этерифицирует карбоксильную группу при С-28, сложноэфирная связь не оказывает влияния. Пик иона ретро-диенового распада, включающий олигосахаридное звено, малоинтенсивен. 2.3. 3,28-0-Бис-гликозиды При одновременном замещении в олеаноловой кислоте и близких к ней соединений (хедерагенин и другие) углеводными остатками гидроксильной группы при С-3 и карбоксильной при С-28 наблюдается одновременное или последовательное отщепление обоих заместителей по местам связи А, Ар Ви By (схема 2.3) с образованием соответствующих фрагментов. По характеристичным пикам можно заключить о числе сахарных остатков в той или другой углеводной цепи. Наиболее четко выражены ионы, образующиеся при отщеплении обоих углеводных заместителей - m /z 439, 469 и 437 (схема 2.3). Последний иоа_ очень характерен для гликозидов хедерагенина. В отличии от 3-0-гликозидов, при ретродиеновом распаде остатков агликонов с m/z 439 и 469, образуется не ион с m/z 262 (см.схему 2.1), а ион с m/z 248, что обусловлено занятостью положения при G-28 сахарным остатком. Следует отметить, что ион ретродиенового распада, включающий углеводное звено, у перметилатов 28-0- и 3,28- 0-бис-гликозидов в отличие от ацетатов /166/ малоинтенсивен. По-видимому, это объясняется большей прочностью связей:в ацетатах по сравнению с метиловыми эфирами. 2.4. Распад углеводных цепей и последовательность моносахаридных остатков В масс-спектрах рассматриваемых перметилатов, имеющих в качестве концевого сахара гексозу, обнаруживаются ионы ci/z 219, 187, 159, 155 и III, характерные для полностью метилированных гексоз /152/. Терминальная гексуроновая кислота образует серию ионов с ш/ 2 233, 201 и 169 /167/, а терминальная пентоза (ксилоза и арабиноза) с m/ z 175 и 14-3 /155/. Большой интерес представляют серии ионов, возникающие при разрыве связей у С-3 или С-28, ионы олигосахаридных фрагментов, а также ионы, которые образуются при разрыве связей между моносахаридными остатками. Анализ и установление структуры этих ионов позволяет определить положение углеводных цепей в гликозидах, природу углеводных цепей и последовательность соединения моносахаридных остатков.
В масс-спектрах метиловых эфиров биозидов олеаноловой кислоты, имеющих дисахаридную цепь, состоящую из двух гексозных остатков, характерными являются ионы с ш/ z 423 и 391 (схема 2.4). Кроме этих ионов для метилированного дисахарида такого состава характерен ион с т/ z 305 /153/. Здесь же уместно отметить интересный путь распада, ранее не обнаруженный у простых дисахари-дов и приводящий к образованию иона с т/а 337 /159/. На основе анализа масс-спектров перметилатов биозидов нередко можно сделать вывод относительно места взаимной связи отдельных моносахаридов. Так, в спектре биозида со связью 1-»-4 из перечисленных пиков, наиболее высокую интенсивность имеет ион с ж /z 337, интенсивность остальных пиков незначительна. В био-зидах, имеющих связи 1- 3 и 1- 2, интенсивность пиков ионов!с m/z 423, 391 и 305 увеличивается, а иона с m/ а 337 падает /159/. Семейство Ghenopodiaceae объединяет приблизительно 100 родов, включающих 1400 видов, распространенных по всему земному шару /168/. Это в основном, однолетние и многолетние травянистые растения. Встречаются также полукустарники и кустарники. Многие представители этого семейства играют преобладающую роль в ландшафтах равнинных пространств наших пустынь и полупустынь, являясь единственным видом летнего и особенно зимнего корма для верблюдов и овец. Растения эти играют большую роль при закреплении песков. Зольный остаток отдельных растений использовался местным населением для получения соды и взамен мыла. Из некоторых видов получают краски, эфирные масла. В народной медицине они используются как лекарственные средства против парши, сыпи, мигрени и астмы. Большинство видов являясь галофитами, уносят из почвы много солей, прежде всего хлористый натрий, делая её пригодной к землепользованию /169/. Растения этого семейства в химическом отношении наиболее подробно изучались на содержание алкалоидов. Во многих представителях РОДОВ Anabasis , Chenopodium , Girgensohnia , Halos ahus ,Hammada,Petrosimonia и Salsola найдены ЭЛКЭЛОИДЫ. Выделены в индивидуальном виде анабазин, анабазамин, пупинин, филлидин, афиллин, яксатринин, галостахин, диптерин, N -метил-пиперидин, гиргенсонин, лептокладин, элеагнин, пиперидин, суба-филлин и другие азотистые основания /170/, обнаружен бетаин /171/. Из этих соединений промышленное значение имеет анабазин, в виде сульфата он используется в качестве инсектицида. Анабазин - гидрохлорид рекомендован, как средство, избавляющее от привычки к курению. До недавнего времени в медицине широко использовались алкалоиды Saisoia Richteri . Из этого растения выделены алкалоиды сальсолин и сальсолидин /172-174/« Их гидрохлориды долгое время входили в номенклатуру лекарственных средств для лечения гипертонической болезни. Довольно подробно изучены флавоноиды у представителей Beta , Spinacea и Giimacoptera . Выделены витексин, кемпферол, кверцетин, патулетин, ;шпинацетин /175/, изорамнетин, изокверцетин, кверцетин, рутин и другие /176/. В последние годы появляются сообщения о нахождении и других классов физиологически активных соединений. Например, в chenopo-dium album И Spinacea oleraceae Обнаружены ЭКДИСТероиды: экдистерон, полиподин В,24(28) дегидромакистерон А /177-178/. Из Ghenopodium multifidum выделен эндопероксидный монотерпен /179/. Подробно изучены пектиновые вещества сахарной свеклы /180/. Сведения о наличии тритерпеновых гликозидов в растениях этого семейства появлялись давно Д81-183/. Среди сапониносодер-жащих растений по предварительным поискам сем.Маревые отнесено к одним из наиболее перспективных /183/.
Из отдельных объектов выделены сапогенины тритерпеновой природы /184-186/, в других случаях исследователи ограничились только установлением природы агликона и качественного состава моносахаридов /187/. Только для немногих гликозидов установлено полное с троение.Это марь-сапонины А и В /188/, шпинасапонины /22/, гликозиды Beta vulgaris /18-19/ и сапонины А и В из Bassia latifolia /189/. Наш выбор на исследование тритерпеновых гликозидов однолетних растений Glimacoptera transохапа И Salsola micranthera обусловлен тем, что оба растения широко распространены по всей территории Средней Азии и Казахстана /190/, хорошо обеспечены сырьевой базой. До 1956 года оба растения относили к роду Salsola , но затем из-за морфологических различий несколько видов отделили в самостоятельный род Glimacoptera /191/. Предварительно, нами было проведено хроматографическое исследование нескольких ВИДОВ, ОТНОСЯЩИХСЯ К родам ClimacopteraH Salsola ї G« Korshinskyi (Drot .) Botsch, G. ferganica (Drob.) Botsch, C. lanata (Pall.) Botsch, G. transoxana (Iljin) Botsch, S. Richte-ri Kar.,S. micranthera Botsch, S. rigida Pall.,S. hispidula Bge. и другие. При этом выявлено, что многие виды содержат тритерпено-вые гликозиды. Только в s. hispidula Bge.гликозиды не обнаружены, а в s. Richteriсодержание их совсем мало. Хроматографическое изучение различных органов с. transoxana и s. micranthera показало, что тритерпеновые гликозиды накапливаются в цветках и семенах. В корнях выявлено наличие веществ алкалоидной природы. Ранее с.transoxana изучался на содержание флавоноидов /176/, там же упоминается о нахождении в растении тритерпеновых гликозидов. 3.2. Выделение и разделение гликозидов ИЗ С. transохапа. Сырье собрано в конце вегетации растения, в степных солончаках, Юго-Восточной Туркмении (окрестности с.Ташлык). Воздушно-сухое сырье экстрагировали хлороформом, а затем исчерпывающе горячил метанолом. Метанольный экстракт после сгущения и высушивания представлял собой смолистое вещество коричневого цвета. Выход экстрактивных веществ 28%. В составе экстракта присутствовало ощутимое количество неорганических примесей, основную массу которого составляла поваренная соль.
Строение коптерозидов Ей?
Кислотный гидролиз коптерозидов Е (X) и (XI) привел к получению олеаноловой кислоты (ХП) и хедерагенина (I). Методами БХ и ТСХ в гидролиза тах обоих гликозидов обнаружили D -ксилозу, D-глюкозу и D-глюкуроновую кислоту. ГЖХ /134/ показала наличие тех же моносахаридов в одних и тех же соотношениях - 2:1:1. Как было показано ранее, рассматриваемые гликозиды X и XI содержат О-ацилозидные углеводные цепи. Щелочным гидролизом коптерозидов Е (X) и (XI) получили соответствующие прогенины ХІУ и ХУ. Кислотный гидролиз прогенинов ХІУ и ХУ с последующим анализом углеводных частей гидролизатов на ТСХ и БХ показал, что в них отсутствует D -глюкоза. Гликозиды ХІУ и ХУ метилировали по Хакомори /137/. Молекулярные ионы в масс-спектрах полученных перметилатов ХУІ (М+ 1022) и ХУП (М+ 1052) свидетельствуют о том, что эти гликозиды содержат три сахарных остатков, т.е. D-глюкуроновую кислоту и D-ксилозу в соотношении 1:2. Соответствующий ион трисахаридного фрагмента имеет массу n/ z 553. Интенсивный пик иона ретро-диенового распада с m/ z 262 указывает на отсутствие сахарного заместителя при С-28 агликонов (схема 3.5). Следовательно, О-ацилозидные части коптерозидов Е (X) и 3? (XI) представлены только D-глюкозой. Коптерозиды Е (X) и (XI) также метилировали по Хакомори и получили перметилаты ХУШ (М+ 1226) и XIX (М+ 1256). Пермети-латы ХУШ и ХІХподвергли кислотному гидролизу. Из генинных час- тей продуктов гидролиза выделим олеаноловую кислоту (ХП) и 23-0-метилхедерагенин (IX) соответственно (схема 3.4). Анализ углеводных частей гидролизатов с помощью ТСХ в различных системах растворителей показал, что они идентичны и состоят из трех компонентов - О-метилпроизводных D-глюкуроно-вой кислоты, D-глюкозы и D-ксилозы. Два последних идентифицировали на ТСХ в присутствии истинных образцов с 2,3,4,6-тет- ра-О-метил-в-глюкозой и 2,3,4-три-0-метил-Б-ксилозой. Образование 2,3,4-три-0-метил-D-ксилозы свидетельствует о том, что обе молекулы D-ксилозы терминальны и следовательно D-глюку-роновая кислота является центром разветвления. Подтверждение тому образование 3-0-_р - D-глюкуронопиранозидов олеаноловой кислоты (ХШ) и хедерагенина (П) соответственно, как при деструкции коптерозидов Е (X) и Р (XI) по Смиту /136/, так и при ступенчатом гидролизе прогенинов ХІУ и ХУ. Таким образом мы приходим к выводу, что более полярный метилированный сахар, полученный из перметилатов ХУШ и XIX, должен быть монометильным производным D-глюкуроновой кислоты.
Для выяснения строения этого моно-О-метильного производного перметилаты ХУШ и XIX подвергли восстановительному расщеплению алюмогидридом лития и последующему кислотному гидролизу. В генин-ной части продуктов реакций, полученных из перметилата ХУШ,обнаружили эритродиол (XX), а из перметилата Х1Х-23-метокси-28-окси--в-амирин (XXI). Углеводные же части продуктов в обоих случаях оказались идентичными и состояли из 2,3,4,6-тетра-0-метил- D-сорбита, 2,3,4-три-0-метил-і)-ксилозы и моно-О-метил-D-глюкозы. Последнее соединение, выделенное в индивидуальном виде, давало положительную реакцию Боннера /192/, указывающую на присутствие ?С-диольной группировки. Однако, метилгликозид, полученный метилированием моно-О-метил-D -глюкозы,не окислялся пер-йодатом натрия и не реагировал с реактивом Боннера. Приведенные данные однозначно определяют моно-О-метильное производное D -глюкозы как 3-0-метил-D -глюкозу, а соответствующее моно-О-метильное производное D -глюкуроновой кислоты, следовательно?является З-О-метил-D -глюкуроновой кислотой. Дальнейшие данные о строении коптерозидов Е (X) и f (XI) получили при сопоставлении масс-спектров соответствующих перме- тилашов ХУІ, ХУП, ХУШ и XIX (схема 3.5). Пик иона с m/z 553 в масс-спектрах перметилатов ХУІ, ХУП, ХУШ и XIX,соответствующий метилированной углеводной цепи при С-3, включает одну молекулу D -глюкуроновой кислоты и две молекулы D-ксилозы. Пик иона с m/ а 219 в масс-спектрах перметилатов ХУШ и XIX отвечает полностью метилированной гексозе /152/. Бее это подтверждает, что D -глюкоза в коптерозидах Е (X) и (XI) присоединена по карбоксилу агликонов. В -конфигурация всех гликозидных связей- принята в соответствии с правилом Кляйна /194/« Таким образом, коптерозиды Е (X) и 3? (XI) являются парными бисдесмозидными гликозидами, отличающимися между собой только генинами. Коптерозид Е (X) имеет строение 3-0-ЛГр -D -ксилопиранозил (I- 2)J, Г в -D -ксшюпиранозил(1- 4)7 — -в -глюкуронопиранозиді, 28-0-R -D -глюкопиранозида олеаноловой кислоты, а коптерозид (XI) является 3- 0-ftp -D -ксилопиранозил(1- 2) -я Пз - D -ксилопиранозил (1-И-}7 — Э D -глюкуронопиранозид 1?28-0- -D -глкжопи-ранозидом хедерагенина. З.б. Строение коптерозидов 6 иН Коптерозиды G (ХХП, схема З.б) и Н (ХХШ, схема 3.7) относятся к наиболее полярным гликозидам климакоптеры заамударьинс-кой. В количественном отношении гликозид G (ХХП) преобладает. Как выяснилось при кислотном гидролизе,генинами обоих гликозидов является гипсогеновая кислота (ХХІУ). Коптерозид G (ХХП) оказался биозидом гипсогеновой кислоты и в качестве сахарных составляющих содержит D-глюкозу и D -глюкуроновую кислоту. Соотношение Сахаров 1:1 подтверждено ГЖХ-анализом /І34-Д Коптерозид Н ХХШ) отличается от коптерозида G (ХХП) наличием дополнительной молекулы D-ксилозы.
Под действием щелочи гликозиды ХХП и ХХШ претерпевали изменения. В кислотных гидролизатах прогенинов ХХУ и ХХУІ, полученных при щелочном омылении, не оказалось D-глюкозы. Следовательно, она составляет 0-ацилозидную часть исследуемых соединений. Гидролиз коптерозидов G (ХХП) и Н (ХХШ) (по отдельности) слабой серной кислотой привел к образованию прогенина ХХУ. Соединение это по физико-химическим константам совпало с веществом, полученным при щелочном омылении гликозида G (ХХП). Как будет показано ниже, оно является 3-0-В-D-глюкуронопиранозидом гип-согеновой кислоты (ХХУ). Для выяснения размера окисных колец D-глюкозы и D-ксилозы коптерозиды G (ХХП) и Н (ХХШ) метилировали по Хакомори /137/. Получили перметилаты ХХУП (М+ 950), ХХУШ (М+ III0). Пер-метилат ХХУП гидролизовали серной кислотой. В качестве генина выделили продукт XXIX, в ИК-спектре которого имеются полоса поглощения гидроксильной группы при 3520 см" 1, свободной карбоксильной группы при 1710 см"1 и сложноэфирной группировки при 1730 см"1 (рис.3.2). В масс-спектре кроме пика молекулярного иона (М+ 500) имеются пики ионов основных фрагментов ретродиенового распада с ш/ z 248 и 203. Исходя из этих данных, соединению XXIX, описываемому впервые, мы вправе приписать строение 23-мо-нометилового эфира гипсогеновой кислоты (XXIX). Метилированными сахарами оказались 2,3,4-три-0-метил- D-глюкуроновая кислота и 2,3,4,6-тетра-0-метил- D-глюкоза (схема З.б). Чтобы выявить место присоединения D-ксилозы к D-глюку-роновой кислоте в коптерозиде Н (ХХШ), перметилат ХХУШ (схема 3.7) восстановили алюмогйдридом лития и гидролизовали. В масс- спектре генина XXX восстановленного продукта имеется пик молекулярного иона, с m/z 458. Наличие осколочных фрагментов с m/z 234,223, 216 и 203 позволяет определить вещество как 23,28-ди-окси-д-амирин (XXX). Сахарную часть гидролизата составили 2,3,4,6-тетра-0-метил- D-сорбит, 2,3,4-три-0-метил- D-ксилоза и диметильное производное D-глюкозы. Последний из Сахаров дает положительную реакцию на присутствие о -диольной группировки /192/. С помощью ИХ установили, что это соединение идентично с 3,4-ди-0-метил- D-глюкозой. Следовательно, .D -ксилоза и D-глюкоза в гликозиде ХХШ являются терминальными сахарами: D-ксилоза присоединена к D-глюкуроновой кислоте 1- »2 связью, а D-глюкоза к карбоксильной группе С-28 (схема 3.7). Предложенную структуру ХХП(схема З.б) подтверждают и данные исследования масс-спектра перметилата ХХУП (рис.3.3). Наличие пика молекулярного иона с m/z 950, хотя и небольшой интенсивности, свидетельствует о том, что в гликозиде ХХП имеются не больше двух молекул сахарных остатков.
Перечень структурных формул, встречающихся в' разделах 3, 4 и 5
Для облегчения знакомства с диссертацией ниже дается перечень структурных формул всех соединений, обсуждаемых в данной работе, с указанием схем и рисунков, где эти структуры приведены. I. Хедерагенин (схема 3.2, 3.3, 3.4, 4.1). П. 3-0-JJ-D -Глюкуронопиранозид хедерагенина (схемы 3.2, 3.3, 3.4, 4.1). Ш. Коптерозид С (схемы 3..2, 3.3). IV. Гекса-О-метиловый эфир глюкуронопиранозида хедераге нина. V. Окта-О-метиловый эфир коптерозида С (схема 3.2). УІ. Метиловый эфир 23-0-метилхедерагенина (схема 3.2). УП. Коптерозид D (схема 3.3). УШ. Ундека-О-метиловый эфир коптерозида D (рис.3.1). IX. 23-0-метилхедерагенин (схема 3.3). X. Коптерозид Е (схема 3.4). XI. Коптерозид (схема 3.4). ХП. Олеаноловая кислота (схема 3.4). ХШ. 3-0-B-D -Глюкуронопиранозид олеаноловой кислоты (схема 3.4). XIV. Прогенин щелочного омыления коптерозида Е (схема 3.4). XV. Прогенин щелочного омыления коптерозида (схема 3.4). XVI. Перметилат прогенина ХІУ (схема 3.5). ХУП. Перметилат прогенина ХУ (схема 3.5). ХУШ. Перметилат коптерозида Е (схема 3.5). XIX. Перметилат коптерозида (схема 3.5). XX. Эритродиол (схемы 3.4, 4.1). XXI. 23-MeTOKcn-28-OKCH-j3 -амирин (схемы 3.4, 4.1). ХХП. Коптерозид G (схема З.б). ХХШ. Коптерозид Н (схема 3.7). XXIV. Гипсогеновая кислота (схема З.б). XXV. 3-0-в -D -Глюкуронопиранозид гипсогеновой кислоты (схема З.б). XXVI. Прогенин щелочного омыления коптерозида Н (схема 3.7). ХХУП. Нона-О-метиловый эфир коптерозида G (рис.3.5). ХХУШ. Ундека-О-метиловый эфир коптерозида Н (схема 3.7). XXIX. 23-0-монометиловый эфир гипсогеновой кислоты (схема З.б). XXX. 23,28-диокси-8-амирин (схема 3.7). XXXI. Гекса-О-метиловый эфир глюкуронопиранозида гипсоге- новой кислоты (схема 3.6, рис.3,4). ХХХП. 23,28-ди-0 метиловый эфир гипсогеновой кислоты (схема З.б). ХХХШ. Салсолозид С (схема 4.1). XXXIV. Салсолозид D (схема 4.1). XXXV. Прогенин щелочного омыления салсолозида С (схема 4.1). XXXVI. Прогенин щелочного омыления салсолозида D (схема 4.1). ХХХУП. Дека-О-метиловый эфир салсолозида С (схема 4.2). ХХХУШ. Ундека-О-метиловый эфир салсолозида D (схема 4.2). XXXIX. Гепта-О-метиловый эфир прогенина ХХХУ (схема 4.2). X L. Окта-0-метиловый эфир прогенина ХХХУІ (схема 4.2). X LI. Метиловый эфир олеаноловой кислоты (схема 4.1). X ЬП. Салсолозид Е (схема 4.3). X ЬШ. Прогенин щелочного омыления салсолозида Е (схема 4.3). X ЬІУ. Перметилат прогенина хып (рис.4.2). X ЬУ. Перметилат салсолозида Е (рис.4.3). X ІіУІ. Прогенин частичного гидролиза триозида хып (схема 4.3.). X ьуп. Нона-О-метиловый эфир прогенина ХЬУІ (рис.4.4). 4.6. Биологическая активность коптерозидов и салсолозидов Сумма гликозидов из ciimacoptera transoxana и индивидуальное вещество коптерозид D испытывались в Биологическом научно-исследовательском институте Ленинградского Государственного Университета в качестве стимулятора репродукции насекомых(к.б.н. СИ.Черныш, В.А.Лухтанов, Н.П.Симоненко).
Сумма гликозидов под обобщающим названием "коптерозид" испытывалась на плодовитость комнатной мухи Musca domestica . Как известно, для переработки отходов животноводства в отдельных хозяйствах личинки мухи выращивают на навозе, а затем употребляют как корм для свиней. Поэтому контролируемое увеличение плодовитости мух имеет народнохозяйственное значение. Опыты показали, что самки, получившие коптерозид, за первые двое суток отложили в два раза больше яиц, чем контрольные. Увеличение концентрации с 10 мг/л до 100 мг/л существенного повышения плодовитости не показало. Испытание индивидуального коптерозида ц дало такие же результаты. Суммарный препарат "коптерозид" испытывался также на плодовитость Капустной СОВКИ - Barathra brassicae . Это насекомое используется на биофабриках для наработки вирусных препаратов, предназначенных для борьбы с вредными насекомыми, поэтому увеличение ее продуктивности представляет существенный интерес для производства. Превышение над контролем в опытах с капустной совкой составляло примерно 70% итоговой плодовитости самок, причем минимальная концентрация I мг/л давала такой же эффект, как и концентрация 100 мг/л. Выявлена также геропротекторная активность коптерозидов. Под влиянием этих веществ продолжительность жизниимаго возрастала на 20-30% (приложение № I). Фармакологические испытания, проведенные в лаборатории фармакологии и химиотерапии ИХРВ АН УзССР показали, что суммарные препараты "коптерозид" и "салсолозид" малотоксичны и обладают тонизирующим действием (приложение № 2). 5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 5.1. Общие сведения Очистку и разделение гликовидов, генинов и их производных проводили на колонках с силикагелем марки КСК (размер частиц 65-100 ммк), а в некоторых случаях на сефадексе G -10. Выходы экстрактивных веществ и гликозидов даны в процентах на воздушно-сухой вес растения. Хроматографирование проводили на бумаге марки "С", в тонких слоях силикагелей КСК и "Силуфоле" марки uv -254 (ЧССР). Свободные моносахариды хроматографировали на пластинках с силикагелем, импрегнированным 0,3 М раствором дигидрофосфата натрия. В работе применялись следующие системы растворителей: I) бутанол-1 - этанол - 25%-ный аммиак (7:2:5), 2) то же (10:2: 5), 3) хлороформ - метанол - вода (65:35:8), 4) то же (76:27:6), 5) то же (35:15:3), 6) хлороформ - метанол (50:1), 7) то же (20:1), 8) то же (15:3), 9) то же (9:1), 10) то же (2:1), II) хлороформ - этанол (25:1), 12) бутанол-1 - уксусная кисло та - вода (4:1:5), 13) бутанол-1 - метанол- вода (5:3:1), 14) бензол- ацетон (2:1), 15) то же (10:1), 16) то же (10:2). Гликозиды и генины обнаруживали 25 -ным метанольным раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты; сахара О-толуидинсалицила-том.
Во всех случаях хроматограммы нагревали при температуре 120 в течение 10-15 минут. Температуры плавления даны без поправки на выступающий столбик ртути. Все гликозиды и их прогенины плавятся с разложением. Удельное вращение определяли на поляриметре "Цейс" в трубке длиной 0,5 дм. Вещества для анализа сушили в вакууме при температуре кипения толуола или бензола. Газожидкостную хроматографию силилированных О-метилглико-зидов проводили на хроматографе "Хром-5" на колонке размером 3,7 м х 3 мм, содержащей 5% силиконовой фазы SE-30 на хромато-не, и на колонке размером 1,27 м х 3 мм, содержащей ZUfo термо-ла-2 на хроматоне Н-м . Температура колонок 190-200, газ-носитель - гелий, скорость газа 40-50 мл/мин. ГйХ метилгликозидов метилированных Сахаров проводили также на хроматографе "Хром-5" на колонке размером I м х 3 мм с целитом, содержащим 10% 1,4-полибутандиолсукцината. Температура 160, скорость гелия 50 мл/мин. ЙК-спектры снимали на приборе UR -20 в таблетках КВг, вазелиновом масле или в нуйоле; спектры ПМР - на приборе лш -4Н-І00 (100 мГц) с ГМДС в качестве внутреннего стандарта . сГ-шкала, м.д.; масс-спектры на приборе MX-I3I0 при ионизирующем напряжении 50 В и температуре 130-200. Полнота метилирования во всех случаях контролировалась по исчезновению на ЙК-спектре полос поглощения гидроксильных групп, а также масс-спектрометрией. Чтобы избежать деструкции, растворы гликозидов и их производных упаривали в роторном испарителе при температуре 40-45. Воздушно-сухое сырье (1,1 кг) три раза экстрагировали хлороформом, а после высушивания от растворителя исчерпывающе горячим метанолом. Упаренный метанольный экстракт (выход суммы экстрактивных веществ 28%) растворили віл воды и извлекли н-бутиловым спиртом (10 х 200 мл). Бутанольное извлечение упарили досуха, сухой остаток (28,5 г или 2,6%)растворили в метаноле с добавлением небольшого количества воды и гликозиды осадили ацетоном. Выход очищенной суммы 23 г.
Тритерпеновые гликозиды Salsola micranthera
Воздушно-сухое сырье (листья, стебли, цветы и семена - 1,7 кг) три раза экстрагировали хлороформом, а затем пять раз горячим метанолом. Упаренный метанольный экстракт растворили віл воды и извлекли н-бутиловым спиртом (10x200 мл). Бутанольное извлечение упарили досуха. Сухой остаток (40 г, выход 2,35%) растворили в метаноле и гликозиды осадили ацетоном. Очищенную таким образом сумму гликозидов (35 г) внесли в колонку с силикагелем. Элюировали системой 4. Контроль вели на ТСХ в системах 1-3. Получили фракции, состоящие из смеси соединений: АВ, ВС , CD, DE, Е, EPG (рис.5.3.1). После рехроматографирования на колонках с .силикагелем в системах 4- и 3 поочередно фракций, содержащих гликозиды Си D, выделили индивидуальные вещества. Выход салсолозида С составил 0,21%, салсолозида D 0,44%. Фракции, содержащие индивидуальный гликозид Е, очистили на колонке с силикагелем, элюируя метанолом. Выход 1,1%. 5.3.2. Салсолозид С (схема 4.1) Салсолозид С СХХХШ), C H Ojg, т.пл. 214-220, [U] 20 + 16+3 (с 1,0; метанол). Олеаноловая кислота (ХП) и З-0-ff -р -глюкуронопиранозид олеаноловой кислоты (ХШ) из салсолозида С (ХХХ1Ю. Гликозид С (105 мг) гидролизовали 6%-ным раствором серной кислоты б ч при 95. После разделения продуктов реакции на колонке с силикагелем в системе б выделили 22 мг олеаноловой кислоты (ХП), которую идентифицировали по физико-химическим константам и с помощью ТСХ (система 7) с заведомым образцом. Гликозид С (200 мг) в 30 мл 1%-ной серной кислоты нагревали 3 часа при 100. После соответствующей обработки колоночной хроматографией в системе 4 выделили 40 мг вещества ХШ, которое идентифицировали с образцом глюкуронопиранозида олеаноловой кислоты /26/. Щелочной гидролиз салсолозида С (XXX1IQ. Гликозид С (ХХХШ, 220 мг) омыляли 8%-ным раствором КОН (20 мл) в течение 5 ч при нагревании. После нейтрализации разбавленной серной кислотой, реакционную смесь экстрагировали бутанолом. Бутанольное извлечение промыли водой, упарили. Сухой остаток хроматографировали на колонке с силикагелем.
Получили 75 мг биозида олеаноловой кислоты ХХХУ, С41Нб4013, т.пл.210-2140 (из этанола), ft/J + 18+2 с 1,0; метанол). Кислотный гидролиз биозида ХХХУ привел к получению D -глюкуроновой кислоты и D-КСИЛОЗЫ. (TGX, система 13). Перметилат ХХХУП из салсолозида С (ХХХШ). Гликозид ХХХШ (300 мг) растворили в 40 мл диметилсульфоксида. В раствор небольшими порциями в течение одного часа, при непрерывном перемешивании, добавили 300 мг гидрида натрия. Реакция велась при комнатной температуре. Затем прилили по каплям 5 мл йодистого метила и смесь перемешивали еще 3 часа. После соответствующей обработки остаток хроматографировали на колонке, элюируя бензолом. Получили 210 мг аморфного перметилата ХХХУП, С57Н94018 [otj + 10+2 (с 1,1; метанол). Масс-спектр, m/z (%): М+ 1066 (0,3), 802 (15,8), 656 (2,9), 393 (23,7), 248 (36,8), 219 (31,5), 175 (100,0). Спектр ПМР ( CDCi3 , сГ , м.д.): 4,28 (аномерный протон, д, J= 7,5 Гц); 4,63(аномерный протон, д, J= 7,5 Гц); 5,23 (Н-при G-I2, м); 5,26 (аномерный протон, д, J= 7,5 Гц) (рис.4.1 ). Кроме основного выделили побочный продукт метилирования XXXIX (50 мг), С 8Н78013, cCj 20 + 7,5+2 (с 0,8; метанол). Масс-спектр, т/г {%); М+ 862 (0,3), 671 (0,22), 453 (52,2), 393 (17,4), 262 (47,8), 175 (100) (схема 4.2). Перметилат XXXIX (40 мг) гидролизовали в 10 мл б%—ной серной кислотой в метаноле (5 ч при 70}. Обнаружили метиловый эфир оле-аноловой кислоты (XLI) (TGX, система 7), 2,3,4-три-О-метил- D -ксилозу и 2,3-ди-0-метил- D-глюкуроновую кислоту (ТСХ, система 8). Восстановительное расщепление перметилата ХХХУП. Соединение ХХХУП (180 мг) восстановили алюмогидридом лития (160 мг) по обычной методике. Продукт реакции гидролизовали 6 -ной серной кислотой в метаноле. В качестве генина идентифицировали эритродиол (XX). В фильтрате, после соответствующей обработки, на ТСХ в системах 8 и 14 в присутствии подлинных образцов_идентифицировали 2,3,4-три-0-метил- D-ксилозу, 2,3,4,6-шетра-0-метил- D-сорбит, 2,З-ди-0-метил- D-глюкозу. Последнее соединение не реагировало с реактивом Боннера. Перйодатное окисление салсолозида С (ХХХШ). Гликозид ХХХШ (50 мг) окислили перйодатом натрия (1%-ный раствор.-, 20 мл) 48 часов. В реакционную смесь добавили несколько капель этиленглико-ля, а затем продукт реакции гидролизовали 6%-ной серной кислотой. В нейтрализованном гидролиза те свободные моносахариды не обнаружили. 5.3.3. Салсолозид D С схема 4.1) Салсолозид D (ХХХІУ), С47Н?4019, т.пл. 228-230, f /J + 18,6+3 (с 1,2; метанол). Хедерагенин (I) и 3-0-В - D-глюкуронопиранозид хедерагени-на (П) из салсолозида D (ХХХІУ). 120 мг гликозида D (ХХХІУ) гидролизовали серной кислотой в условиях, описанных для салсолозида 0 (ХХХШ). Получили 42 мг хедерагенина (І). В гидролизате обнаружили D-глюкуроновую кислоту, D-глюкозу и D-ксилозу (ТСХ, система 13). При гидролизе 350 мг салсолозида D (ХХХІУ) I/э-ной HpSO в течение б ч получили 87 мг З-0-б - D-глюкуроно-пиранозида хедерагенина (П). Щелочной гидролиз салсолозида D (ХХХІУ). Гликозид ХХХІУ (152 мг) гидролизовали 8%-вът раствором КОН 5 ч при 100. Получили 117 мг биозида хедерагенина ХХХУІ, CzfAA т,ши 222-224 (из этанола), d] г0 + 17,0+2 (с 1,3; метанол). Кислотный гидролиз биозида ХХХУІ дал хедерагенин (І), D-глюкуроновую кислоту И D-КСИЛОЗу.
Перметилат ХХХУШ из салсолозида р (ХХХІУ). Гликозид ХХХІУ (400 мг) метилировали при условиях, указанных для салсолозида С (ХХХШ). Получили 290 мг перметилата ХХХШН Н О- , {ctj 20 + 9+3 (с 1,1; метанол). Масс-спектр, m/z (%): М+ 1096 (0,13), 832 (20,0), 686 (2,7), 393 (15,3), 248 (13,3),219 (16,7), 187 (100,0), 175 (86,7) (схема 4.2). ПМР-спектр ( CDCl ,cf, м.д.): 4,17 (аномерный протон, д, J= 7,5 Гц); 4,61 (аномерный протон, д, J= 7,5 Гц); 5,20 (Н при G-I2, м); 5,32 (аномерный протон, д, J ="?,5 Гц). Побочный продукт метилирования XL (42 мг) СлпНопОул, /bLJ 20 + 13+2 (с 0,8; метанол). Масс-спектр, m /z (%): М+ 892 (0,7), 701 (0,5), 483 (72,8), 393 (12,5), 262 (100,0), 175 (75,0) (схема 4.2). Кислотный гидролиз перметилата Хь привел к получению 2,3,4-три-О-метил-Б -ксилозы и 2,3-ди-0-метил-Б -глюкуроновой кислоты (ТСХ, система 8). В качестве генина обнаружили метиловый эфир 23-метилхедерагенина (УІ). Восстановительное расщепление перметилата ХХХУШ. Перметилат ХХХУШ (200 мг) восстановили алюмогидридом лития (200 мг). В продуктах расщепления в качестве генина обнаружили 23-метокси-28-окси-В -амирин (XXI). Метилированными углеводами оказались 2,3,4-три-О-метил- D-ксилоза, 2,3,4,6-тетра-О-метилЧ) - сорбит и 2,3-ди-0-метил- D-глюкоза (ТСХ, системы 8 и 14). Перйодатное окисление салсолозида D (ХХХІЛ. 100 мг глико-зида ХХХІУ окислили в 30 мл 1%-ного раствора периодата натрия. После гидролиза среди продуктов окисления свободные сахара не обнаружены. 5.3.4. Салсолозид Е (схема 4.3) Салсолозид Е (X ЬП), С53Н8423 т#ПЛв 22Zf 226 (из водного ацетона), foij 20 + 19+2 (с 0,8; водный метанол). Кислотный и щелочной гидролиз салсолозида Е (XL П). Глико-зид ХЬП (50 мг) гидролизовали 6%-ной серной кислотой 4 ч при 100. Выпавший осадок отделили, промыли несколько раз водой. На ТСХ в системе II идентифицировали олеаноловую кислоту (ХП). Фильтрат нейтрализовали карбонатом бария и упарили. В остатке методами БХ (система 12) и ТСХ (система 13) обнаружили D -глюкозу, D-глюкуроновую кислоту и D -ксилозу. Соотношение Сахаров по данным ГЖХ - 1,0:0,39:0,45. Омыляли 1,9 г гликозида Е (ХЬ П) 8%-ным раствором КОН при 100 5 ч. Реакционную смесь нейтрализовали разбавленным раствором серной кислоты, продукт реакции извлекли я.бутиловым спиртом, Бутанольный экстракт промыли водой, упарили досуха. Остаток внесли в колонку с силикателем. Элюируя системой 5 выделили 1,4 г тригликозида ХЬШ, C Hr Ojg, т.пл. 192-196 (из водного ацетона), foCJ 2 + 15+2 (с 0,8; МеОН).
